全 文 ：青果抗炎镇痛活性部位的筛选研究
*
徐富翠1，刘明华2，孙玉红2，李 茂2，肖顺汉2＊＊
(1泸州医学院组织学与胚胎学教研室;2泸州医学院药理学教研室，泸州 646000)
摘 要 目的:筛选青果中抗炎镇痛的活性部位，探讨活性部位对细胞炎性因子 IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白表达的影响。方法:
分别用水蒸气蒸馏法、溶剂梯度萃取法获得青果挥发油、青果 10%水提液及其石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位。首先采用
二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致大鼠足跖肿、醋酸致扭体反应和小鼠热板性疼痛筛选抗炎镇痛的活性部位，然后采用 Western
blot 检测活性部位对炎性因子 IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白表达的影响。结果:青果水提液及其石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部位 800
mg /kg均能减轻二甲苯致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶致大鼠足跖肿胀，提高小鼠对热板性疼痛的痛阈值，减少扭体反应的平均次数，
其中乙酸乙酯萃取部位活性最强，但青果挥发油和正丁醇萃取部位 800 mg /kg无明显抗炎镇痛作用。青果水提液的乙酸乙酯萃取
部位 400 mg /kg、800 mg /kg、1200 mg /kg显著降低角叉菜胶致足跖肿胀模型大鼠细胞因子 IL-1β和 TNF-α的蛋白表达，但对 IL-10 表
达无明显的影响。结论:青果水提液的乙酸乙酯萃取部位是抗炎镇痛的活性部位，其作用机制可能与抑制细胞炎性因子 IL-1β 和
TNF-α 的表达有关。
关键词 青果;抗炎;镇痛;活性部位
青果为橄榄科橄榄属植物橄榄(Canarium aibum Ｒaeusch．)
的干燥成熟果实，又名橄榄。青果是我国常用的一种中药材，主
要分布于福建、四川等省区，为《中国药典》收载的品种，常用于
治疗咽喉肿痛、咳嗽、烦渴、鱼鳖中毒等［1 ～ 3］。汉代《三辅黄
图》、宋代《开宝本草》及明代《本草纲目》等古典医书上均有记
载。前期研究表明，其水提液具有较强的抗炎镇痛活性。为进
一步从青果中分离获取抗炎镇痛的有效成分，本研究采用二甲
苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致大鼠足跖肿、小鼠热板性疼痛
和醋酸致扭体反应筛选抗炎镇痛的活性部位，并初步测定活性
部位对细胞炎性因子 IL-1β、IL-10、TNF-α 蛋白表达的影响，旨
在为临床应用青果提取物治疗急性咽喉肿痛等疾病提供理论
依据。
1 材料和方法
1． 1 试验药物 取新鲜青果去核果肉 1000 g，置挥发油提取器
中提取 6 h，得黄色透明油状物，即青果挥发油，得率为 0． 1%。
另取青果干燥果肉 500 g，粉碎，分别用水回流提取 60、45、30
min，合并 3 次提取液，过滤并浓缩至 5 000 ml;将上述 10%青果
水提液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，旋转蒸发
仪减压回收溶剂后得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分离
部位，得率分别为 0． 125%、0． 25%、1． 2%和 8． 9%。临用前用
生理盐水稀释，其中青果 10%水提液的氯仿、乙酸乙酯和正丁
醇分离部位稀释后为混悬液。
1． 2 动物 KM小鼠，雌雄各半，体重:18 ～ 22g;SD大鼠，雄性，
体重:180g ～ 220g。以上动物均为 SPF级实验动物，由泸州医学
院动物实验中心提供，生产许可证号:SCXK(川)2013-17，使用
许可证号:SCXK(川)2013-065。
1． 3 试剂 角叉菜胶为 Sigma公司产品。兔多克隆抗体 IL-1β
(Ｒabbit polyclonal to IL1 beta)、兔多克隆抗体 IL-10(Ｒabbit poly-
