全 文 ：第 32卷　第 2期 林　业　科　技 Vo l. 32　No. 2
2 0 0 7年 3月 FORESTRY SC IENCE＆ TECHNOLOGY M ar. 　 2 0 0 7
文章编号:1001 -9499 (2007) 02 - 0020 -07
绒白乳菇 rDNA ITS序列鉴定及生物学特性研究*
计红芳 1　宋瑞清 1, 2** 　杨　谦 1
(1.哈尔滨工业大学生命科学与工程系 , 黑龙江　哈尔滨　 150001;
2.东北林业大学林学院 , 黑龙江　哈尔滨　150040)
摘要:首次应用通用引物 ITS1与 ITS4从绒白乳菇中扩增出 rDNA ITS序列 (登录号为 DQ011144)。 通过
GenBank中 BLAST, 本菌株与 Lactarius ve llereus (AY606958) 相似率最高 , 为 96%, 命名为 Lactarius vellereus rb。
生物学特性研究表明:绒白乳菇能够利用的碳源种类较为广泛 , 对甘露醇 、 琥珀酸利用效果较好 , 对山梨糖利
用效果最差;供试氮源中 , 对甘氨酸利用效果最好 , 对谷氨酸利用能力最差 , 无机氮源中对硝态氮的利用优于
铵态氮;无机盐是绒白乳菇生长的必需因子 , 烟酸促进生长效果较为显著 , VB1次之 , 叶酸稍微促进 , VB6抑制
其生长;菌丝体生长 pH范围为 4 ～ 9, 生长的温度范围为 10 ～ 30 ℃, 最适温度为 25 ℃;培养基的较优组合为
(1 L):琥珀酸浓度 2%、 甘氨酸浓度 0. 15%、 无机盐溶液 20 m l、 烟酸 100 mg、 pH为 6。
关键词:绒白乳菇; ITS序列;生物学特性
中图分类号:Q 936　　　　文献标识码:A
　　乳菇属 (Lactarius)真菌的传统分类方法大
多是依据其形态学 、 生理学 、组织学 、 解剖学等
特征 , 致使属内种的划分存在较大的争议 。近年
来 , 利用 PCR扩增真菌核糖体 DNA 内的 ITS
(Inte rnal transcribed spacer)基因区段进行真菌鉴
定技术得到了迅猛发展。真菌 rDNA的 ITS区段既
具保守性 , 又在科 、 属 、 种水平上均有特异性序
列 , 且进化速率较快 , 已被广泛用于生物种内变
异和种间 、 近源属间的分子系统学研究 [ 1] 。本文
利用 rDNA ITS 序 列对 绒 白乳 菇 (Lactarius
vellereus)进行分类鉴定 , 阐明其系统发育过程 。
同时 , 鉴于对绒白乳菇生物学特性研究未见报道 ,
还就其生物学特性进行了详尽的研究 , 旨在为研
究开发微生物农药奠定科学的理论基础。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　菌株
绒白 乳 菇 及 杨 树 叶 枯 病 菌 (Alternaria
alternata)菌株均由东北林业大学提供。
1.1.2　培养基
(1 ) 马 铃 薯 200 g, 葡 萄 糖 20 g,
MgSO 41.5g, NaH2 PO 4 3g, 琼脂 20g, 水 1 000 m l;
(2)马铃薯 200 g, 蔗糖 20 g, MgSO 4 1.5 g,
N aH2PO4 3g, 琼脂 20 g, 水 1 000 m l;
(3)在 (1)基础上加入 20 g杨树叶;
(4)在 (1)基础上加入 20 g松针;
(5)马铃薯 200 g, 葡萄糖 20 g, 酵母膏 2 g,
蛋 白 胨 2 g, MgSO4 0.5g, KH2 PO 41.5g, VB1
100mg, 水 1 000 m l;
(6)葡萄糖 30 g, 牛肉膏 10 g, M gSO4 5g,
