全 文 ：浙 江 农 林 大 学 学 报， 2013， 30（1）： 1 - 8
Journal of Zhejiang A＆ F University
山核桃 FLOWERING LOCUS C同源基因鉴定与表达分析
杨希宏， 黄有军， 陈芳芳， 黄坚钦
（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地， 浙江 临安 311300）
摘要： 根据本课题组对山核桃 Carya cathayensis 花芽 454 测序获得的 CcFLC 基因的 2 个开放阅读框（ORF）分别设计
引物并进行聚合酶链式反应（PCR）扩增， 获得开放阅读框大小分别为 639 bp和 612 bp， 编码 212个和 203个氨基酸，
GenBank 登录号分别为 JQ829074 和 JQ829075， 都具有典型的 MADS-box 结构域， 核苷酸和氨基酸序列同源性分别
为 78%和 67%， 5′端高度同源， 3′端差异较大。 与太行花 Taihangia rupestris 和梨 Pyrus pyrifolia 等物种的 FLC-like
基因的氨基酸序列同源性达到 40%~57%。 氨基酸疏水性分析显示， 它们的羧基端都是疏水性氨基酸， 而氨基端是
亲水性氨基酸， 大部分氨基酸残基是疏水性的。 实时定量 PCR 结果显示： CcFLC 基因的 2 个开放阅读框在山核桃
的营养枝的幼茎、 幼叶、 顶芽， 以及短果枝的雌花芽和雄花芽中都有表达， 但相对表达量存在较大差异， 同一组
织中 ORF1 的表达丰度明显高于 ORF2。 ORF1 表达量在茎中最高， 但在叶和雄花芽的表达量最低； ORF2 在雌花芽
中相对表达量最高， 茎中表达量最低。 图 7参 23
关键词： 植物学； 山核桃； CcFLC； 序列分析； 表达分析
中图分类号： S664.1； Q943 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2013）01-0001-08
Identification and expression of FLOWERING LOCUS C
homologous genes in Carya cathayensis
YANG Xihong， HUANG Youjun， CHEN Fangfang， HUANG Jianqin
（ The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang A & F University，
Lin’an 311300， Zhejiang， China）
Abstract： Based on two open reading frames （ORFs） of Carya cathayensis FLOWERING LOCUS C （CcFLC）
genes which were acquired from 454 sequencings of Carya cathayensis buds， primers were designed and am-
plified with polymerase chain reaction （PCR）. An amino acid hydrophobicity analysis was also conducted. Ac-
quired the sequencing revealed 639 bp and 612 bp， coded 212 amino acids and 203 amino acids， and Gen-
Bank accession numbers of JQ829074 and JQ829075， respectively. These had typical MADS-box structures
with a nucleotide homology of 78% and an amino acid homology of 67%. The 5′ end homology was high， but
there was a big difference in the 3′ end. Compared to amino acids coded from the FLOWERING LOCUS C
（FLC）-like genes of Taihangia rupestris and Pyrus pyrifolia， the two ORFs were 40%-57% similar. Amino
acid hydrophobicity analysis showed that carboxyl terminals were hydrophobic amino acid and amino terminals
were hydrophilic amino acid with most amino acid residues being hydrophobic. Results of the Real-time PCR
showed that the two ORFs of the CcFLC gene were expressed in the stem， young leaf， terminal bud， female
flower， and male flower of C. cathayensis， but their relative expression for the same tissue was higher for
ORF1 than ORF2. ORF1 was maximum in the stem， but minimum in the leaf and male flower; whereas ORF2
was maximum in the female flower and minimum in the stem. ［Ch， 7 fig. 23 ref.］
