全 文 ：实验与检验医学 2016 年 2 月第 34 卷第 1 期 Experimental and Laboratory Medicine, Feb.2016,Vol.34,No.1
·论 著·
随着生物医学的研究发展， 获得生物医学样
本的荧光光谱在生物医学研究中越来越重要[1]。 荧
光显微镜可以观察到其荧光图像， 但不能准确获
取其相应荧光激发和发射波长[2]。 随着激光扫描共
聚焦显微镜 (laser scanning confocal microscope，
LSCM)的发展，其 λ 扫描功能可以扫描生物医学样
本的荧光光谱，但目前相关的研究较少，有待深入
研究[3]。 因此本研究使用激光扫描共聚焦显微镜 λ
扫描功能检测生物医学样本的荧光光谱， 获取其
相应的荧光激发和发射波长， 并准确获得其荧光
图像， 为基于激光扫描共聚焦显微镜获得生物医
学样本的荧光光谱提供理论和实验依据。
1 资料与方法
1.1 材料与仪器 采用德国 Leica 公司广州分公司
的多种混合荧光染料染色蒿草切片， 蒿草切片制
片共有 18张，分为 A、B、C三组，每组 6张。A组用
普通荧光显微镜观察并拍照；B 组用激光扫描共聚
焦显微镜 λ扫描检测其的荧光光谱；C 组用激光扫
描共聚焦显微镜扫描其荧光图像。 Leica T CS SP5
II 激光扫描共聚焦显微镜（德国）；奥林巴斯 IX70
普通荧光显微镜（日本）。
1.2 普通荧光显微镜观察蒿草切片并拍照 蒿草
切片制片后置于奥林巴斯 IX70 荧光显微镜载物
台上， 分别以紫外光 （360~380nm）、 蓝光 （460-
基于激光共聚焦显微镜 λ扫描检测蒿草切片荧光光谱的研究
吴伟全 1，李元歌 2，王思捷 1，杨腾 1，吴平 1
(1、广东医学院临床医学研究中心，广东 湛江 524001；2、广东医学院附属医院放射科，广东 湛江 524001)
摘要：目的 研究激光扫描共聚焦显微镜 λ 扫描检测蒿草切片的荧光光谱， 为基于共聚焦显微镜获得生物医学样本的
荧光光谱提供理论和实验依据。方法 运用普通荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜分别观察荧光染色的蒿草切片，实验分
为三组：A 组用普通荧光显微镜观察并拍照；B 组用激光扫描共聚焦显微镜检测荧光光谱；C 组用激光扫描共聚焦显微镜扫
描荧光图像。 结果 荧光显微镜可以观察到蒿草切片的荧光图像，但不能准确获取其相应荧光激发和发射波长，而且会发生
串色干扰现象。 激光扫描共聚焦显微镜能对蒿草切片进行荧光光谱扫描，排除了干扰波长，获取其荧光激发和发射波长，得
到高清晰度的荧光图像。 结论 与普通荧光显微镜比较，激光扫描共聚焦显微镜有能准确获取样本荧光光谱，得到高清晰度
荧光图像的优点。
关键词：激光共聚焦显微镜；蒿草切片；荧光；光谱分析
中图分类号：R318.51 文献标识码：A 文章编号：1674-1129(2016)01-0021-03
DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.007
Study on the fluorescence spectrum of wormwood slice with laser scanning confocal microscope WU Weiquan1，LI Yuange2，
WANG Sijie1，YANG Teng1，WU Ping1. 1.Clinical Research Center，Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524001，
China；2.Radiology Department，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524001，China.