KH2 PO 4 5g, N aC l 5g, VB1 25mg;
(7)蔗糖 20 g, (NH4)2 SO 41g, MgSO4 0.5g,
K 2HPO 4 0.4g, K2 SO4 0.1 g, CaC l2 0.05 g,
Fe (NO 3)20.02 g, 琼脂 20 g, 水 1 000m l;
(8) PDA培养基:马铃薯 200 g, 葡萄糖
20 g, MgSO4 1.5g, N aH 2PO4 3g, 琼脂 20 g, 水
* 国家自然科学基金资助项目 (30271083)
第 2期 计红芳等:绒白乳菇 rDNA ITS序列鉴定及生物学特性研究
1 000 m l, pH自然为 5.96;
(9)碳源试验基础培养基:各种碳源 20 g,
酵 母 膏 0.5 g, 蛋 白 胨 0.5 g, MgSO 4 1.5g,
N aH 2PO4 3g, 琼脂 20 g, 水 1 000 m l, pH为 6.0;
(10)氮源试验基础培养基:葡萄糖 20 g, 各
种氮源 1 g, MgSO 41.5 g, N aH 2PO4 3g, 琼脂 20 g,
水 1 000 m l, pH为 6.0;
(11)无机盐试验基础培养基:① 琥珀酸
20 g, 甘氨酸 1 g, 琼脂 20 g, 水 1 000m l, pH为
6.0;②甘露醇 20 g, 甘氨酸 1 g, 琼脂 20 g, 水
1 000 m l, pH为 6.0;
无机盐溶液组成:KH2 PO4 1g, K2HPO4 1g,
M gSO4 0.5g, CaC l2 0.05g, KC l 0.5g, FeSO 4 0.01
g, NaNO3 0.5 g, 蒸馏水 1 000 m l;
(12)生长因子试验基础培养基:琥珀酸
20g, 甘氨酸 1 g, 无机盐溶液 2 m l, 生长因子
100mg, 琼脂 20 g, 水 1 000 m l, pH为 6.0。
1.2　试验方法
1.2.1　绒白乳菇 DNA提取
取 50mg新鲜的菌丝体 , 加液氮研磨成粉末
状 , 采用 CTAB法提取 DNA[ 7] , 用 B io Photome te r
(Eppendorf AG 22331 H ambu rg ) 测 定 浓 度 ,
- 20 ℃保存备用 。
1.2.2　 rDNA ITS序列的 PCR扩增 、测序及分析
应用通用引物进行 rDNA ITS 序列扩增 ,
ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′;
ITS4: 5′ - TCCTCCGCTTATTGATATGC -
3′[ 8] , 引物由大连宝生物有限公司合成。
PCR反应在 PTC - 200上进行扩增 , 50 μl的
反应体系内含:模板 40 ng, TagDNA聚合酶 (大
连宝生物 ) 终浓度为 0.4 U , 4 种 dNTP 各
0.3mmo l L -1 , 引物各 0.1 μmo l L - 1;扩增程
序为:94 ℃预热 5m in, 94℃变性 30 s, 58 ℃复
性 45 s, 72 ℃延伸 90 s, 循环 30次 , 最后 72 ℃
延伸 10 m in。 PCR扩增产物用 1.0%的琼脂糖
(含 0.5 μg mL -1 EB)电泳 , 在 UVP凝胶成像系
统下成像保存。用胶回收试剂盒 (Agaro se G e l
DNA Purification K itVe r.2.0 , 宝泰克)切胶回收 ,
然后与 pGEM - T (Promega)载体连接 , 转化到大
肠杆菌 TOP10感受态细胞 (天为时代 )。 LB固体
培养基中加入氨苄青霉素 Amp (5μg /m l)和 X -