clonal to IL10)、兔多克隆抗体 TNF-α(Ｒabbit polyclonal to TNF
alpha)、HＲP 标记的二抗(Goat polyclonal Secondary Antibody to
Ｒabbit IgG -HＲP) ，均购自英国 Abcam公司。
1． 4 仪器 PV － 200 足趾容积测量仪(成都泰盟科技有限公
司) ;YLS － 6B智能热板仪(安徽淮北正华生物仪器设备有限公
司) ;BIO-ＲAD GelDoc 2000 凝胶成像系统(美国伯乐 BIO-
ＲAD)。
1． 5 方法
1． 5． 1 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 小鼠 80 只，随
机分成 8 组，即阴性对照(生理盐水)、阳性对照(阿斯匹林，200
mg /kg)、青果 10%水提液(800 mg /kg)、石油醚部位(800 mg /
kg)、氯仿部位(800 mg /kg)、乙酸乙酯部位(800 mg /kg)和正丁
醇部位(800 mg /kg)、青果挥发油(800 mg /kg)。每天灌胃给药
1 次，连续给药 10 天，按照文献方法［4］，于末次给药 1h后，于一
侧耳廓正反两面均匀涂抹二甲苯 0． 1ml /只，15min后处死，沿耳
廓基线剪下双耳，于同一部位用打孔器打下直径 9mm 耳片称
重，两耳片重量之差为肿胀度，并计算肿胀抑制率。抑制率
(%)=［(空白对照组肿胀度一给药组肿胀度)/空白对照组肿
胀度］× 100%。
1． 5． 2 对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响［5］ 大鼠 80 只，
雌雄各半，分组给药同上。于末次给药 1h后，用 PV-200 足趾容
积测量仪测其正常右后足跖容积，并于大鼠右后足跖皮下注入
角叉菜胶 0． 1ml /爪，然后分别于致炎后 1h、2h、3h、4h、5h、6h 测
定其右后足跖容积，计算出肿胀值(致炎前后容积之差)。
1． 5． 3 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 小鼠 80 只，分组给
药同上。于末次给药 0． 5 小时后，腹腔注射 0． 5%冰醋酸 0．
2ml /只，观察并记录每只小鼠自注射醋酸致痛后至出现第一次
扭体反应的时间(扭体潜伏期)和 15 分钟内出现扭体反应的次
数。
1． 5． 4 对小鼠热板性疼痛的影响［6］ 小鼠 100 只，雌性，用
YLS-6B智能热板仪测定痛阈值(调节热板温度使恒定于 55 ±
0． 5℃，以小鼠自置于仪器上至出现舔后足所需时间作为该鼠的
痛阈值) ，凡舔后足时间小于 5s或大于 30s或跳跃者弃之不用，
筛选出合格的 KM 小鼠 80 只，分组给药同上。于末次给药 30
121中药药理与临床 2014;30(6)
* 基金资助:泸州市科技局重点项目(10ZC028) ＊＊通信作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2014.06.037
分钟后分别测小鼠痛阈值，如 60s 仍无反应，则其痛阈值以 60s
计算。
1． 5． 5 乙酸乙酯部位对 IL-1β、IL-10、TNF-α 蛋白表达的影响
采用Western blot 检测。大鼠 60 只，随机分成 6 组，即空白对
照、模型组、阳性对照(阿斯匹林，200 mg /kg)、乙酸乙酯部位
低、中、高三个剂量组(400 mg /kg、800 mg /kg、1200 mg /kg)。每
天灌胃给药 1 次，连续给药 10 天。于末次给药 1h后，除空白对
照组外其余各组大鼠经右后足跖皮下注入新鲜角叉菜胶 0．
1ml /爪，致炎 2h后取大鼠右后足跖内组织，提取细胞总蛋白，
BCA法测蛋白含量，SDS-PAGE胶电脉，转膜后将 PVDF 膜进行
封闭 2h，一抗(IL-1β、IL-10、TNF-α一抗，1:1000 稀释)孵育 1h
后，加入稀释辣根过氧化物酶(HＲP)标记的二抗，室温或 4℃孵
育 1h，用 Luminate crescendo western HＲP Substrate 显影液对膜
进行预染，后在 Bio-Ｒad凝胶成像系统内曝光显影，Quantity One
软件分析。
2 结果
