全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2010, 26(5):1037～ 1042
刘广勤 , 王鹏良 , 周蓓蓓 , 等.薄壳山核桃 SRAP标记体系的优化和遗传多样性分析 [ J] .江苏农业学报 , 2010, 26(5):
1037-1042.
薄壳山核桃 SRAP标记体系的优化和遗传多样性分析
刘广勤 1 , 　王鹏良 2 , 　周蓓蓓1 , 　吕智鹏 2 , 　王海燕2
(1.江苏省农业科学院园艺研究所 ,江苏 南京 210014;2.南京农业大学农学院 , 江苏 南京 210095)
收稿日期:2010-02-11
基金项目:中央财政林业科技推广示范基金项目(59911001)
作者简介:刘广勤(1965-),男 ,副研究员 ,研究方向:薄壳山核桃等干果
类品种选育与栽培。 (Tel)025-84391697, 13905180598;(E-
mail)liuguangqin@126.com。王鹏良为共同第一作者。
通讯作者:王海燕 , (Tel)025-8435344;(E-mail)hywang@njau.edu.cn
　　摘要:　为确立薄壳山核桃 SRAP-PCR反应体系 ,并对薄壳山核桃品种遗传多样性进行分析 , 以薄壳山核桃嫩
叶提取的 DNA为模板 ,进行 Mg2+、dNTP、引物和 TaqDNA聚合酶 4个因素 3个水平 [ L9(34)]正交试验 , 并比较了
不同浓度模板 DNA对 PCR扩增效果的影响。结果显示:薄壳山核桃的 SRAP-PCR最佳反应体系为 Mg2+ 2.5
mmol/L、dNTP0.20 mmol/L、引物 0.4μmol/L、TaqDNA聚合酶 1.5 U。 DNA模板最佳浓度为 10 ng利用最佳反应
体系对薄壳山核桃进行引物组合多态性筛选 ,从 90个引物组合中筛选出多态性引物组合 39个。 14个多态较高的
引物组合对 12个薄壳山核桃品种进行遗传多样性分析 ,通过 PCR扩增 , 得到 128个谱带 , 显示了较高的多态性 , 12
个供试薄壳山核桃品种的遗传背景具有丰富的多样性。表明 SRAP标记可应用于薄壳山核桃分子生物学研究。
关键词:　薄壳山核桃;SRAP标记;遗传多样性
中图分类号:　S634.3　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2010)05-1037-06
OptimizationofSRAPMarkerReactionSystemandGeneticDiversityfor
CaryailinoinensisKoch
LIUGuang-qin1 , 　WANGPeng-liang2 , 　ZHOUBei-bei1 , 　L Zhi-peng2 , 　WANGHai-yan2
(1.InstituteofHorticulture, JiangsuAcademyofAgriculturalScience, Nanjing210014, China;2.CollegeofAgriculture, NanjingAgriculturalUniversity,
Nanjing210095, China)
　　Abstract:　TheorthogonaldesignwasemployedtooptimizeaSRAP-PCRsystemwith4factors(Mg2+, dNTP, prim-
ersandTaqpolymerase)at3levels.TheeffectoftheconcentrationoftemplateDNAonPCRamplificationwascompared.
TheoptimizedSRAP-PCRsystemforCaryailinoinensisKochwas:1 μl10×PCRbufer, 10 ngtemplateDNA, 2.5
mmol/LMg2+, 0.20 mmol/ LdNTP, 0.4 μmol/Lprimer, and1.5 UTaqDNApolymeraseinatotalof10 μlreaction
solution.Thirty-nineprimerpairsoutofninetywerepolymorphicbytheoptimizedSRAP-PCR.Fourteenhighlypolymorphic
primerpairsyielded128 bandsamong12 peacans, showingarichgeneticdiversityinCaryailinoinensisKoch.Theresult
indicatedthatSRAPmolecularmarkercouldbewidelyusedingeneticdiversityanalysisofCaryaillinoinensisKoch.