gal, 蓝白斑筛选转化子 。提取质粒 (Plasm idM ini
K it, 华 舜 ), 用 载 体 引 物 T7 5 -
TAATACGACTCACTATAGGG - 3′和 SP6 5′-
ATTTAGGTGACACTATAGAAT - 3′检测。测序由上
海生物工程有限公司完成 。
将测得的 ITS序列在 GenBank进行 BLAST,
对获得的同源序列进行序列分析 。用 B ioEdit v
5.06进行多序列比对 , 采用 MEGA Version 2. 1
软件中的 UPGMA法构建进化树 。
1.2.3　绒白乳菇生物学特性的研究
1.2.3.1　不同培养基及 pH值对菌丝体生长的影
响
菌丝体生长试验均采用生长速率法 [ 9, 10] (以
下同)。将直径 0.5 cm的绒白乳菇菌片分别接种
在培养基 (1)至培养基 (7)上 , 每种培养基分
别设 pH 值梯度为 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10, 于
25℃培养 。 20天后以十字交叉法测量菌落直径 ,
以接种在培养基 (8)上的绒白乳菇菌片生长直
径为对照 , 每处理设 3个重复 , 试验重复 3次 。
1.2.3.2　碳源对菌丝体生长的影响试验
选用培养基 (9), 分别以苯甲酸 、乙酸 、 丙
酸 、甘露醇 、琥珀酸 、果糖 、乳酸 、 蔗糖 、 乳糖 、
木聚糖 、山梨醇 、甘油 、 柠檬酸 、 半乳糖 、 葡萄
糖 、淀粉 、 麦芽糖 、草酸 、山梨糖为碳源制作平
板培养基 , 切取直径 0.5cm的绒白乳菇菌片分别
接种在上述平板培养基上 , 试验方法同 1.2.3.1。
1.2.3.3　氮源对菌丝体生长的影响试验
选用培养基 (10), 分别以甘氨酸 、 赖氨酸 、
硝酸钙 、 蛋白胨 、 天冬氨酸 、 白氨酸 、 酵母膏 、
乙酸铵 、氯化铵 、色氨酸 、 硫酸铵 、 尿素 、 半光
氨酸 、 硝酸铵 、 苯丙氨酸 、 草酸铵 、 钼酸铵 、 酒
石酸铵 、谷氨酸为氮源制作平板培养基 , 切取直
径为 0.5cm的绒白乳菇菌片分别接种在上述平板
培养基上 , 试验方法同 1.2.3.1。
1.2.3.4　无机盐对菌丝体生长的影响试验
选用筛选出的最佳碳 、 氮源制作培养基 (即
培养基 11), 将无机盐溶液分别以 1 000 mL培养
基中加入 20 , 40 , 60 , 80 , 100 m l的量加入 ,
制成平板培养基 , 切取直径为 0.5 cm的绒白乳菇
21
林　业　科　技 第 32卷
菌片分别接种在上述平板培养基上 , 试验方法同
1.2.3.1。
1.2.3.5　生长因子对菌丝体生长的影响试验
生长因子选择叶酸 、 烟酸 、 VB1、 VB6及各种
组合 , 以 1 000m l培养基 (12)中 100 mg的水平
加入 , 切取直径为 0.5 cm的绒白乳菇菌片分别接
种在上述平板培养基上 , 试验方法同 1.2.3.1。
1.2.3.6　培养基优化
以琥珀酸 、甘氨酸、无机盐溶液 、 pH为主要因
素 , 各取 3个水平进行 L9 (34)正交试验 (表 1)。
表 1　培养基配方正交试验因素水平
水　平 因　　素琥珀酸 (%) 甘氨酸 (%) 无机盐 (m l /L) pH
1 1 0. 05 20 5
2 2 0. 10 40 6
3 3 0. 15 60 7
1.2.3.7　温度对菌丝体生长的影响试验
将直径为 0.5 cm的绒白乳菇菌片接种在优化
的培养基上 , 分别置于 10 , 15, 20, 25 , 30,
35℃的恒温箱中 , 试验方法同 1.2.3.1。
2　结果与分析
2.1　 ITS序列扩增及分析