2． 1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验 青果挥发油和极性最大的
正丁醇部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀无明显的抑制作用，活性
很低。但青果水提液及其石油醚、氯仿和乙酸乙酯 3 个部位对
二甲苯致小鼠耳廓肿胀有较明显的抑制作用，抑制率分别为
45． 93%、40． 88%和 60． 71%，与生理盐水组比较有显著性差异
(P ＜ 0． 01) ，以乙酸乙酯部位活性最强，见表 1。
表 1 青果分离部位对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
鼠数
(只)
耳片肿胀度
(mg)
抑制率
(%)
生理盐水 10 8． 12 ± 2． 04
阿斯匹林 200 10 2． 87 ± 1． 23＊＊ 64． 65
青果 10%水提液 800 10 5． 15 ± 1． 49* 36． 58
青果 10%水提液的石油醚部位 800 10 4． 39 ± 1． 88* 45． 93
青果 10%水提液的氯仿部位 800 10 4． 89 ± 1． 56* 40． 88
青果 10%水提液的乙酸乙酯部位 800 10 3． 19 ± 0． 99＊＊ 60． 71
青果 10%水提液的正丁醇部位 800 10 6． 69 ± 1． 44 17． 61
青果挥发油 800 10 7． 55 ± 2． 15 7． 01
与生理盐水组比较 * P ＜0． 05，＊＊ P ＜0． 01(下同)
2． 2 对角叉菜胶性大鼠足跖肿胀的影响 青果水提液及其石
油醚、氯仿和乙酸乙酯 3 个部位在注射角叉菜胶后 2h、3h、4h、
5h、6h能减轻大鼠关节肿胀度，与正常对照组比较，差异有显著
性;青果挥发油和极性最大的正丁醇部位无明显抑制作用，与
生理盐水组比较，差异无统计学意义，见表 2。
2． 3 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 青果挥发油部位和
极性最大的正丁醇部位对醋酸所致小鼠扭体反应无明显的影
响，但青果水提液及其石油醚、氯仿和乙酸乙酯 3 个部位活性较
强，在注射 0． 5%冰醋酸后能延长小鼠出现扭体反应的平均时
间，减少扭体反应的平均次数，与正常对照组比较，差异有显著
性，其中以乙酸乙酯部位活性最强，见表 3。
表 2 青果分离部位对大鼠角叉菜胶性足跖肿的影响(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
鼠数
(只)
致炎后不同时间的肿胀值(ml)
1h 2h 3h 4h 5h 6h
生理盐水 10 1． 38 ± 0． 23 1． 45 ± 0． 28 1． 22 ± 0． 25 1． 08 ± 0． 21 0． 94 ± 0． 15 0． 85 ± 0． 16
阿斯匹林 200 10 1． 09 ± 0． 18＊＊ 1． 02 ± 0． 25＊＊ 0． 94 ± 0． 13＊＊ 0． 82 ± 0． 12＊＊ 0． 66 ± 0． 17＊＊ 0． 42 ± 0． 20＊＊
青果 10%水提液 800 10 1． 30 ± 0． 21 1． 21 ± 0． 19* 1． 06 ± 0． 17＊＊ 0． 97 ± 0． 18* 0． 89 ± 0． 14* 0． 66 ± 0． 15*
青果 10%水提液的石油醚部位 800 10 1． 27 ± 0． 24 1． 18 ± 0． 22* 1． 03 ± 0． 18＊＊ 0． 93 ± 0． 23* 0． 86 ± 0． 12* 0． 65 ± 0． 14＊＊
青果 10%水提液的氯仿部位 800 10 1． 31 ± 0． 21 1． 13 ± 0． 20＊＊ 1． 10 ± 0． 14* 0． 95 ± 0． 16* 0． 87 ± 0． 13* 0． 62 ± 0． 17＊＊
青果 10%水提液的乙酸乙酯部位 800 10 1． 16 ± 0． 22 1． 09 ± 0． 15＊＊ 0． 98 ± 0． 15＊＊ 0． 86 ± 0． 14＊＊ 0． 66 ± 0． 13＊＊ 0． 55 ± 0． 15＊＊
青果 10%水提液的正丁醇部位 800 10 1． 40 ± 0． 27 1． 42 ± 025 1． 33 ± 0． 23 1． 15 ± 0． 63 1． 04 ± 0． 22 0． 89 ± 0． 24