Keywords:　CaryailinoinensisKoch.;SRAPmarker;geneticdiversity
　　相关序列扩增多态性(SRAP)是 2001年由 Li
和 Quiros开发的一种基于 PCR的新型分子标记技
术[ 1] 。与 RAPD、AFLP、SSR等标记方法相比 , SRAP
具有简单 、高效 、高共显性 、重复性好 、易测序等优
1037
点 [ 2-4] ,已经用于许多植物的种子纯度检测 ,杂种鉴
定 ,遗传多样性研究 ,指纹图谱及遗传连锁图的构
建等[ 5-15] 。
薄壳山核桃(CaryailinoinensisKoch)又名长
山核桃 、美国山核桃 ,为胡桃科山核桃属植物 ,落
叶乔木 , 原产于北美大陆 ,是世界著名的干果树
种之一 [ 16-17] 。薄壳山核桃分子标记方面的研究
已有一些报道 , Marquard等和 Ruter等用同功酶
研究了薄壳山核桃群体的遗传多样性 [ 1 8-23] ;Con-
ner等和张日清等利用 RAPD标记估计了其遗传
多样 ,并用于品种鉴定 [ 2 4-26] ;Grauke等将 SSR标
记用于薄壳山核桃的遗传研究 [ 2 7] 。 Sudheer等用
RAPD和 AFLP分子标记建立了薄壳山核桃的第
一张连锁图 [ 28] 。但至今尚未见 SRAP标记应用
于薄壳山核桃的报道 。本研究拟将 SRAP标记技
术应用于薄壳山核桃 ,进行体系优化并对 12个
薄壳山核桃品种进行遗传多样性分析 ,以期为利
用 SRAP标记对薄核山核桃进行分子生物学研究
奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
本试验材料为中林 1号 、马汉 、中林 3号 、金陵
1号 、YLJ23、赣选 1号 、茅山 1号 、威斯顿 、金陵 2
号 、赣选 2号 、黄山 1号和金华共计 12个薄壳山核
桃品种及对照假俭草 E042。SRAP引物采用郑轶琦
等[ 6]公开发表的序列 。
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取及检测　以薄壳山核桃
的嫩叶为材料 ,采用 CTAB法提取基因组 DNA,并
用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的质量和浓度。
最后将样品浓度稀释至 20 ng/μl。
1.2.2　PCR反应体系的正交设计　采用 L9(34)正
交设计 ,对 Mg2+、dNTP、引物和 TaqDNA聚合酶进
行 4因素 3水平筛选(表 1、表 2)。
表 1　SRAP-PCR体系的因素和水平
Table1　ThefactorsandlevelsofSRAP-PCRsystem
水平 Mg2+(mmol/L) dNTP(mmol/L) 引物 (μmol/L) TaqDNA聚合酶 (U)
1 1.5 0.15 0.20 0.5
2 2.0 0.20 0.30 1.0
3 2.5 0.25 0.40 1.5
表 2　SRAP-PCR正交设计
Table2　TheorthogonaldesignofSRAP-PCR
处理 Mg2+(mmol/L) dNTP(mmol/L) 引物 (μmol/L) TaqDNA聚合酶 (U)
1 1.5 0.15 0.20 0.5
2 1.5 0.20 0.30 1.0
3 1.5 0.25 0.40 1.5
4 2.0 0.15 0.40 1.5
5 2.0 0.20 0.20 0.5
6 2.0 0.25 0.30 1.0
7 2.5 0.15 0.30 1.0
8 2.5 0.20 0.40 1.5
9 2.5 0.25 0.20 0.5
1.2.3　PCR反应条件　根据表 1和 2制备总体积
为 10 μl的 PCR反应体系 ,除表中变化的因素外 ,每
管中还加入 2 μl10 ×PCRbufer和 10 ng的模板
DNA,所用引物组合为 Me5/Em7。 PCR扩增程序
