全 文 ：从废弃啤酒酵母细胞提取乙醇脱氢酶的新工艺*
收稿日期: 1999— 10— 18
* 1995年福建省自然基金项目
李夏兰　蔡婀娜　王丽娜
(华侨大学化工系 ,泉州 , 362011)
用细胞破碎与两水相萃取相结合的新工艺从废弃的啤酒酵母细胞中提取乙醇脱
氢酶 ,探讨了影响破碎萃取效率的因素 ,确定了破碎萃取的最佳工艺条件。
关键词: 废弃啤酒酵母 ,破碎 ,萃取 ,两水相
　　乙醇脱氢酶 (简称 ADH)是一种广泛专
一性的含锌金属酶。该酶是胞内酶 ,一般的细
胞破碎法易使其含有四个亚基的高级结构遭
到破坏。作者探讨了双水相与细胞破碎相结
合的新工艺 ,即将细胞破碎和双水相萃取同
时进行 ,利用聚乙二醇 ( PEG)及 ( N H4 ) 2 SO4
对 ADH的保护作用避免细胞破碎过程中酶
活的损失 ,从而达到简化纯化步骤和提高酶
收率的双重目的。 从成份复杂的废弃啤酒酵
母细胞提取乙醇脱氢酶在国内还未见报道。
1　材料与方法
1. 1　材料: X HF- 1高速分散器 (上海金达
生化仪器厂 ) , 722光栅分光光度计 (上海第
三仪器分析厂 ) ,牛血清蛋白 (上海长阴生化
制药厂 ) ,辅酶Ⅰ (上海浦江应用生物化学研
究所 ) ,废弃啤酒酵母 (福建泉州清源啤酒厂
提供 ) ,其他试剂均为市售 ,纯度为化学纯。
1. 2　方法
( 1)蛋白质测定: 采用 Bradford的考马
斯亮兰法 [2 ]。 以考马斯亮兰 G250为蛋白结
合物 ,在 595nm下比色 ,用牛血清蛋白为标
准品。
( 2) ADH的测定: 采用 Vallee& Hoch
法 [3 ]。 在 340nm处测定 ADH催化乙醇脱氢
生成乙醛所用的酶量。 定义一个 ADH单位
相当于在 pH8. 8、 25℃时每分钟还原 1μml
所需的酶量。
( 3)破碎萃取 ADH的新工艺
将废弃的啤酒酵母细胞用蒸馏水洗涤数
次 , 104RPM离心后用 1. 2M , pH6. 50山梨醇
溶液 ( pH6. 50, 0. 01M磷酸缓冲液配制 )浸泡
30min,离心后收集细胞 ,在 10ml的离心管
中将废弃啤酒酵母、 PEG、 ( N H4 ) 2 SO4、 0.
05mM巯基乙醇配成 10g系统 ,不足部分用
pH6. 50, 0. 01M的磷酸缓冲液补足 ,用高速
分散器 4× 2000r /m破碎萃取 30S, 104 r /m
离心 20min,静置分层。测上下相的 ADH酶
活 ,蛋白质含量及两相体积。实验过程中均采
用重量法配制溶液。系统中所有组分的含量
都采用单组分在系统的重量百分比浓度计
算。有关计算公式为: ADH分配系数 Ke= 上
相酶活 Ct /下相酶活 Cb,总蛋白分配系数
Kp= 上相总蛋白含量 /下相总蛋白含量 ,相
比 R= 上相体积 V t /下相体积 Vb, ADH萃
取率η= Rke /Rke+ 1。
2　结果
2. 1　破碎萃取系统的初步确定
2. 1. 1　单独加入 PEG对酵母细胞破碎的影
响
生物技术 9( 2): 42— 45, 1999
Biotechno logy
DOI : 10. 16519 /j . cnki . 1004 -311x . 1999. 02. 014
选择 PEG400, 600, 1000, 1540, 2000,
4000, 6000进行实验。在酵母细胞为 1g , PEG
浓度为 20% , pH6. 50,不加 ( N H4 ) 2 SO4和
NaCl的条件下实验 ,考察单独加入 PEG时
其分子量对细胞破碎效率的影响 ,其实验结
果如图 1。
从理论可知 ,单独加入 PEG系统不能形
成两相。 但 PEG的加入对 ADH有保护作
用。当加入的 PEG分子量小于 1000时 ,
ADH活性比不加 PEG时高 ,最高可达 8.