青果挥发油 800 10 1． 35 ± 0． 25 1． 39 ± 0． 18 1． 31 ± 0． 14 1． 21 ± 0． 13 0． 96 ± 0． 18 0． 95 ± 0． 19
表 3 青果分离部位对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
鼠数
(只)
平均扭体
次数
出现扭体反应的
平均时间(min)
生理盐水 10 21． 88 ± 6． 49 3． 42 ± 1． 49
阿斯匹林 200 10 10． 61 ± 3． 26＊＊ 7． 55 ± 2． 74＊＊
青果 10%水提液 800 10 15． 99 ± 4． 98* 4． 23 ± 2． 09*
青果 10%水提液的石油醚部位 800 10 16． 52 ± 4． 77* 5． 14 ± 2． 21*
青果 10%水提液的氯仿部位 800 10 15． 75 ± 4． 41* 5． 23 ± 2． 45*
青果 10%水提液的乙酸乙酯部位 800 10 12． 61 ± 4． 53＊＊ 6． 76 ± 2． 86＊＊
青果 10%水提液的正丁醇部位 800 10 18． 46 ± 6． 78* 3． 98 ± 1． 85
青果挥发油 800 10 19． 47 ± 7． 03 3． 84 ± 1． 36
2． 4 对小鼠热板性疼痛的影响 结果显示，青果挥发油和极性
最大的正丁醇部位对小鼠热板性疼痛无明显影响，但青果水提
液及其石油醚、氯仿和乙酸乙酯 3 个部位在给药后 30min 均能
提高小鼠的痛阈值，与生理盐水组比较，差异有显著性，其中以
乙酸乙酯部位活性最强，见表 4。
2． 5 乙酸乙酯部位对 IL-1β、IL-10、TNF-α 蛋白表达的影响
Western blot 检测结果表明，角叉菜胶可诱导致炎因子 IL-1β、
TNF-α的蛋白表达。青果 10%水提液的乙酸乙酯部位能明显
下调由角叉菜胶诱导的 IL-1β、TNF-α 的蛋白表达，呈现一定的
剂量依赖性，但对抗炎因子 IL-10 的表达无明显影响，结果见图
1 和表 5。
表 4 青果分离部位对小鼠热板性疼痛的影响(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
鼠数
(只)
给药 30 min痛阈值
(s)
生理盐水 10 23． 96 ± 6． 25
阿斯匹林 200 10 42． 44 ± 9． 59＊＊
青果 10%水提液 800 10 30． 57 ± 6． 94
青果 10%水提液的石油醚部位 800 10 32． 12 ± 9． 23*
青果 10%水提液的氯仿部位 800 10 35． 77 ± 8． 28*
青果 10%水提液的乙酸乙酯部位 800 10 39． 44 ± 9． 03＊＊
青果 10%水提液的正丁醇部位 800 10 27． 11 ± 8． 58
青果挥发油 800 10 26． 74 ± 7． 66
表 5 IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白的相对表量(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
鼠数
(只)
IL-1β IL-10 TNF-α
空白对照 10 0． 3598 ± 0． 1036＊＊ 0． 4268 ± 0． 0548 0． 6248 ± 0． 1147*
模型对照 10 0． 6674 ± 0． 1587 0． 4563 ± 0． 0478 0． 8041 ± 0． 1684
阿斯匹林 200 10 0． 2569 ± 0． 0657＊＊ 0． 5129 ± 0． 0426 0． 2782 ± 0． 0526＊＊
乙酸乙酯部位 400 10 0． 4758 ± 0． 0974* 0． 4618 ± 0． 0471 0． 7856 ± 0． 0863*
乙酸乙酯部位 800 10 0． 3245 ± 0． 0785＊＊ 0． 4935 ± 0． 0469 0． 6453 ± 0． 0789*
乙酸乙酯部位 1200 10 0． 2896 ± 0． 0621＊＊ 0． 4812 ± 0． 0527 0． 3683 ± 0． 0526＊＊