2.1.1　扩增产物分析
用引物 ITS1和 ITS4从绒白乳菇扩增出的目的
片段为 697bp, 其中 1 ～ 27bp为 18S rRNA部分序
列 , 27 ～ 250bp为 ITS1, 251 ～ 397bp 为 5.8S
rRNA , 398 ～ 673bp为 ITS2, 674 ～ 697 28S rRNA
部分序列 (图 1、 图 2)。 G enBank 登陆号为
DQ011144。
图 1　绒白乳菇 rDNA ITS序列
22
第 2期 计红芳等:绒白乳菇 rDNA ITS序列鉴定及生物学特性研究
图 2　绒白乳菇 rDNA ITS区段的 PCR产物
(M -DNA M arke rDL, 2000)
2.1.2　系统发育分析
从 GenBank核酸序列数据库进行比对 , 获得
相似率较高 、亲源关系相近的物种 , 特别是乳菇
属内已知不同种的 ITS序列 , 考察其中的系统发
育关系 。用 ITS1+5.8S +ITS2序列构建的进化
树与用 ITS1、 ITS1 +5.8S、 5.8S + ITS2、 ITS2、
ITS1+ ITS2序列构建的基本一致 , 用 5.8S序列
构建的进化树的结果差异很大 , 因此采用 UPGMA
法对 ITS区域 (ITS1+5.8S +ITS2)构建系统进
化树。
图 3的聚类结果表明 , 该属内明显存在一定
的遗传分化 , 在遗传距离 175处可以划分为两个
类群 (种 ), 类群 (种 ) Ⅰ 包 括 L. volenus
( AF506414 )、 L. scoticus ( AY336957 )、
Ltesquorum (AY336955)、L.controversus(LCO272244);
类群 (种) Ⅱ是除类群 (种) Ⅰ以外的其他种 。
Lactarius vellereus JI位于类群 (种 ) Ⅱ中 , 与 L.
vellereus (AY606958)相似率最高 , 为 96%, 聚
类为同种;与亲源关系最远的 L. con troversus
(LCO272244)相似率最低 , 为 83%, 为同属不同
种 。
图 3　用乳菇属内 ITS序列构建的 UPGMA
系统发育树 (Alternaria alternata为外群)
2.2　绒白乳菇生物学特性研究
2.2.1　不同培养基及 pH值对菌丝体生长的影响
绒白乳菇在供试的各种培养基上 , pH 4 ～ 9
时均可生长 , pH为 10时不能生长 。当 pH 为 6
时 , 生长直径在 7种培养基上生长直径均为最大 。
在培养基 (1)、 (2)、 (6)上均生长最好 , 彼此
间无显著差异 , 与其它培养基上的生长直径相比
差异显著 , 因此选择 pH为 6的培养基 (1)为以
下试验所用的基础培养基 (表 2)。
表 2　绒白乳菇在不同培养基 、 不同 pH条件下生长 20天菌落直径 cm
培养基 4 5 6 7 8 9 10
(1) 2. 30A 3. 95B 4.09 CDa 4.06Da 3. 46E 2. 16F 0.50G
(2) 2. 50A 4. 00BCD 4. 07CDa 4.06Da 3. 70E 2. 38F 0.50G
(3) 2. 70A 3. 93BCD 4. 00CDbcd 3.96Da 3. 55E 2. 46F 0.50G
(4) 2. 43A 3. 89B 3. 97CDcde 3.94Da 3. 64E 2. 23F 0.50G
(5) 2. 61A 3. 98BCD 4.01CDd 4.00Da 3. 49E 2. 29F 0.50G
(6) 2. 58A 4. 05BCDE 4.10CDEa 4. 09DEa 3. 94E 2. 63A 0. 50F
