全 文 ：茅苍术种质资源的超低温保存
孔令婕 ,巢建国＊ ,谷巍 ,张莹 ,刘晓宁　(南京中医药大学药学院 , 江苏 南京　210046)
摘要:目的:为茅苍术种质资源的保存提供一条新途径。方法:采用干冻法研究了茅苍术种子超低温保存 , 采用玻璃化法
研究了试管苗茎尖的超低温保存。结果:采用干冻法冻存的茅苍术种子发芽率在 70%以上 , 采用玻璃化法冻存的茅苍术
试管苗茎尖 ,再生率在 30%以上。结论:超低温保存可用于茅苍术种子及试管苗茎尖的保存 , 为茅苍术种质资源的长期
保存提供了理论依据。
关键词:茅苍术;种子;茎尖;超低温保存
中图号:R282.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5005(2010)01-0056-03
　　茅苍术 Atractylodes lancea (Thunb.)DC.为菊
科苍术属多年生草本植物 ,其干燥根茎作苍术入
药 ,具燥湿健脾 ,祛风 ,散寒 ,明目的功能 。茅苍术
是江苏省道地药材 ,公认为优质的苍术品种 ,特别
是产于茅山一带的质量最优。近年来由于各种人
为因素的影响 ,茅苍术的生存环境受到严重破坏 ,
野生资源日益枯竭 ,已列为江苏省 4种濒危药用
植物之一[ 1-2] 。为保护这一种质资源 ,必须寻找
一种有效的方法 。超低温保存是目前植物种质资
源长期保存的理想方法 , -196℃条件下 ,活细胞
内的物质代谢和生长活动完全停止 ,植物材料处
于相对稳定的生物学状态 ,可较长时间地保存所
需的种质资源[ 3-4] 。目前 ,对茅苍术种质进行超
低温保存的相关研究未见报道 。本实验利用超低
温技术对茅苍术种质资源进行保存研究 ,对于保
存种质资源 ,扩大繁殖 ,都有重要意义。
1　材料
1.1　药材与试剂
(1)药材:茅苍术种子和试管苗茎尖 ,取自南
京中医药大学药用植物教研室 。
(2)试剂:丙三醇 、乙二醇 、聚乙二醇 、二甲亚
砜 、蔗糖等 ,以上试剂为分析纯 。
1.2　仪器
YXQ-SG41-280型高压灭菌锅 、SW-CJ-1B 型净
化工作台 、WSB-E2型温湿度表 、HH-Z 型表显水浴
锅 、BCD-218K/H 型冰箱 、精密天平 、烘干箱 、液氮
罐。
2　方法
2.1　干冻法进行种子超低温保存
2.1.1　种子含水量测定
种子含水量用水分占鲜重的百分率表示 。用
精密天平称重 。
2.1.2　种子的脱水处理
将种子置培养皿中无菌滤纸上 ,每一培养皿
中放 20 g 变色硅胶 。脱水时间分别为 3 、4 、5 、6 、
24 、48 h。
2.1.3　冰冻和解冻
将脱水后的种子密封于冷冻管中 ,直接投于
液氮中保存 。种子保存 1 h后取出 ,分别在 35 ～
40℃水浴 6 ～ 7 min ,室温23 ～ 27℃530 min解冻。
2.1.4　再培养试验
将解冻后的种子置于铺有无菌滤纸的培养皿
中培养 ,观察统计发芽率 。
发芽率(%)=发芽总粒数试验总粒数×100%
2.2　玻璃化法进行试管茎尖的超低温保存
2.2.1　预处理
4周龄的试管苗嫩梢(0.8 ～ 1.0 cm)继代到不
同蔗糖浓度的改良MS培养基[ KNO3 和NH4NO3
收稿日期:2009-06-11;修稿日期:2009-11-07
基金项目:国家中医药管理局基金项目(06-07ZP19);江苏省科技厅高技术研究计划项目(BG2006322);江苏省中医药局基金项目
(HZ07042);南京中医药大学“创新团队”资助
作者简介:孔令婕(1985-),女 ,江苏南京人 ,南京中医药大学 2007级硕士研究生。 ＊通讯作者:13851562488
—56— 南京中医药大学学报 2010 年 1月第 26 卷第 1 期JOURNALOF NANJINGTCMUNIVERSITY Vol.26 No.1 Jan.2010