Abstract：Objective To study the fluorescence spectrum of wormwood slice with laser confocal microscope，and provide the
theoretical and experimental basis for obtaining the fluorescence spectrum of biomedical samples. Methods The fluorescence mi-
croscope and laser scanning confocal microscope were used to observe fluorescence of wormwood slice. The experiment included
three groups：group A，using fluorescence microscope to take photos；group B，using laser scanning confocal microscope to detect
fluorescence spectrum；group C，using laser scanning confocal microscope to obtain fluorescence image. Results The fluorescence
microscope could observe the fluorescence image of wormwood slice，but could not accurately obtain the corresponding fluores-
cence excitation and emission wavelength. The channeling color interference phenomenon was occurred. The laser scanning confo-
cal microscope could scan the fluorescence spectrum of wormwood slice，exclude the interference wavelength，obtain the fluores-
cence excitation and emission wavelength accurately and gather fluorescent image with high-resolution. Conclusion Compared
with the fluorescence microscope，the laser scanning confocal microscope can accurately obtain the fluorescence spectrum and
high-resolution fluorescence image of biomedical samples.
Key words： Laser scanning confocal microscope；The wormwood slice；Fluorescence；Spectral analysis
基金项目：广东医学院科研基金项目（M2014044）
作者简介：吴伟全，男，1978年5月生，硕士学位，助理研究员，主要
研究方向：共聚焦相关医学基础研究。E-mail:wwqjob@163.com
通信作者：吴平，主任技师，主要从事医学基础研究。
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实验与检验医学 2016 年 2 月第 34 卷第 1 期 Experimental and Laboratory Medicine, Feb.2016,Vol.34,No.1
490nm）、绿光（520-550nm）为激发光源激发样品，
观察图像， 图像由 Leica DFC295 数码摄像头拍摄
记录。
1.3 激光共聚焦扫描显微镜 λ扫描分析蒿草切片，
LAS 软件分析其荧光光谱 蒿草切片制片后置于
德国 Leica 公司的 TCS SP5 激光扫描共聚焦显微
镜的载物台上，调焦选择理想的扫描层面。 分别用
405nm、488nm、543nm等 3种波长激发光激发样品
进行 λ扫描分析。扫描模式为 xyλ，分辨率（format）
为 1024×1024；扫描速度(speed)为 200Hz；针孔大小
(pinhole)为 1Airy；放大倍数(zoom)为 1.0，接收的带
宽(Band Width)为 5nm。扫描蒿草切片的荧光光谱，
每张片扫描 3次。 采用 Leica LAS软件分析其荧光
光谱，获取其相应荧光激发和发射波长范围。
1.4 激光扫描共聚焦显微镜扫描获取蒿草切片荧
光图像 基于激光扫描共聚焦显微镜， 输入 Leica
LAS 软件分析获得的蒿草切片相应荧光激发和发
射波长，扫描方式（mode）为 XYZ；分辨率（format）
为 1024×1024；扫描速度(speed)为 200Hz；针孔大小