(7) 2. 80A 3. 89BCD 3. 93CDe 3.91Da 2. 21E 0. 50FG 0.50G
　注:大写字母表示为不同 pH间差异 (P<0. 05), 小写字母表示为不同培养基间差异 (P<0. 05)
2.2.2　碳源对菌丝体生长的影响
绒白乳菇菌丝体生长能利用的碳源种类较为广
泛 (表 3)。在以甘露醇 、琥珀酸为碳源的培养基上
生长 20天 , 菌落直径分别达 5.22 cm、 5.10 cm , 方
差分析结果表明 , 二者间差异不显著;对山梨糖的
利用能力最差 , 20天菌落直径仅为 1.50cm;绒白乳
菇菌丝体生长不能利用苯甲酸 、乙酸 、丙酸 , 而能
利用乳酸 、柠檬酸 、草酸等有机酸。
23
林　业　科　技 第 32卷
表 3　不同碳源下绒白乳菇生长 20天菌落直径 cm
种类 菌落直径 种类 菌落直径 种类 菌落直径 种类 菌落直径
苯甲酸 0. 50b 琥珀酸 5. 10bABC 木聚糖 4. 43b 葡萄糖 4. 0aFG
乙酸 0. 50b 果糖 4. 90bBCD 山梨醇 4. 35b 淀粉 3.95 a
丙酸 0. 50b 乳酸 4.83bCD 甘油 4. 30b 麦芽糖 3. 92aG
PDA (ck) 3. 88a 蔗糖 4. 68bD 柠檬酸 4. 20b 草酸 3.17bH
甘露醇 5. 22bA 乳糖 4.65b 半乳糖 4. 18bEFG 山梨糖 1. 50bI
　注:小写字母表示为与对照比较 (P<0. 05);大写字母表示为与对照差异显著的个别碳源间比较 (P<0.05)
2.2.3　氮源对绒白乳菇菌丝体生长的影响
绒白乳菇能较好地利用各种有机氮源与无机
氮源。在供试氮源中 , 最佳的氮源是甘氨酸 , 在
以甘氨酸为氮源的培养基上生长 20天 , 菌落直径
为 4.33 cm;其次为赖氨酸 , 在以赖氨酸为氮源的
培养基上生长 20天 , 菌落直径为 4.15 cm , 方差
分析结果表明 , 二者间差异显著;利用最差的氮
源为谷氨酸 , 生长 20天菌落直径为 2.43 cm;在
无机氮源中 , 对硝态氮的利用优于铵态氮 (表
4)。
表 4　不同氮源下绒白乳菇生长 20天菌落生长直径 cm
种类 菌落直径 种类 菌落直径 种类 菌落直径 种类 菌落直径
甘氨酸 4. 33bA 天冬氨酸 3.88b 色氨酸 3. 72b 苯丙氨酸 3. 25b
敕氨酸 4. 15bB 白氨酸 3.75b 硫酸铵 3. 67b 草酸铵 3. 22b
PDA (ck) 3. 97a 酵母膏 3.73b 尿素 3. 67b 钼酸铵 3. 15b
硝酸钙 3. 92b 乙酸铵 3.72b 半光氨酸 3. 53b 酒石酸铵 3. 13bD
蛋白胨 3. 92b 氯化铵 2.93b 硝酸铵 3. 32b 谷氨酸 2. 43bE
　注:小写字母表示为与对照比较 (P<0. 05);大写字母表示为与对照差异显著的个别氮源间比较 (P<0.05)
2.2.4　无机盐对菌丝体生长的影响
以琥珀酸为碳源 , 在分别以 20 m l /L与 40
m l /L的比例加入无机盐溶液时 , 绒白乳菇的长势
均好 , 前者生长 20天菌落直径为 4.23 cm , 后者
直径为 4.27 cm , 二者差异不显著;以甘露醇为碳
源 , 以 40m l /L比例加入无机盐 , 生长 20天菌落
直径为 4.03 cm , 与以上二者差异显著;在分别以
琥珀酸与甘露醇为碳源 , 不加入无机盐时 , 绒白
乳菇生长缓慢 , 表明无机盐是绒白乳菇生长的必
需因子 , 而加入原盐 , 即加入与 PDA培养基中等
量的 MgSO 4与 N aH 2PO4时 , 绒白乳菇的菌落直径