1038 江 苏 农 业 学 报 　2010年 第 26 卷 第 5期
为:94 ℃预变性 4min;94℃变性 1min, 37℃退火 1
min, 72 ℃延伸 10 s, 5个循环;94 ℃变性 1 min, 50
℃退火 1 min, 72 ℃延伸 10s, 35个循环;72 ℃延伸
7 min, 4 ℃保存 ,扩增反应在 PTC-200 PCR仪上进
行 。扩增产物用 8%聚丙烯酰胺凝胶分离 ,快速银
染检测 。
1.2.4　模板 DNA浓度优化　利用最佳扩增体系 ,
将 DNA浓度进行优化 , DNA的浓度分别为 10 ng、
20 ng、40 ng、80 ng4个梯度进行试验 ,用以确定最
佳的 DNA浓度。引物组合为 Me5 /Em7。
1.2.5　SRAP引物组合多态性筛选　利用优化的
SRAP-PCR体系对 90个引物组合对 4个品种的
DNA进行多态性筛选 。
1.3　薄壳山核桃品种的遗传多样性分析
采用人工计带的方法进行电泳结果记录 ,清晰
可辨的电泳条带全部用于统计分析。根据扩增条带
的有无 ,迁移率相同的条带记为一个位点 ,扩增阳性
赋值为 1 ,阴性赋值为 0,弱带 、无带均为阴性。遗传
相似系数(GS)和遗传距离(GD)按照 Jaccard s法
计算 ,计算公式为:GS=Nxy/(Nx+Ny+Nxy), GD=1
-GS, 其中 Nx和 Ny分别为在品种 x和 y上的扩增
谱带数 , Nxy为品种 x和 y间共有谱带数。利用
DPS2000软件分析 ,采用非加权类平均法(UPGMA)
构建聚类图 。多态位点百分率 =多态性位点数 /检
测到的位点总数 ×100%,用于估算样品的遗传分化
水平。
2　结 果
2.1　薄壳山核桃 SRAP体系的优化
根据图 1薄壳山核桃 SRAP-PCR正交设计的试
验结果 ,再按照何正文 [ 29]和郑轶琦等 [ 6]分析方法 ,
对扩增结果进行直观分析 ,依据扩增条带的多少及
强弱 ,将 9个处理结果划分成 9个等级 ,得分最高的
为第 8泳道 ,该泳道的扩增产物条带数量多且清晰 ,
杂带少 ,扩增效果最好 。因此选择第 8泳道的扩增
体系作为薄壳山核桃的最佳扩增体系 ,即 10 μl的
PCR反应体系中 , Mg2+ 2.5 mmol/L, dNTP0.20
mmol/L,引物 0.4 μmol/L, TaqDNA聚合酶 1.5U。
　　为了明确 4个因素对 SRAP-PCR扩增的影响 ,
本文根据张丽等 [ 30]和郑轶琦等[ 6]的方法 ,对各组分
浓度组合的正交试验结果进行了统计分析 。结果表
明:在选定的 3个范围内 , Mg2+、dNTP、引物 、Taq
M:DNAmarker;1～ 9:见表 2。
图 1　SRAP-PCR扩增图谱
Fig. 1 　 Electrophoresis of SRAP-PCR according to
orthogonaldesign
DNA聚合酶 4个因素对结果的影响为:dNTP﹥
Mg2+﹥引物 =TaqDNA聚合酶。
2.2　薄壳山核桃 SRAP-PCRDNA浓度
在本研究确定的薄壳山核桃最佳的 SRAP-PCR
反应体系下 , 4个浓度 DNA都能扩增出产物;随着
DNA浓度的增加 ,扩增产物的条带逐渐减少;DNA
浓度为 10 ng时 ,扩增产物的条带数目较多且比较
清晰(图 2)。
1 ～ 4:DNA浓度分别为 10ng、20ng、40ng、 80ng。
图 2　不同DNA浓度扩增图谱
Fig.2　TheamplificationoftemplateDNAswithdiferentcon-
centrationsbySRAP-PCR
2.3　薄壳山核桃品种的遗传多样性
将 90个引物组合对假俭草品种 DNA进行
SRAP扩增 ,扩增结果显示:在多态性筛选的引物组
合中 , 66个引物组合能扩增出清晰稳定的谱带 ,占
总数的 73.3%,在有扩增产物的引物组合中 ,有多
态性的引物组合 39个 ,占总数的 43.3%。在 39个