(pinhole)为 1Airy；放大倍数(zoom)为 1.0。 手动调节
Z 轴位置至清晰的焦平面， 扫描获取二维平面图
像。
2 结果
2.1 普通荧光显微镜观察蒿草切片的荧光图像
紫外光（波长 360~380nm）激发得到的蒿草切片蓝
色荧光图像；蓝光（波长 460~490nm）激发得到的
蒿草切片荧光图像，呈黄色，绿色光为主，与串色
的红色光叠加所致；绿光（波长 520~550nm）激发
得到的蒿草切片红色荧光图像。 （见图 1A、1B 和
1C）
2.2 激光扫描共聚焦显微镜 λ 扫描分析蒿草切片
的荧光光谱 用 405nm、488nm和 543nm波长激发
光分别激发样品进行 λ 扫描，LAS 软件分析光谱
峰值， 得到相应敏感的荧光发射波长范围分别为
490~510nm、510~530nm和 560~580nm。 （见图 2A、
2B和 2C）
2.3 激光扫描共聚焦显微镜扫描获取蒿草切片荧
光图像 用 405nm、488nm和 543nm波长激发光分
别激发样品， 对应使用其相应敏感的荧光发射波
长范围为 490-510nm、510-530nm 和 560-580nm，
分别可以得到清晰的蒿草切片共聚焦荧光图像
（见图 3A、3B和 3C）。
3 讨论
生物医学样本的荧光光谱已经成为研究其性
质和功能一个重要方法[4]。 但目前很多生物医学样
本的荧光光谱是未知的[5]。 随着生物医学的研究发
展，获取生物医学样本的荧光光谱，从而准确采集
生物医学样本的荧光图像在生物医学研究中越来
越重要。
荧光显微镜是研究生物医学样本的基本工
具，是用一定波长的光去激发标本，从而发射出荧
光， 然后通过物镜和目镜系统可以观察到标本的
荧光图像 [6-8]。 荧光显微镜可以观察到部分未知荧
光光谱的生物医学样本荧光图像， 但不能准确获
取其相应荧光激发和发射波长， 而且多种荧光染
注：A： 用 405nm 波长激发光激发样品进行 λ 扫描，LAS 软件分析
光谱峰值，得到相应敏感的荧光发射波长范围为 490~510nm；B：用
488nm 波长激发光激发样品进行 λ 扫描，LAS 软件分析光谱峰值，
得到相应敏感的荧光发射波长范围为 510~530nm， 而 560~580nm
为干扰波峰；C：用 543nm波长激发光激发样品进行 λ 扫描，LAS 软
件分析光谱峰值 ， 得到相应敏感的荧光发射波长范围为 560~
580nm。
图2 激光扫描共聚焦显微镜λ扫描分析蒿草切片的荧光光谱
注：A：紫外光（波长 360~380nm）激发得到的蒿草切片蓝色荧光图
像；B：蓝光（波长 460~490nm）激发得到的蒿草切片荧光图像，呈黄
色， 绿色光为主， 与串色干扰的红色光叠加所致；C： 绿光 （波长
520~550nm）激发得到的蒿草切片红色荧光图像。
图1 普通荧光显微镜观察并拍照（×40）
A B C
注 ：A： 用 405nm 波长激发光激发样品 ， 发射波长范围为 490~
510nm扫描得到的蒿草切片荧光图像；B： 用 488nm波长激发光激
发样品， 发射波长范围为 510~530nm扫描得到的蒿草切片荧光图
像；C：用 543nm波长激发光激发样品，发射波长范围为 560~580nm
扫描得到的蒿草切片荧光图像。
图3 激光扫描共聚焦显微镜扫描获取蒿草切片荧光图像（×100）
A B C
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料染色时会发生串色干扰现象[9]。 本研究中的普通
荧光显微镜图像结果也反映了这个现象。
激光扫描共聚焦显微镜是一种新型的先进的
光学显微镜，用激光做光源，采用共轭聚焦原理和
装置，避免了衍射光和散射光的干扰，并利用计算
机对所观察的对象进行数字图像处理观察、 分析
和输出，因而其图像清晰度高 [10-12]。 与普通荧光显
微镜相同样本的图像比较， 本研究显示激光扫描
共聚焦显微镜的图像清晰度较高， 与相关研究一
致[13，14]。 随着激光扫描共聚焦显微镜的快速发展，
其 λ 扫描功能可以扫描生物医学样本的荧光光
谱。 本研究通过 λ 扫描对生物医学样本进行光谱
扫描，再采用软件分析其荧光光谱，排除了干扰波
长，获取其相应的荧光激发和发射波长，并且根据
其激发和发射波长进一步扫描得到了高清晰度的
共聚焦荧光图像。
蒿草为一种草本植物，茎呈圆柱形。 其茎断面
结构清楚，荧光染色容易，制成切片很适合显微镜
观察[15]。本研究通过激光扫描共聚焦显微镜 λ扫描
检测蒿草切片的荧光光谱， 明确其相应荧光激发
和发射波长， 为生物医学样本荧光光谱分析提供
新思路， 为将来基于激光扫描共聚焦显微镜获得
生物医学样本的未知荧光光谱提供理论和实验依
据，具有一定的科学价值，社会、经济效益。
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(收稿日期 2015-11-11；修回日期 2015-12-30)
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