90u /ml,当 PEG分子量达到 2000以上时 ,
ADH活性迅速下降到 2. 0u /m l左右 ,最后
保持在较平稳的状态。 这主要是因为随着
PEG分子量的增大 ,系统的粘度增大 ,破碎
细胞的阻力增加 ,破碎细胞的效率下降。同时
随着 PEG分子量增大 ,对 ADH的沉降作用
增强。双方面共同作用使得 ADH活性下降。
因此确定 PEG400进行下面实验。
2. 1. 2　单独加入 ( N H4 ) 2 SO4浓度对酵母细
胞破碎的影响
在酵母细胞用量为 1g , pH6. 50,不加
PEG和 NaCl的条件下进行实验 ,实验结果
如图 2。 实验结果与 2. 2. 1一致 ,加入
( N H4 ) 2 SO4溶液对 ADH有保护作用 , ADH
活性最高可达 8. 32u /m l。但当 ( N H4 ) 2 SO4浓
度大于 10%时 ,由于 ( N H4 ) 2 SO4的盐析作
用 , ADH被沉淀析出 ,因此溶液的 ADH活
性下降。
图 1　单独加入 PEG对破萃的影响 图 2　单独加入 ( N H4) 2 SO4对破碎的影响
图 3　 PEG400浓度对破碎萃取的影响
　　萃取破碎时 ,单位重量相系统中 ,酵母细 胞的加入量是一个重要参数。从经济上考虑
43李夏兰等:从废弃啤酒酵母细胞提取乙醇脱氢酶的新工艺
2. 2　影响破碎取新工艺因素
2. 2. 1　 PEG400的浓度对破碎萃取的影响
在 ( N H4 ) 2 SO4浓度 16% , pH6. 50,酵母
细胞为 0. 9g , NaCl加入量为 0. 9%条件下实
验。 根据相图 [ 4] ,选择 PEG400的浓度为
17%— 35%进行实验 ,实验结果见图 ( 3)。
由图可知 ,随着 PEG400浓度的增大 ,
Ke、η都先减少后增加。在浓度为 20%时 , Ke
较大 ,而 Kp为 2. 4. 3,η为 97. 8%。 PEG400
浓度低于 18%时 ,系统无法形成两水相。 当
PEG400的浓度增大时 , PEG的空间位阻占
主导地位 , PEG对 ADH的沉降作用增强 ,此
时 Ke减少 , Kp也减少。 因此确定 PEG400
浓度为 20%最佳。
2. 2. 2　 ( N H4 ) 2 SO4浓度对破萃取的影响
在 PEG400为 20% , pH6. 50,酵母细胞
为 0. 9g , NaCl加入量为 0. 9%的条件下实
验。 根据 相图及 2. 1. 2的结 果 ,选 择
( N H4 ) 2 SO4浓度为 16%— 24%进行实验。实
验结果见图 ( 4)。 由图可知 ,随着 ( N H4 ) 2 SO4
浓度的增大 , Ke、η减少 , Kp增大。 因为
( N H4 ) 2 SO4浓度增大 , ADH盐析而沉淀。同
时实验观察到 ( N H4 ) 2 SO4浓度小于 18%时 ,
菌体细胞碎片分配在下相 ,而 ( N H4 ) 2 SO4浓
度大于 18%时 ,菌体细胞碎片分配于两水相
界面及上相 ,不利碎片的分离。 综合考虑 ,则
确定 ( N H4 ) 2 SO4浓度为 16%最佳。
图 4　 ( N H4) 2 SO 4浓度对破碎萃取的影响
2. 2. 3　 pH对破碎萃取的影响
在 ( N H4 ) 2 SO4 为 16%时 , PEG400为
20% ,酵母细胞为 0. 9g , NaCl加入量为 0.
9%进行实验。实验结果如图 5。由图可知 ,在
pH6. 50时 , Ke最大。 pH主要影响 Ke、 Kp,
对η影响不大。 pH过高过低 ,破坏了 ADH
的四亚基的高级结构 ,使 ADH单位降低。
图 5　 pH对破碎萃取的影响
2. 2. 4　酵母量对破碎萃取的影响
在 PEG为 20% , ( N H4 ) 2 SO4为 16%时 ,
pH为 6. 34, NaCl加入量为 0. 9%的条件下
实验 ,实验结果如图 6。
44 生　物　技　术　　　　　　　　　　　　 9卷 2期
希望加入量越多越好。从 Albertsson理论可
知 [4 ] ,酵母用量并不影响 Ke。 但实验结果表
明 ,酵母用量超过 0. 8g时 , R、 Ke、η都下降。
而 Kp升高。因此确定酵母量为 0. 8g时为最
佳 ,此时 Ke最大。
图 6　酵母量对破碎萃取的影响
2. 2. 5　 NaCl对破碎萃取的影响
在 PEG400为 20% , ( N H4 ) 2 SO4为 16%
时 , pH为 6. 34,酵母细胞为 0. 9g时进行实
验 ,实验结果如图 7。
由图可知 ,随着 NaCl浓度的增大 , Ke、
Kp、η都是先增加后减少。当 NaCl浓度为 0.