与模型对照组比较 * P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
221 中药药理与临床 2014;30(6)
图 1 Western blot分析乙酸乙酯部位对 IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白表达的影响
3 讨论
在我国主要分布于福建、山东、云南、四川等地，现在四川、
福建等省均建立了青果 GAP 种植基地。2009 年，四川省青果
年产量已达 600 万 ～ 800 万 kg，现已成为全国青果主产区之
一［7］。青果营养丰富，属卫生部批准的 69 种药食两用物品之
一。青果中含多酚类、三萜类、黄酮类、香豆素类等化学成
分［8］。本实验结果显示，青果挥发油和极性最大的正丁醇部位
对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致大鼠足跖肿、小鼠热板
性疼痛和醋酸致扭体反应均无明显抑制作用，但石油醚、氯仿
和乙酸乙酯 3 个部位活性较强，具有明显的抗炎镇痛作用，其中
以乙酸乙酯部位活性最强。青果水提液经长时间高温煮提，石
油醚极性又低，其萃取得到的抗炎镇痛的活性成分可能是非蛋
白、非多肽类的小分子化合物。化学成分定性检测结果表明，石
油醚分离部位含有甾体和萜类，氯仿和乙酸乙酯分离部位含有
鞣质和黄酮类化合物，它们可能单独或相互作用产生抗炎镇痛
作用［9，10］。
炎症是机体组织对局部损伤的反应。在炎症的早期，炎症
介质刺激血管，使血管扩张，血管内皮间隙扩大，血管壁通透性
增加，血浆内的液体、蛋白质和白细胞等渗出到组织间隙，随着
渗出的增加，造成组织肿胀。因此，炎性渗出、组织肿胀是炎症
早期的重要指标。在诸多炎症因子中，IL-1β、TNF-α 发挥了非
常关键的作用，其可通过以下途径诱导炎症的产生与恶
化［11，12］:(1)刺激血管内皮细胞黏附分子的表达，趋化吸引炎症
细胞进入炎症部位;(2)刺激成纤维细胞、巨噬细胞产生大量前
列腺素;(3)激活抗原提呈细胞，增强 MHC 分子的表达，促进抗
原提呈，介导免疫反应;(4)刺激 T、B细胞活化、增殖，产生效应
细胞或抗体。有研究证实细胞因子调节中性粒细胞迁移到炎
症发生的部位，抗炎细胞因子 IL-10 可下调这一过程［13］。在动
物试验和人的炎症中观察到 IL-1β和 TNF-α 能调节中性粒细胞
参与炎症发生，IL-10 能抑制炎症刺激诱导的中性粒细胞的迁
移［14］。本研究结果显示，青果 10%水提液中乙酸乙酯部位不
仅具有明显的抗炎和镇痛效应，而且能减少大鼠炎症部位细胞
因子 IL-1β、TNF-α 的蛋白表达，但对 IL-10 无明显影响。抗炎
细胞因子 IL-10 的增加有平衡致炎因子的作用，因此，对由角叉
菜胶引起的炎症，IL-10 的作用非常有限。乙酸乙酯部位对其他
细胞炎性因子是否有作用，有待于进一步的研究证实。
参考文献
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anti-inflammatory cytokines． Int Immunol，2002;14(7)∶ 733 ～ 740
Screening the anti-inflammatory and analgesic active site from fructus canarii
Xu Fucui1，Liu Minghua2，Sun Yuhong2，Li Mao2，Xiao Shunhan2
(1Department of Histology and Embryology，2Department of Pharmacology，Luzhou Medical College，Luzhou 646000)
Objective:To Screen the anti-inflammatory and analgesic active site from Fructus Canarii and Observe the effect of active site on Inflam-
matory cell factor IL-1β，IL-10 and TNF-α． Methods:The essential oil of Fructus Canarii was extracted by steam-stilling． Other solvent ex-