引物组合中 ,挑选多态性高的 14个引物组合(表 3)
对 12个薄壳山核桃品种进行遗传多样性分析 ,通过
1039刘广勤等:薄壳山核桃 SRAP标记体系的优化和遗传多样性分析
PCR扩增出 128条谱带 , 平均每个引物组合产生
9.14个谱带 ,其中多态性谱带 99条 ,平均每个引物
组合产生 7.07个多态性谱带 ,不同引物组合间多态
性水平存在较大差异 ,多态性最低的引物组合为
Em6 /Me1,多态数目为 2, 多态最高的引物组合为
Em7 /Me5,多态数目为 12;每个引物组合产生多态
位点比例为 40.00% ～ 100.00%,平均多态位点比例
为 77.34%。
14个引物组合对 12个薄壳山核桃品种及对照
假俭草 E042进行 SRAP-PCR扩增 ,结果表明:13份
材料两两之间的相异系数为 0.111 1 ～ 0.827 2,平
均为 0.463 2,说明这些品种的遗传背景具有丰富
的多样性 。其中 ,金陵 2号和赣选 2号之间的相异
系数最小 ,仅为 0.111 1;金陵 1号和假俭草 E042
之间的相异系数最大 ,达 0.827 2。
　　采用 UPGMA法 ,对 12个薄壳山核桃品种进行
基于 SRAP标记的系统聚类分析 ,结果见图 3。从图
3可以看出 ,赣选 2号与金陵 2号最先聚一起 ,接着
先后与茅山 1号和中林 1号聚在一起形成一个分
支 ,而马汉与赣选 1号聚在一起形成另外一个分支 ,
两个分支又聚成一个大类 , 再接着先后与金华 、
YLJ23、黄山 1号 、金陵 1号 、中林 3号及威斯顿聚在
一起 ,最后与假俭草 E042聚在一起。
表 3　14个引物组合对 12个薄壳山核桃品种扩增结果
Table3　Theamplificationresultsof12varietiesofCaryailinoiensisKochwith14polymorphicprimercombinations
引物组合 谱带总数 多态带数 多态比例(%) 引物组合 谱带总数 多态带数
多态比例
(%)
em3/me14 6 6 100.00 em5 /me7 11 5 45.45
em3/me20 12 7 58.33 em6 /me1 4 2 50.00
em4/me1 13 11 84.62 em6 /me10 11 10 90.91
em4/me11 11 10 90.91 em6 /me16 6 4 66.67
em4/me9 4 4 100.00 em7 /me4 13 11 84.62
em5/me11 7 5 71.43 em7 /me5 13 12 92.31
em5/me5 8 7 87.50 em7 /me15 10 4 40.00
图 3　 12个薄壳山核桃品种及假俭草 E042UPGMA聚类图
Fig.3　UPGMAdendrogramof12 varietiesofCaryaillinoiensisKochandEremochloaophiuroidesE042
1040 江 苏 农 业 学 报 　2010年 第 26 卷 第 5期
3　讨 论
本文利用常用于 PCR体系优化的正交试验设
计 [ L9(34)]和直观分析法对 PCR反应中的 4个关
键因素进行分析 ,正交设计通过各因素的相互作用
得到最佳优化体系 ,与直观方法相结合能快速获得
满意的试验结果 ,减少处理组合 ,节约时间 ,减少工
作量 ,降低了试验成本 。但该方法也存在一定的局
限性 ,如对试验结果本身的评价带有主观成份 ,打分
的先后次序直接影响分析结果 ,使影响因素最佳反
应水平的确定缺乏可靠性[ 31-32] 。另外 , 试验设计
[ L9(34)]没有考虑各因素之间的交互作用[ 33] , PCR
反应不是一个孤立的部分 ,它和基因组 DNA提取 、
聚丙烯酰胺凝胶的制备 、银染等步骤构成了一个有
机的整体 , 每一步的变化都会导致试验结果的
差异[ 32] 。
不同的植物材料因其组织细胞中所含次生代谢