7%时 , Ke最大可达 18. 01,η为 96. 02% ,与
NaCl加入量为 0. 9%相比 , Ke、η都有所提
高 ,所以在两水相萃取破碎时 ,加入 0. 9%的
NaCl为佳。 NaCl的加入这是因为 Na+ 、 Cl+
在两相中的不等分配引起两相电位差 ,从而
改变了 Ke[4 ]。
图 7　 NaCl对破碎萃取的影响
2. 3　两种工艺的比较
传统的工艺 (Ⅰ )一般是先破碎细胞再萃
取所需物质 (有关实验数据将另文发表 )。 而
新工艺 (Ⅱ )是将细胞破碎与物质的萃取相结
合。利用高速分散器对液相剪切既达到细胞
破碎又可达到的目的。将两工艺相比较 ,实验
结果如下表。
从表 1可看出 ,两工艺的 Ke、 Kp、η没有
很大的区别 ,传统工艺的 Ke、 Kp、η指标较好。
但最重要的是新工艺的上相的 ADH及η明
表 1　两种工艺萃取结果的比较
批号 Ke Kp η
ADH活性
( u /ml )
Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ
1 21. 87 18. 10 1. 71 2. 31 98. 5 89. 4 10. 25 17. 75
2 21. 85 18. 75 1. 29 2. 43 98. 6 88. 7 11. 78 18. 75
3 20. 57 18. 50 1. 65 2. 87 97. 9 89. 9 8. 89 16. 45
(下转封二 )
45李夏兰等:从废弃啤酒酵母细胞提取乙醇脱氢酶的新工艺
(接第 34页 )
PREPARATION AND MAIN
PROPERTIES OF STEARIC ACID- MODIFIED
HORSERADISH PEROXIDASE
Ma Jianmin　 Zhang Jinyu　Wang Lin　
Wang Linsong　 Shao Qiang　 Xu Cunshuan
( Departmen t of Biology , Hanan Normal Universi ty , X inx iang , 453002)
A method for the chemical modi fica tion of ho rseradish peroxidase ( HRP) is repo rted.
HRP was modified by stearic acid- HRP show s enhanced stabili ty to heat , pH changes, pro-
tein denatural ag ent and trypsin deg rada tion
Key Words: s tearic acid, chemical modi fication, ho rseradish , peroxidase
(接第 45页 )
显高于传统工艺的指标。这是由于在破碎时
加入了对 ADH有保护作用的 PEG及
( N H4 ) 2 SO4 ,避免了细胞单独破碎时 ADH的
损失。 新工艺最大的优点的缩短了下游加工
的步骤 ,减少设备投资 ,提高 ADH的萃取
率。
参考文献
[1 ]Bradford h. . Anal. Bioch em. , 1976, 72: 248- 254
[2 ]施特尔马赫 . 酶的测定方法 ,钱嘉渊译 ,上海:上海科学
技术出版社 , 1983, 49— 50
[3 ]李夏兰 . 用 PEG /( N H4 ) 2 SO4两水相系统从全缪液萃
取糖化酶 ,华侨大学学报 , 1998, 19( 4)
[4 ] Alb ert ss on P. A. Particles of Cell Particles and Macro-
molecules , 1986, , wi ley, N. Y.
NEW TECHNOLOGY OF EXTRACT ALCOHOL
DEHYDROGENASE FROM ABOLISH YEAST
Li Xialan　 Cai Erna　Wang Lina
(Dept . of Chem . B iochem. Eng . , Huaqiao Univ. , Quan Zhou , 36201)
　　 The new techno log y that aqueous two- phase ex t raction and cell disruption were com-
bined and performed was studied. Alcohol Dehydrogenase( ADH) was ex t raction from abo lish
yeast by the new tech nolog y. An inquiry is made about the facto rs of influencing the ef fects
on the new techno logy. The optimal opera tional condition w as determined
Key Words: the new technolog y, ADH, abo lish yeast