tracts were obtained by extracting Fructus Canarii＇water -soluble part with petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and n-butanol in order ．
321中药药理与临床 2014;30(6)
Using mouse auris-swell model resulted in dimethylbenzene，the model of rat paw edema induced with carrageenan，writhing induced with
acetic acid in mice and Hot plant test as screening to anti-inflammatory analgesic active site，further using Western blot analyses to detect ac-
tive site of inflammatory cell factor IL-1β，IL-10，TNF-α． Ｒesults:Fructus Canarii＇water -soluble part with ether，chloroform，ethyl acetate
extract 800 mg /kg could reduce mouse auricle swelling induced by xylene and pelvetia silquosa glue to rats foot metatarsus swelling，increase
the mice pain threshold of hot plate pain，reduce the average number of twisting body response，including petroleum ether extraction site most，
but the essential oil of Fructus Canarii and n-butanol extraction parts 800 mg /kg have no obvious anti-inflammatory analgesic action． Petrole-
um ether extraction parts 400 mg /kg，800 mg /kg and 1200 mg /kg significantly down-regulated the expression of cytokines IL -1 and TNF -α
in the model of rat paw edema induced with carrageenan，but had no obvious effect on the expression of IL -10． Conclusions:Fructus Cana-
rii＇ water - soluble part with petroleum ether is anti-inflammatory analgesic active site，its mechanism may be related to inhibiting the expres-
sion of inflammatory cell factor IL -1βand TNF-α．
Key words Fructus Canarii(青果) ;anti-inflammation;analgesia;active site
miＲ-7 介导加味四君子汤含药血清抑制 B16 恶性黑色素瘤细胞增殖和
促进凋亡的研究
*
周昕欣1，2，杨关林2＊＊
(1辽宁中医药大学附属第二医院皮肤科，沈阳 110034;2辽宁中医药大学，沈阳 110101)
摘 要 目的:研究 miＲ-7 是否介导加味四君子汤含药血清抑制 B16 恶性黑色素瘤细胞增殖和促进 B16 恶性黑色素瘤细胞
凋亡的过程。方法:应用血清药理学方法给药，37℃、5%CO2 的恒温培养箱中培养 B16 恶性黑色素瘤细胞，收集对数期细胞，终浓度