却不及加入以 40 m l /L无机盐溶液的直径大 , 差
异均显著 , 表明浓度为 40m l /L的无机盐溶液更适
合于绒白乳菇的生长 (表 5)。
表 5　不同无机盐下绒白乳菇生长 20天菌落直径 cm
无机盐浓度
(琥珀酸为碳源) 菌落直径
无机盐浓度
(甘露醇为碳源) 菌落直径 其它处理 菌落直径
20 4. 23bA 20 3.93b 琥珀酸原盐 3. 43bE
40 4. 27bA 40 4. 03bC 琥珀酸 2. 92bFH
60 3.97bBC 60 3.87b 甘露醇原盐 3. 57bG
80 3. 53b 80 3.40b 甘露醇 2.83bH
100 3. 43b 100 3. 28bD PDA (ck) 3.73 a
　注:小写字母表示为与对照比较 (P<0. 05);大写字母表示为与对照差异显著的个别无机盐处理间的比较 (P<0. 05)
2.2.5　生长因子对菌丝体生长的影响
各种生长因子及其组合对绒白乳菇生长的影
响较为复杂 。与对照培养基相比 , 烟酸对绒白乳
菇的促生长能力最强 , 生长 20天菌落直径可达
4.40 cm , VB1促进生长 , 叶酸稍微促进 , 而 VB6
却抑制其生长;各组合中 , VB1 +VB6 、 叶酸 +
VB1 +VB6的菌落直径分别为 4.28 cm、 4.27 cm ,
对绒白乳菇生长也具有促进作用 , 与单独加入烟
酸的菌落直径相比 , 差异均不显著;不加生长因
子时 , 生长 20天绒白乳菇菌落直径为 3.08 cm ,
小于对照的直径 , 差异显著 , 表明生长因子也是
绒白乳菇菌株生长必不可少的因子 , 考虑到加入
的复杂程度及成本 , 以烟酸为最佳生长因子 (表
6)。
24
第 2期 计红芳等:绒白乳菇 rDNA ITS序列鉴定及生物学特性研究
表 6　生长因子不同组合下绒白乳菇生长 20天菌落直径 cm
种类 菌落直径 种类 菌落直径 种类 菌落直径 种类 菌落直径
酵母膏 3. 23b Ⅳ 3. 10bBCD Ⅱ +Ⅳ 3. 03bCD Ⅱ +Ⅲ +Ⅳ 3. 87 a
蛋白胨 3. 82a Ⅰ +Ⅱ 4. 13b Ⅲ +Ⅳ 4.28bA Ⅰ +Ⅱ +Ⅲ +Ⅳ 3. 47b
Ⅰ 3. 87a Ⅰ +Ⅲ 3. 58b Ⅰ +Ⅱ +Ⅲ 3. 82a 空白 3.08bD
Ⅱ 4. 40bA Ⅰ +Ⅳ 3. 92 a Ⅰ +Ⅱ +Ⅳ 3. 73a PDA (ck) 3. 83 a
Ⅲ 4. 10b Ⅱ +Ⅲ 3. 60b Ⅰ +Ⅲ +Ⅳ 4.27bA
　注:小写字母表示为与对照比较 (P<0. 05);大写字母表示为与对照差异显著的个别生长因子间的比较 (P<0.05)
2.2.6　绒白乳菇生长培养基优化
根据以上单因素试验分析结果 , 选择琥珀酸
浓度 、 甘氨酸浓度 、 无机盐浓度 、 pH为主要影响
因素 , 采用 L9(34)正交表对以上因素进行正交试
验 , 试验结果及极差分析见表 7, 方差分析见
表 8。
表 7　培养基配方正交试验及其极差分析结果
试验号 琥珀酸 (%) 甘氨酸 (%) 无机盐 (m l /L) pH T1 T2 T3 T1 +T2 +T3
1 1 1 1 1 3.20 3. 70 3.65 10. 55
2 1 2 2 2 3.65 3. 65 4.00 11. 30
3 1 3 3 3 3.95 4. 00 3.95 11. 90
4 2 1 2 3 3.80 3. 50 3.65 10. 95
5 2 2 3 1 3.60 3. 50 3.80 10. 90
6 2 3 1 2 4.05 4. 05 4.10 12. 20
7 3 1 3 2 3.60 3. 70 3.50 10. 80