Key words： botany； Carya cathayensis； CcFLC； sequence analysis； expression analysis
收稿日期： 2012-03-01； 修回日期： 2012-04-18
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（31170637）； 浙江省自然科学基金资助项目（Z307534）
作者简介： 杨希宏， 从事分子生物学研究。 E-mail： xihong0408@163.com。 通信作者： 黄坚钦， 教授， 博士，
从事植物发育生物学研究。 E-mail： huangjq@zafu.edu.cn
浙 江 农 林 大 学 学 报 2013 年 2 月 20 日
植物成花是营养生长向生殖生长转变的过程， 这一转变主要由外界环境因子和植物自身内环境以及
植物特异基因启动表达决定 ［1］。 FLOWERING LOCUS C（FLC）是调控植物开花时间的开关基因， 它属于
MADS-box 家族编码一种新的蛋白转录因子， 对开花具有抑制作用 ［2－3］。 在拟南芥 Arabidopsis thaliana 调
控开花途径有光周期途径， 春化途径和自主、 赤霉素（GA）和 FRI 依赖途径 ［4－5］。 在拟南芥早花生态型和
晚花生态型植株中， FLC编码的产物完全一致， 但它们生长习性不同， 前者无需低温就能开花， 而后者
需要低温处理才能开花。 这种差异可能是由于 FLC 等位基因内含子 1 的差异引起的， FLC 内含子 1 中
含有重要的开花表达和调控序列， 在早花生态型 FLC 内含子 1 中插入了 1 个独立的转座子， 可能破坏
了 FLC 的功能［6］。 植物中 FLC 通常存在多个同源基因， 如不结球白菜 Brassica campestris 有 BcFLC1［7］，
BcFLC3［8］等。 山核桃 Carya cathayensis 是重要的用材树种和生态经济树种。 由于雌雄花器官发育存在时
空差异， 雄花芽发育期导致雌花芽大量脱落， 直接影响了山核桃的产量。 FLC 作为春化作用调控开花时
间的关键基因， 对植物开花控制起决定性的作用。 为了更好地研究 FLC 对山核桃成花的调控， 本实验
对山核桃雌花芽 454 测序获得的 2个完整 FLC开放阅读框（ORF）从序列同源性和表达水平上开展分析对
比， 研究这 2 个 FLC 同源基因一级结构和二级结构的组成和特性差异， 用实时定量聚合酶链式反应
（PCR）技术研究它们在生殖转变阶段的不同时期、 不同组织上的表达差异， 为进一步利用该基因开展山
核桃花芽分化调控机理提供理论依据和借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
山核桃试验材料采自临安市板桥村， 选取 1 株生长旺盛的山核桃树， 从 2010 年 11 月至 2011 年 4
月中旬进行采样， 前期间隔 7～15 d， 后期间隔 7 d， 分别采取其营养枝的幼茎、 幼叶、 顶芽， 以及短果枝
的雌花芽和雄花芽， 立即用液氮保存并带回实验室放置－70 ℃冰箱中保存， 用于核糖核酸（RNA）提取， 并
记录采样当天的温度（图 1）。 Taq DNA聚合酶， 限制性内切酶， 胶回收试剂盒和反转录试剂盒， PMD19-T 载
体， 标记物（marker）， SYBR Green I Premix Ex Taq均购自 TAKARA生物公司， 大肠埃希菌 Escherichia coli
DH5α由亚热带森林培育国家重点实验室培育基地保存， X-Gal， IPTG和氨苄青霉素（Amp）购自上海生工。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA提取与反转录 cDNA 合成 采用改良十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取山核桃不同组
织的总 RNA， 用 10 g·L－1的琼脂糖凝胶电泳检测， 使用 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver2 反转录试
剂盒合成 cDNA。
1.2.2 聚合酶链式反应（PCR）扩增与测序 根据本课题组对山核桃雌花芽 454 测序获得的 CcFLC 基因 2
个 ORF 序列分别设计 PCR 引物， ORF1 上游引物 F1： 5′-ATGGGAAGGGGAAAAGTGCAG-3′和下游引物
F2： 5′-TTAAAACAGATGGAGCATGGCC-3′； ORF2 上游引物 F3： 5′-ATGGGAAGGGGAAAGGTGC-3′和下
游引物 F4： 5′-TTAAAACAGATTAAGCAAGGTTTCTTG-3′， 并由上海生工合成。 以山核桃 cDNA 为模板
进行 PCR扩增。 PCR 反应条件为： 94 ℃预变性 3 min； 94 ℃， 30 s； 59 ℃（57 ℃） 退火 45 s； 72 ℃，
1.30 min； 35 个循环； 72 ℃延伸 10 min； 4 ℃， ∞。 反应体系为： cDNA（0.15 μg·L－1）模板 2 μL， 10 ×
PCR buffer（无 Mg2+）5 μL， 25 mmol·L－1 氯化镁 4 μL， 10 mmol·L－1脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 1 μL， 上
图 1 山核桃组织不同日期采样温度记录
Figure 1 Temperature record of the different tissues and time of Carya cathayensis
2