10%的小鼠含药血清，作用 24 h。实验分为空白对照组、血清对照组、4． 61 g /kg、9． 22 g /kg和 18． 44 g /kg加味四君子汤含药血清组，
每组含 5 个样本数，应用 Ｒeal- time PCＲ法检测 miＲ-7 的内源性表达;分别转染 miＲ-7 模拟物和 miＲ-7 抑制物到 B16 恶性黑色素瘤
细胞，应用 Ｒeal- time PCＲ 法检测 miＲ-7 模拟物和 miＲ-7 抑制物的转染效率、应用 MTT 法、流式细胞仪 Annexin V-FITC /PI 法检测
miＲ-7 对 B16 恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果:加味四君子汤含药血清作用 24h，与空白对照组和血清对照组相比，9． 22
g /kg和 18． 44 g /kg加味四君子汤含药血清组 B16 恶性黑色素瘤细胞中 miＲ-7 表达升高;miＲ-7 模拟物和 miＲ-7 抑制物成功转染到
B16 恶性黑色素瘤细胞中，其 Ｒelative Conc值分别是(6． 47 ± 0． 18)和(0． 20 ± 0． 01) ，与空白对照组、血清对照组和阴性对照组相比
分别显著升高和显著降低;与空白对照组和血清对照组及阴性对照组相比，miＲ-7 模拟物组的抑制率显著升高(53． 61 ± 2． 11)%，
miＲ-7 抑制物组抑制率显著降低(6． 76 ± 0． 48)%;与空白对照组和血清对照组及阴性对照组相比，miＲ-7 模拟物组的凋亡率显著升
高(34． 30 ± 2． 13)%，miＲ-7 抑制物组凋亡率显著降低(5． 80 ± 0． 78)%。结论:miＲ-7 介导加味四君子汤含药血清抑制 B16 恶性黑
色素瘤细胞增殖和促进 B16 恶性黑色素瘤细胞凋亡的过程，miＲ-7 可能是加味四君子汤抗恶性黑色素瘤的重要分子之一。
关键词 加味四君子汤;血清药理学;miＲ-7;B16 恶性黑色素瘤细胞;增殖;凋亡
在我们的前期工作中，我们已证实加味四君子汤含药血清
抑制 B16 恶性黑色素瘤细胞增殖，促进 B16 恶性黑色素瘤细胞
的凋亡［1］;加味四君子汤含药血清能显著降低 B16 恶性黑色素
瘤细胞侵袭，并且能够显著降低与 B16 恶性黑色素瘤细胞侵袭
相关的蛋白 MMP-2 和 MMP-9 表达［2］，提示加味四君子汤可能
在抑制肿瘤侵袭转移和促进凋亡中起着重要作用。同样我们
证明，在上述过程中 B16 恶性黑色素瘤细胞的 NF-κB(p65)活
性和表达水平降低［3］，有大量文献已明确 NF-κB(p65)是 Bcl-2、
MMP2 和 MMP9 正性转录调控因子［4 ～ 6］，NF-κB(p65)的活性和
表达水平降低可通过上述基因表达降低促进 B16 恶性黑色素
瘤细胞凋亡和抑制迁移侵袭。
microＲNA(miＲNA)是一类约 22bp 长的非编码小分子
ＲNA，由长约 70 左右的碱基可形成发夹结构的前体经 dicer 酶
剪切而来。通过和信使 mＲNA 3＇端非翻译区(3＇ UTＲ)不精确
互补配对而裂解 mＲNA 或抑制翻译起始，能够在转录后水平调
控基因的表达，对细胞分化、增殖、凋亡、致癌、抑癌、转录因子调
控等生物过程进行调节［7］。我们应用 miＲNA 靶基因预测软件
miＲanda和 TargetScan预测，发现信号分子蛋白 NF-κB(p65)是
miＲ-7 的靶基因，基于以上前期工作基础和生物信息学软件，我
们推测 miＲ-7 可能通过调节 NF-κB(p65)表，进而介导加味四君
子汤含药血清促进 B16 恶性黑色素瘤细胞凋亡的过程。本研
究首先建立体外 B16 恶性黑色素细胞瘤模型，利用血清药理学
方法给药，Ｒeal- time PCＲ法检测 miＲ-7 的内源性表达;在此基
础上分别转染 miＲ-7 模拟物和 miＲ-7 抑制物到 B16 恶性黑色素
瘤细胞，Ｒeal- time PCＲ 法检测转染效率、流式细胞仪 Annexin
V-FITC /PI法检测 miＲ-7 对 B16 恶性黑色素瘤细胞凋亡的影
响。
421 中药药理与临床 2014;30(6)
* 基金项目:辽宁省科技计划项目(NO． 2013226012) ;中国博士后科学基金面上项目(NO． 2014M551120) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2014.06.038