全 文 ：实 验 研 究
辽东楤木叶总皂苷对人胃癌 BGC细胞凋亡的影响
尹丽颖1，仲丽丽2，边晓燕1，敖鹏1，肖洪彬1*
(1．黑龙江中医药大学 实验教学中心，黑龙江 哈尔滨 150040;
2．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:探讨辽东楤木叶总皂苷(ETS)对人胃癌 BGC细胞凋亡的影响。方法:采用MTT比色法测
定辽东楤木叶总皂苷在体外对人胃癌 BGC细胞增殖的影响;激光共聚焦显微镜观察 FITC － Annexin V /
PI双染法检测辽东楤木叶总皂苷作用于人胃癌 BGC 细胞后引起细胞凋亡的形态特征。结果:MTT 比
色法结果表明，辽东楤木叶总皂苷各剂量组能不同程度抑制人胃癌 BGC 细胞的增殖，激光共聚焦
FITC － Annexin V /PI 双染法检测辽东楤木叶总皂苷可诱导人胃癌 BGC 细胞出现凋亡早、中、晚期的细
胞形态。凋亡早期仅细胞膜呈绿色，细胞核不染色;凋亡中、晚期则细胞膜呈绿色，细胞核呈红色。结
论:辽东楤木叶总皂苷能够有效抑制癌细胞增殖、诱导凋亡，具有明显的抗肿瘤作用。
关键词:辽东楤木叶总皂苷;激光共聚焦显微镜;细胞凋亡
中图分类号:R285 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2392(2012)03 － 0012 － 03
收稿日期:2012 － 02 － 21 修回日期:2012 － 03 － 25
基金项目:国家自然科学基金项目(30772779) ;黑龙江省中医药管理局
科研项目(ZHY10 － W16) ;黑龙江中医药大学创新性实验教
学项目 (99610) ;科技部国际科技合作与交流专项
(20072315)
作者简介:尹丽颖(1979 －) ，女，助理研究员，方剂学硕士，主要从事透
射电子显微技术工作。
* 通讯作者:肖洪彬(1957 －) ，男，教授，博士研究生导师，主要研究方
向:中药有效成分研究。
中药辽东楤木为五加科楤木属植物，又名龙牙楤
木。其根皮和树皮入药，药材名为刺老鸦，其性味苦、
辛、平、有小毒，具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除
湿止痛之功效［1，2］。课题前期药效学和药理学研究结
果证明，辽东楤木叶的总苷部分具有抑制癌细胞增殖、
诱导凋亡的抗肿瘤作用。
在我国，胃癌的死亡率高居恶性肿瘤的首位，发
病率在恶性肿瘤中位居第二，因此进行胃癌治疗的研
究有重大的现实价值。本课题以体外培养的人胃癌
BGC细胞为研究对象，用激光共聚焦显微镜观察 FITC
－ Annexin V /PI双染法检测辽东楤木叶总皂苷作用于
人胃癌 BGC细胞后引起细胞凋亡的形态特征，从而为
研究开发其作为抗癌新药提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 细胞株
人胃癌 BGC细胞由中国医学科学院、中国协和医
科大学药用植物研究所药理实验室提供。
1． 2 药品与试剂
辽东楤木叶总皂苷(黑龙江中医药大学药理教研
室提供) ;5 －氟脲嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限
公司，批号:0807251) ;PRMI － 1640(德国贝尔公司，批
号:20080610) ;胰蛋白酶(德国贝尔公司，批号:
20080919) ;胎 牛 血 清 (德 国 贝 尔 公 司，批 号:
200810210) ;Annexin － V试剂盒(宝赛生物技术有限
公司)。
1． 3 主要仪器设备
超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司) ;
CO2培养箱(HF90 /HF240) ;低速离心机(LDZ4 － 1． 2
北京医用离心机厂) ;MILLI － Q超纯净水纯化系统;电
热恒温水浴锅(DK － S24 上海森信实验仪器有限公
司) ;酶标仪(Antos 2010 奥地利) ;激光共聚焦显微镜
(德国 ZEISS公司)。
1． 4 实验方法
1． 4． 1 细胞培养
将人胃癌 BGC 细胞株置于含 10% 胎牛血清及
1%双抗的 RPMI － 1640 培养基中，置于含 5% CO2、
37℃饱和湿度的 CO2 培养箱中孵育，待细胞长至
80% ～ 90% 时，倒出培养瓶中的培养基，加入 2 ～
3mLPBS缓冲液，以洗去细胞代谢产物，轻轻振荡后倒
出 PBS缓冲液，加入含 0． 02% EDTA的 0． 25%胰蛋白
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Acta Chinese Medicine and Pharmacology
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酶 1 ～ 2mL，置于含 5% CO2、37℃饱和湿度的 CO2培养