DOI :10.14148/j.issn.1672-0482.2010.01.001
减半 ,MS(1/2N)] ,低温(6±1)℃和弱光照 800 lx
(12 h/d)条件下锻炼 1 ～ 12周 ,切取不同大小的
茎尖 ,直接在含不同蔗糖浓度的MS(1/2N)培养基
上预培养 2 d 。
2.2.2　装载
将预培养后的茅苍术试管苗茎尖转移到 1.8
mL 冻存管中(每管不少于 10个茎尖),加入装载
液(2 mol/L甘油+0.4 mol/L 蔗糖)1.0 mL ,室温
25℃过渡 20 min。
2.2.3　玻璃化保护液脱水
将装载后茅苍术试管苗茎尖经不同的玻璃化
保护液(PVS1:22%甘油+13%乙二醇+13%聚乙
二醇+15%二甲基亚砜;PVS2:30%甘油+15%乙
二醇+15%二甲基亚砜+0.4 mol/L 蔗糖;PVS3:
50%甘油+50%蔗糖;PVS4:35%甘油+20%乙二
醇+0.6 mol/L 蔗糖)于不同温度下处理 。
2.2.4　冷冻
将处理后茎尖吸去原液 ,装入新鲜的玻璃化
液后迅速投入液氮罐中 , 每次处理 2 管 ,重复 3
次。
2.2.5　解冻
保存 1 d后 ,从液氮罐中取出冻存管 ,在不同
温度下解冻。
2.2.6　洗涤
解冻后的茎尖除去保护液 ,用 1.2 mol/L 蔗
糖的改良培养基洗涤 2次 ,每次 10 min。
2.2.7　再培养
将洗涤后的茎尖用无菌滤纸吸去残留在其表
面上的培养基 ,接种到添加不同培养基表面的滤
纸上 ,暗处理 1 d 后转移到新鲜的上述再生培养
基中 ,暗培养 1周后转移到正常培养光照条件下
培养 。6周后统计成活率 。
成活率(%)=再生出叶片的芽数总芽数 ×100%
3　结果
3.1　种子脱水时间对超低温保存的影响
用定量变色硅胶脱水 ,不同脱水时间的种子
都能萌发 。但以脱水时间 24小时萌发率最高。
3.2　解冻方法对种子萌发率的影响
结果表明 ,在室温(23 ～ 27℃)下慢速解冻和
水浴上(35 ～ 40)℃快速解冻 ,种子的萌发率有所
不同。茅苍术种子经超低温冷冻后 ,采用 40℃下
快速解冻最佳。
3.3　超低温保存时间对种子萌发率的影响
经24 h干燥脱水的种子 ,在液氮中保存 1 h
或1个月的试验表明 ,前者的萌发率为 79.2%,后
者为 79.1%。二者基本一致。这说明种子在液
氮中可长期保存。
3.4　茎尖大小对茅苍术超低温保存存活率的影
响
结果见表 1。
表 1　茅苍术试管苗茎尖大小对超低温保存后
成活率的影响
茎尖大小/mm 成活率/ %超低温保存 对照
0.8～ 1.0 8.3 100.0
1.5～ 2.0 21.4 96.7
2.5～ 3.0 6.5 92.1
　　表 1结果显示茎尖长度在 1.5 ～ 2.0 mm 范围
内 ,可得到最高的存活率 ,长度为 0.8 ～ 1.0 mm 时
不易成活 ,长度为 2.5 ～ 3.0 mm 时冻后存活率也
较低 。
3.5　低温锻炼时间对茅苍术试管苗茎尖超低温
保存后成活率的影响
结果见表 2。
表 2　低温锻炼时间对茅苍术试管苗茎尖超低温保
存后成活率的影响
蔗糖浓度
/ mol·L-1
低温培养时间
/周
成活率/ %
超低温保存 对照
0.1 0 0.0 100.0
1 3.6 98.6
3 9.8 95.2
6 24.6 94.2
9 23.9 95.0
12 23.6 94.3
0.3 0 0.0 100.0
1 15.7 98.3
3 23.3 97.5
6 24.1 96.4
9 24.7 95.2
12 24.3 96.0
　　由表 2可知 ,随着低温锻炼时间延长 ,茎尖存
活率提高 ,保存 3周以上时成活率保持在 21%～
25%。在相同的低温锻炼条件下 , 蔗糖浓度为