产物的种类 、含量不同 ,适合的提取方法也不同 。薄
壳山核桃组织细胞中含有较多的单宁 、酚类 、多糖及
色素等成分 [ 25] ,如果提取方法不当 ,会影响 DNA的
质量 ,进而影响 PCR反应 。本研究使用 CTAB法提
取薄壳山核桃的基因组 DNA,使用不同浓度 DNA
进行试验 ,结果表明 DNA浓度为 10 ng时 , PCR扩
增结果最好 ,随着 DNA浓度的增加 , PCR扩增产物
的条带减少 ,当 DNA浓度增加到 80 ng时 PCR反应
仅扩增出 1个条带。这个现象表明在提取的 DNA
中还存在少量影响 PCR扩增的杂质 , 另外说明当
DNA中存在少量影响 PCR反应的杂质时 ,可适当稀
释 DNA浓度 。
本试验对参试的 12个品种的聚类分析结果与
传统形态学分类结果基本吻合 ,如同为长圆柱形的
赣选 1号和马汉 ,以及同为椭圆形的赣选 2号与金
陵 2号 ,分别聚在一起 ,尤其是茅山 1号作为金陵 2
号的后代 ,他们之间的遗传距离较小 ,证实了其较近
的亲缘关系 。聚类结果很好地反映了供试品种间的
亲疏关系。因此 SRAP标记可以广泛地应用于山核
桃的分子生物学研究中 ,为山核桃的分子育种和基
因组研究提供了一种有力的工具。
参考文献:
[ 1] 　LIG, CFQ.Sequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP),
anewmarkersystembasedonasimplePCRreaction:itsapplica-
tiontomappingandgenetagginginBrasica[ J] .TheorAppl
Genet, 2001, 103:455-461.
[ 2] 　陈佩度.作物生物技术 [ M] .北京:中国农业出版社 , 2001.
[ 3] 　刘　明 ,王继华 ,王同昌.DNA分子标记技术 [ J].东北林业
大学学报 , 2003, 31(6):65-67.
[ 4] 　柳李旺 ,龚义勤 ,黄　浩 ,等.新型分子标记-SRAP与 TRAP及
其应用 [ J] .遗传 , 2004, 26(5):777-781.
[ 5] 　张建成 ,王传唐 ,焦　坤 ,等.SRAP标记技术在花生种子纯度
鉴定中的应用 [ J] .中国农学通报 , 2005, 21:35-39.
[ 6] 　郑轶琦 ,宗俊勤 ,薛丹丹 ,等.SRAP分子标记在假俭草杂交后
代真实性鉴定中的应用 [ J] .草地学报 , 2009, 17(2):
135-140.
[ 7] 　於朝广 ,殷云龙 , 徐建华.用 SRAP标记鉴定落羽杉属植物杂
种 [ J] .林业科学 , 2009, 45(2):142-146.
[ 8] 　文雁成 ,王汉中 ,沈金雄 ,等.用 SRAP标记分析中国甘蓝型油
菜品种的遗传多样性和遗传基础 [ J] .中国农业科学 , 2006,
39(2):246-256.
[ 9] 　文雁成 ,王汉中 ,沈金雄 ,等.SRAP和 SSR标记构建的甘蓝型
油菜品种指纹图谱比较 [ J] .中国油料作物学报 , 2006, 28
(3):233-239.
[ 10] 王　刚 ,潘俊松 ,李效尊 ,等.黄瓜 SRAP遗传连锁图的构建及
侧枝基因定位 [ J] .中国科学(C辑), 2004, 34(6):510-516.
[ 11] 林忠旭 ,张献龙 ,聂以春 ,等.棉花 SRAP遗传连锁图构建 [ J].
科学通报 , 2003, 48:1676-1679.
[ 12] 金梦阳 ,刘列钊 ,付福友 ,等.甘蓝型油菜 SRAP、SSR、AFLP和
TRAP标记遗传图谱构建 [ J] .分子植物育种 , 2006, 4(4):
520-526.
[ 13] 张　旭 ,邢锦城 ,陈健华 ,等.利用 SRAP分子标记研究美洲海
莲子实生群体遗传多样性 [ J] .江苏农业学报 , 2009, 25(6):
1252-1257.