箱中3 ～ 5min取出，在倒置显微镜下观察细胞形态，细
胞变圆时加入 3 ～ 4 倍于胰蛋白酶的培养基以终止消
化。用吸管轻轻吹打以使细胞悬浮，将此细胞悬液移
入 10mL 离心管中，置于低速离心机中以 1 000rpm·
min －1离心 5min。倒去上清，加入新培养基，用滴管混
合均匀，分装于不同的培养瓶中，做好标记，放于含
5%CO2、37℃饱和湿度的 CO2培养箱中培养待用。
1． 4． 2 MTT 比色法测定辽东楤木叶总皂苷在体外对
人胃癌 BGC细胞增殖的影响
取对数生长期细胞，以每孔 1 × 104个细胞的密度
接种于 96 孔培养板，每孔 200μL。置 37℃、5% CO2、
饱和湿度的培养箱培养 24h后分别加入不同浓度的药
物培养液，对照组加入等体积的培养液，每组设 5 个
复孔，继续培养 24h 后取出培养板，吸去上清液，每孔
加入 20μL的 MTT 溶液(5mg /mL) ，37℃继续培养 4h
后，小心吸去孔内的培养上清液。每孔再加入 200μL
二甲亚砜(DMSO) ，振荡 10min，使结晶物充分溶解。
使用酶标仪检测光吸收值(A) ，选择 570 nm 波长，按
下式计算抑制率。
肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1 －用药组平均
A值 /对照组平均 A值)× 100%
1． 4． 3 FITC － Annexin V /PI双染法检测细胞凋亡
取对数生长期细胞，用细胞计数板将细胞浓度调
至 1． 0 × 106 /mL，再将细胞培养于盖玻片上(厚度为
0． 17mm)并放入 6 孔板中。细胞在盖玻片上贴壁生长
24h 更换培养液，同时加入药物:对照组(未做处理) ;
中药组(100μg /mL 辽东楤木叶总皂苷) ;西药组
(100μg /mL 5 －氟尿嘧啶)。作用 24h 后，弃培养液，
PBS 冲洗两次，加入 200μL Binding Buffer，再加入
10μL Annexin － V － FITC 和 5μL PI，避光室温染色
15min，最后加入 300μL Binding Buffer，立即进行激光
扫描共聚焦显微镜检测。
2 结果
2． 1 辽东楤木叶总皂苷对人胃癌 BGC 细胞增殖的
影响
表 1 不同浓度辽东楤木叶总皂苷对人胃癌
BGC细胞作用 24h后的 A值及抑制率(珋x ± s)
分组 剂量(μg /μL) A值(μg /μL) 抑制率(%)
对照组 0 0． 590 ± 0． 155 0
ETS组 25 0． 491 ± 0． 102* 16． 78
50 0． 374 ± 0． 027* 36． 61
100 0． 187 ± 0． 082* 68． 13
5 －氟尿嘧啶组 100 0． 175 ± 0． 025* 61． 37
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 01。
对照组细胞体外生长活跃，经不同浓度中药作用
24h后，细胞生长均出现不同程度的抑制。结果表明，
用药组与对照组比较抑制率显著增高(P ＜ 0． 01) ;并
呈浓度依赖性(见表 1)。
2． 2 FITC － Annexin V /PI双染法检测结果
激光共聚焦检测结果显示，空白组细胞结构完好，
成多角形，无染色或仅有微弱的绿色荧光。中药组与
西药组均可见大量早期及中晚期凋亡的细胞，早期凋
亡细胞仅细胞膜呈绿色荧光，细胞核不着色;中、晚期
凋亡细胞则细胞膜呈绿色荧光，细胞核呈红色荧光。
(见图 1、2、3)。
图 1 对照组
图 2 中药组
图 3 西药组
3 讨论
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是指细胞在基因
调控下按一定程序主动地走向死亡的过程［3］。
Annexin － V 试剂盒是检测凋亡过程中细胞膜损
伤的新方法。目前认为，在凋亡早期，其变化主要发生
在细胞的表面，虽然细胞膜的完整性尚还维持，但膜磷
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脂已失去平衡，此时位于细胞膜上的磷脂酰丝氨酸
(PS)会从细胞膜的内侧翻转到外侧，暴露于细胞外环
境中。而 Annexin － V是一种 Ca2 +依赖性磷脂结合蛋
白，与磷脂具有高度亲和力，它可与转移到膜外的 PS
结合，从而在这些早期凋亡细胞还未出现形态学改变
及 DNA降解以前即可通过 Annexin － V荧光染料检测
到［4］。
现代医学研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡是一条有
效的肿瘤治疗途径，比杀伤肿瘤细胞的治疗有明显的
优越性，故寻求高效低毒的肿瘤细胞凋亡诱导剂已成
为目前肿瘤治疗的研究热点［5］。
本研究发现，辽东楤木叶总皂苷作用于人胃癌
BGC细胞后，MTT法检测结果显示不同浓度药物对细
胞生长均有抑制作用，且呈一定的量效关系。通过