8 3 2 1 3 3.75 3. 20 3.85 10. 80
9 3 3 2 1 4.15 3. 90 4.05 12. 10
K 1 33. 75 32.30 33. 55 33. 55
K 2 34. 05 33.00 34. 35 34. 30
K 3 33. 70 36.20 33. 60 33. 65
K 1 11. 25 10.77 11. 18 11. 18
K 2 11. 35 11.00 11. 45 11. 43
K 3 11. 23 12.07 11. 20 11. 22
R 0. 017 1.300 0. 267 0. 250
　　极差分析结果表明 , 生长影响因子对绒白乳
菇生长的影响程度由大到小依次为:甘氨酸浓度 、
无机盐浓度 、 pH、 琥珀酸浓度 。方差分析结果表
明 , 只有甘氨酸浓度的影响极其显著 (F >F0.01),
而无机盐浓度 、 pH、 琥珀酸浓度的影响并不显
著 。结合表 7与表 8的分析结果 , 选择培养基的
较优组合为 (1 L):琥珀酸浓度 2%、 甘氨酸浓
度 0.15%、 无机盐 20 m l、 烟酸 100mg、 pH6。
表 8　培养基配方正交试验方差分析
变异
来源 自由度 平方和 均方 F F0.05 F0.01
区组间 2 0. 102 4 0.051 2 1. 568 3.63 6. 23
琥珀酸 2 0. 008 0 0.004 0 0. 122
甘氨酸 2 0. 960 7 0.480 4 14. 707**
无机盐 2 0. 044 6 0.022 3 0. 683
pH 2 0. 036 9 0.018 4 0. 564
误差 16 0. 522 6 0.032 7
总变异 26 1. 675 2
2.2.7　温度对绒白乳菇生长的影响
温度是影响菌丝体生长和代谢产物合成的重
要因素之一 。绒白乳菇在 10 ～ 30 ℃范围内均能生
长 , 25℃时生长最好 , 而超过 30 ℃培养基干裂 ,
菌丝干黄 , 不能生长并且慢慢死亡 (图 4)。
图 4　不同温度下绒白乳菇生长 20天菌落直径
25
林　业　科　技 第 32卷
3　讨　论
　　本试验首次克隆出绒白乳菇 rDNA ITS序列 ,
填补了国内空白 。乳菇属内的 5.8 S序列具有高
度的保守性 , 只有 34个碱基的差异 , 作为 “古老
生物时钟化石 ”, 对种属的划分具有重要的意义 。
应用特异性引物对乳菇属的真菌进行鉴定 , 具有
一定的科学性 、可靠性 、简便性 , 这无疑给真菌
研究者提供了一个可借鉴的方法 。绒白乳菇与松
乳菇 、 浓香乳菇 、红汁乳菇的生物学特性有所不
同 [ 6 ～ 14] , 遗传上的差异也成了绒白乳菇与其它乳
菇在生物学特性上的必然差异 。
参　考　文　献
[ 1] 　赵杰 . ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应
用 [ J] . 陕西农业科学 , 2004, (4):35 - 37.
[ 2] 　周国英 , 李倩茹 , 刘君昂 .松乳菇菌丝深层培养营养因子
及发酵条件研究 [ J] . 江西农业大学学报 , 2003, 25 (2):
246 - 249.
[ 3] 　林亲雄 , 陈京元 .碳源和氮源对松乳菇菌丝生长的影响
[ J] . 食用菌学报 , 2002, 9 (1):44 -46.
[ 4] 　周传云 , 廖兴华 , 谭周进等 .野生松乳菇菌种分离与培养
特性的研究 [ J] . 食品科学 , 2004, 25 (8):66 - 69.
[ 5] 　李文艺 .红汁乳菇菌丝生长营养特性的初步研究 [ J] . 山
西师范大学学报 (自然科学版), 2004, 18 (3): 72 - 75.