[ 14] 叶晓青 ,张　旭 , 佘建明 , 等.百喜草体细胞低温筛选变异体
SRAP分子标记 [ J] .江苏农业学报 , 2009, 25(5):1196-1198.
[ 15] 卢政辉.秀珍菇及其近缘 22株菌株的 SRAP分析 [ J] .江西农
业学报 , 2008, 20(11):8-10, 13.
[ 16] 吴耕民.中国温带落叶果树 [ M] .杭州:浙江科学技术出版社 ,
1993:719-729.
[ 17] 董凤祥 ,王贵禧.薄壳山核桃引种及栽培技术 [ M] .北京:金盾
出版社 , 2003.
[ 18] MARQUARDR.Isozymeinheritance, polymorphism, andstabili-
tyofmalatedehydrogenaseandphosphoglucoseisomeraseinpecan
[J] .JAmSocHorticSci, 1987, 112:717-721.
[ 19] MARQUARDR.Rarealozymesofmalatedehydrogenaseinpecan
[J] .HortScience, 1989, 24:156.
[ 20] MARQUARDR.Inheritanceofphosphoglucomutaseisozymesin
pecan[J].HortScience, 1991, 26:1213-1214.
[ 21] MARQUARDR, GRAUKEL, THOMPSONT, etal.Identifying
pecancultivarsbyisozymesandinheritanceofleucineaminopepti-
dase[ J] .JAmSocHorticSci, 1995, 120:661-666.
[ 22] RUTERB, HAMRICKJ, WOODB.Geneticdiversitywithinprov-
enanceandcultivargermplasmcolectionsandwildpopulationsof
1041刘广勤等:薄壳山核桃 SRAP标记体系的优化和遗传多样性分析
pecan[ J] .JHered, 2000, 90:521-528.
[ 23] RUTERB, HAMRICKJ, WOODB.Outcrossingratesandrelat-
ednessestimatesinpecanpopulations[ J].JHered, 2001, 91:
72-75.
[ 24] CONNERP, WOODB.Identicationofpecancultivarsandtheir
geneticrelatednessasdeterminedbyrandomlyampliedpolymor-
phicDNAanalysis[ J] .JAmSocHorticSci, 2001, 126:474-480.
[ 25] 张日清 ,何　方 , 吕德芳 ,等.美国山核桃群体遗传多样性的
RAPD分析 [ J].经济林研究 , 2001, 19(2):1-6.
[ 26] 张日清 , 吕德芳 , 谭晓风 , 等.美国山核桃主要栽培品种的
RAPD鉴定[ J] .经济林研究 , 2004, 22(4):1-5.
[ 27] GRAUKEL, IQBALM, REDDYA, etal.Developingmicrosatel-
liteDNAmarkersinpecan[ J].JAmSocHorticSci, 2003, 128:
374-380.
[ 28] SUDHEERR, SUEK, BRUCEW, etal.Afirstlinkagemapof
pecancultivarsbasedonRAPDandAFLPmarkers[ J].TheorAp-
plGenet, 2005, 110:1127-1137.
[ 29] 何正文 ,刘运生 ,陈立华 ,等.正交设计直观分析法优化 PCR
条件[ J] .湖南医科大学学报 , 1998, 23(4):403-404.
[ 30] 张　丽 , 周兰英 ,肖千文 , 等.正交试验设计在建立杜鹃花
RAPD-PCR反应体系中的应用 [ J] .北方园艺 , 2007(5):124-
126.
[ 31] 穆立蔷 ,刘赢男 ,冯富娟 ,等.紫椴 ISSR-PCR反应体系的建立
和优化 [ J] .林业科学, 2006, 42(6):26-31.
[ 32] 谭碧玥 ,王源秀 ,徐立安 ,等.杨树基因组 SRAP扩增体系的建
立与优化 [ J] .林业科技开发 , 2009, 23(2):25-29.
[ 33] 郑轶琦 ,王志勇 , 郭海林 , 等.正交设计优化假俭草 SRAP-
PCR反应体系及引物筛选 [ J].草业学报 , 2008, 17(4):
110-117.
1042 江 苏 农 业 学 报 　2010年 第 26 卷 第 5期