FITC － Annexin V /PI双染法检测，激光共聚焦显微镜
观察辽东楤木叶总皂苷对人胃癌 BGC 细胞有明显抑
制生长和杀伤作用，能够诱导胃癌细胞凋亡，但具体通
过何种机制诱发凋亡还有待于进一步研究。
参考文献:
［1］ 尹丽颖，边晓燕，肖洪彬．辽东楤木叶总皂苷对荷瘤小鼠抑瘤作用
的实验研究［J］．中医药信息，2010，27(3) :107 － 109．
［2］ 王丽岩，肖洪彬，王鸣慧．辽东楤木叶总皂苷抗急性肝损伤的实验
研究［J］．中医药信息，2009，26(2) :29 － 30．
［3］ 阳高亮，李祺福．细胞凋亡与肿瘤的发生发展和治疗［J］．国外医
学·肿瘤分册，2000，27(5) :266 － 269．
［4］ 袁兰．激光扫描共聚焦显微镜技术教程［M］．北京:北京大学医学
出版社，2004．
［5］ 方芳．肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其诱导肿瘤细胞凋亡机
制的研究进展［J］．国外医学·药学分册，2005，32(1) :6 － 10．
Effect of Aralia Elate Seem Leaf Total Saponin on Apoptosis of BGC
in Human Gastric Cancer
YIN Li － ying1，ZHONG Li － li2，BIAN Xiao － yan1，AO Peng1，XIAO Hong － bin1
(1． Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;
2． The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective:To explore the effect of Aralia Elate Seem Leaf Total Saponin (ETS)on apoptosis of BGC in human
gastric cancer． Methods:MTT assay was used to investigate the effect of Aralia Elate Seem Leaf Total Saponin on prolif-
eration in human gastric cancer BGC in vitro． Laser confocal microscope FITC － Annexin V /PI double staining method
was used to investigate morphological features of apoptosis caused by Aralia Elate Seem Leaf Total Saponin effect on hu-
man gastric cancer BGC． Results:MTT assay results showed that each dose group of the Aralia Elate Seem Leaf Total
Saponin could inhibit proliferation in human gastric cancer BGC with different degrees，laser confocal microscope FITC
－ Annexin V /PI double staining detect the Aralia Elate Seem Leaf Total Saponin could induce apoptosis morphology of
human gastric cancer BGC in early，middle and late stage． In early term of apoptosis，cell membrane only was green，
nuclear not staining;cell membrane was green and red nucleus in the middle and late stages of apoptosis． Conclusion:
The Aralia Elate Seem Leaf Total Saponin can inhibit cancer cell proliferation effectively and induce apoptosis and has an
anti － tumor effect significantly．
Key words:Aralia Elate Seem Leaf Total Saponin(ETS) ;Laser confocal microscope;
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気気
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