[ 6] 　马红梅 , 莫美华 .红汁乳菇液体深层发酵培养基的筛选
[ J] . 食用菌学报 , 2003, 10 (4): 34 - 37.
[ 7] 　邢晓科 , 郭顺星 .从 ITS序列探讨猪苓与其伴生菌的亲缘
关系 [ J] . 微生物学通报 , 2004, 31 (2):34 - 36 .
[ 8] 　Sep to - Schubert R, Bahnw egG , Nechw atal J, et al. Detection and
quan tif ication of Phytophthora speciesw hich areassociatedw ith root
- rot d iseases in Eu ropean deciduou s forests by species- specific
polym erase chain reaction. Eur J for Path, 1999, 29:169～ 188.
[ 9] 　王树桐 , 曹克强 , 胡同乐等 .对番茄灰霉病菌有抑菌活性
的丁香和细辛提取物提取条件研究 [ J] . 河北农业大学学
报 , 2004, 27 (1):69 - 72.
[ 10] 　项存悌 .林病研究法 [M ] . 哈尔滨:东北林业大学出版
社 , 1991.
[ 11] 　匡治州, 许杨 .核糖体 rDNA ITS序列在真菌学研究中的
应用 [ J] . 生命的化学 , 2004, 24 (2):120 - 122.
[ 12] 　陈应龙 , 弓明钦 , B ern ie Dell.分子生物学技术在菌根研究
中的应用及其进展 [ J] . 土壤与环境 , 1999, 8 (3):230
- 234.
[ 13] 　Eberhard t U;Verbeken A S equestrate Lactariu s species from
tropicalA frica:L. angiocarpu s sp. nov. and L. dolichocau lis
com b. nov. M ycological research. 2004, 108 (9):1042 -
1052.
[ 14] 　Sh im ono Y. , KatoM., Takam atsu S. M o lecu lar phy logeny of
Ru ssu laceae (B as id iom ycetes:Ru ssu la les) in ferred from th e
nucleotide sequ ences of nuclear large subunit rDNA.
Mycoscien ce. 2004, 45:303 -316.
　　第 1作者简介:计红芳 (1978 -), 女 , 博士研究生 ,
主要研究方向为环境生物技术。
**责任作者:宋瑞清 (1964 -), 女 , 教授 , 博士
生导师 , 主要从事菌物开发及利用 , 林木病理学及植物病
害防治等 。
收稿日期:2007 - 01 -18
The Research on rDNA ITS Sequences and B iolog ical
Characters ofLactarius ve llereus
JIHongfang
(Harbin Institu te of Technology, Heilongjiang　Harbin　150001)
Abstract　 rDNA ITS sequencew as amp lified from Lactarius vellereusw ith the universal primers ITS1 and
ITS4 for the first time ( the en try number is DQ011144) .The strain is clustered into the homogeneity
w ith Lactarius vellereus (AY606958), the homo logy of them is 96%, so named the strain as Lactarius
vellereus rb. Lactarius vellereus can use many carbon sources, in carbon source donors m annito l and
amber ac id a re the best, so rbin is the w orst. In nitrogen source dono rs g lycine is the best, g lu tam ic acid
is the w orst;and nitrate nitrogen is be tte r than am ine nitrogen in inorganic nitrogen. Inorganic sa lt is the
essen tial facto r for it;nicotinic acid is the best one for p romo ting Lactarius vellereus g row ing, VB1 is the
second, fo lic acid has little promo ting - effect and VB6 has inhibiting - e ffec t. Lactarius vellereus can
grow under pH 4 ～ 9, temperature 10 ～ 30℃;the optim al pH fo r is 6, the optim al temperature is 25 ℃.
The be tte r components o f culture medium (1 000 m l) is as fo llow:amber acid 2%, g lycine 0.15%,
inorganic sa lt liqu id 20m l, nicotinic acid 100mg, pH 6.
Key words　Lactarius vellereus; rDNA ITS sequences;B io logical charac teristics
26