0.1 mol/L时需要保持 6 周以上成活率才能超过
20%,浓度为 0.3 mol/L时只需要 3周成活率就达
20%以上 , 因此认为低温锻炼时培养基中添加
0.3 mol/L蔗糖时保存效果较好。
—57—孔令婕 , 等:茅苍术种质资源的超低温保存　第 1期
3.6　预培养蔗糖浓度对茅苍术试管苗茎尖超低
温保存后成活率的影响
采用不同的预培养方式处理试管苗茎尖 ,超
低温保存后观察成活率 ,结果见表 3。
3.7　玻璃化液对试管苗茎尖超低温保存成活率
的影响
比较由不同配比的甘油 、乙二醇 、聚乙二醇 、
二甲亚砜 、蔗糖组成的 4种玻璃化保护剂对试管
苗茎尖超低温保存再生率的影响 ,结果见表 4。
3.8　解冻温度对茅苍术茎尖超低温保存后成活
率的影响
在不同温度的水浴中处理液氮保存后的茅苍
术茎尖 ,试验表明解冻温度对茅苍术茎尖超低温
保存后成活率的影响较大 ,0℃和室温(20℃)条件
下缓慢解冻茎尖成活率都较低 ,35℃高温快速化
冻效果较好。
3.9　恢复培养基的选择
茎尖化冻后 ,分别接种到含有不同激素 MS
培养基上进行恢复培养 ,结果见表 5。
表 3　预培养方式对茅苍术试管苗茎尖超低温保存后成活率的影响
编号 蔗糖浓度/ mol·L-1 成活率/ %超低温保存 对照
1 0.0(1d) 2.4 100.0
2 0.1(1d) 18.1 100.0
3 0.1(1d)+0.3(1d) 25.1 98.3
4 0.1(1d)+0.3(1d)+0.5(1d) 40.2 90.0
5 0.1(1d)+0.3(1d)+0.5(1d)+0.7(1d) 21.4 81.3
表 4　不同玻璃化液对成活率的影响
玻璃化液编号 成活率/ %
PVS1 0
PVS2 79
PVS3 29
PVS4 60
表 5　不同恢复培养基对茅苍术试管苗茎
尖成活率的影响
培养基/mg·L-1 成活率/ %暗培养 光照培养
MS+6-BA2.0+NAA0.2 54 30
MS+6-BA3.0+NAA0.2 43 18
MS+6-BA2.0+NAA0.2+GA32.5 75 69
MS+6-BA3.0+NAA0.2+GA32.5 58 51
4　讨论
(1)本实验考察了超低温保存中一系列影响
因素对茅苍术成活率的影响 ,结果表明苍术种子
以脱水时间24 h ,经超低温冷冻后用 40℃下快速
解冻的萌发率最高 ,且可在液氮中长期保存 。苍
术试管苗茎尖长度在 1.5 ～ 2.0 mm范围内 ,随着
低温锻炼时间越长 ,其存活率越高 ,采用不同的预
培养方式处理 , 以试管苗嫩梢接种到含有
0.1 mol/L蔗糖的培养基中低温锻炼 1 d ,接着依
次转移至含 0.3 mol/L 、0.5 mol/L 蔗糖的改良MS
培养基上各培养1 d ,超低温保存后再生率最高;
玻璃化保护剂以 PVS2即 30%甘油+15%二甲基
亚砜+0.4 mol/L 蔗糖的处理效果最好;解冻以
35℃高温快速解冻效果最好;茎尖解冻后 ,分别接
种到含有不同激素 MS 培养基上进行恢复培养 ,
含有 2.0 mg/LGBA 加入赤霉素 GA3 12.5 mg/L
后 ,存活率明显提高 。
(2)本实验采用的玻璃化液组成中 ,二甲亚砜
对材料具有毒害作用 ,高含量的蔗糖会加剧材料
的褐化 ,引起保存后茎尖再生困难 。因此 ,玻璃化
液筛选和再生条件有待进一步研究 。
参考文献:
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海:第二军医大学出版社 , 2000.59.
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(编辑:李伟东)
—58— 南京中医药大学学报 2010年 1 月第 26卷第 1 期