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游引物（10 μmol·L－1） 1 μL， 下游引物（10 μmol·L－1）1 μL， Taq DNA 聚合酶 0.5 μL， 重蒸水（ddH2O） 50
μL。 PCR产物经胶回收纯化与 PMD19-T 载体连接转化到大肠埃希菌经过蓝白斑筛选， 提取质粒酶切鉴
定后， 送上海生工测序。
1.2.3 CcFLC基因序列分析 测得 CcFLC序列利用美国国立生物技术信息中心（NCBI）搜索进行 Blast 同
源性比对和氨基酸序列推导； 借助 ExPASy数据库中的 ProParam在线工具分析其编码蛋白的理化性质和
亲疏水性； 用 Clustalx 1.83软件进行蛋白序列比对； 用 MAGA4.0软件构建系统进化树。
1.2.4 CcFLC 基因组织特异性表达 以 PCR 扩增测得的 CcFLC 基因保守序列设计实时定量 PCR 引物，
ORF1 上游引物 F5： 5′ -ATTGCTGTCCGCCAGAGTGC-3′和下游引物 F6： 5′ -TGGTGGTTGTCGTTGAG-
GTTC-3′； ORF2 上游引物 F7： 5′-CGCACTACGAAGAGGAAAAGC-3′和下游引物 F8： 5′-CAGATTAAG-
CAAGGTTTCTTGG-3′。 以本课题组提供的 Actin 为内参， 其定量引物序列为 actinL： 5′-GCTGAACGGGA
AATTGTC-3′， actinR： 5′-AGAGATGGCTGGAAGAGG-3′。 在 Bio-RAD 荧光定量 PCR 仪上进行， 并分析
实验数据。
2 结果与分析
2.1 CcFLC基因 cDNA序列测序与分析
以山核桃 cDNA 为模板， 用引物 F1， F2 和引物 F3， F4 分别对 CcFLC 的 2 个保守结构域进行 PCR
扩增， 通过测序获得了 CcFLC 的 2 个 ORF 序列（GenBank 登录号分别为 JQ829074， JQ829075）， 长度分
别为 639 bp 和 612 bp， 并各含 1 个 TAA 终止密码子， 编码 212 个和 203 个氨基酸（图 2）。 Blanst 比对
结果显示， 这 2 个 ORF 在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别是 78% 和 67%， 5′端具有高度保守性， 3′
端序列差异较大。 对这 2 个基因进行保守结构域功能分析， 发现该 2 个 ORF 具有典型的 MADS-box 结
构域， 其蛋白都属于典型的 MIKC 型 MADS-box 基因蛋白， 具有 2 个保守结构域， 即 MADS-box 和 K-
box（图 3）。 其中 ORF1 编码蛋白的 1～70 位氨基酸和 ORF2 编码蛋白的 1～73 位氨基酸是 MADS 结构域，
蛋白中部分别是 12 个氨基酸 K-box（AA112～123）和 9 个氨基酸 K-box（AA118～131）。 ORF1 的 MADS 区
和 K区之间为 42 个氨基酸的 I区， ORF2 的 MADS区和 K区之间为 45个氨基酸的 I区， I-box和 3′端均
不保守， 表明它们都属于 MADS-box 家族中的成员。 蛋白理化性质分析显示， 它们的相对分子量分别为
图 2 CcFLC编码区核苷酸序列及其氨基酸序列
Figure 2 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of CcFLC
杨希宏等： 山核桃 FLOWERING LOCUS C同源基因鉴定与表达分析
CcFLC OPF1 编码的氨基酸
CcFLC OPF2 编码的氨基酸
3
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50 453.4 D和 23 823.5 D， 等电点（PI）为 5.17 D和 5.96 D。 蛋白质疏水性分析， 发现 CcFLC 的 2 个 ORF
编码的蛋白质都有较强的亲水性， 在羧基端主要是疏水性氨基酸， 而氨基端主要是亲水性氨基酸， 大部
分氨基酸残基是疏水性氨基酸（图 4）。 蛋白跨膜区分析显示， 它们都没有跨膜结构域， 推测不可能是膜
结合蛋白或定位于膜上。
2.2 山核桃 CcFLC cDNA序列同源性分析
在 NCBI（美国国立生物技术信息中心）上搜索已报道其他物种同源序列与 CcFLC的 2个 ORF编码的
蛋白序列进行比对（图 5）。 结果显示： ORF1， ORF2与太行花 Taihangia rupestrisABO61200.1（TrMADS3），
梨 Pyrus pyrifolia BAI99733.1（PpFLC）， 葡萄 Vitis vinifera BAI99733.1（VvFLC）， 柑橘 Citrus trifoliate ACB
72864.1（CtFLC）， 杨树 Populus trichocarpa XP_002303784.1（PtFLC）， 拟南芥 Arabidopsis thaliana ACL93428.1
（AtFLC）， 水稻 Oryza sativa AAF04972.1（OsMADS18）， 毛竹 Phyllostachys edulis ACO53802.1（PprMADS）和甜
菜 Beta vulgaris ABC55428.1（BvFLC）等植物 FLC 氨基酸序列同源性高达 68%~78%。 ORF1 和 ORF2 氨基
酸序列与太行花 ABO61200.1（TrMADS3）和梨 BAI99733.1（PpFLC）的亲缘关系最近， 与太行花 TrMADS3
氨基酸同源性分别为 53%和 57%， 与梨 PpFLC 的同源性分别为 52%和 56%； 与水稻 AAF04972.1（Os-
MADS18）同源性只有 39%～40%。 由此可见， 比对的物种间该基因编码的氨基酸序列在进化过程中存在
一定差异。
2.3 不同物种 FLC基因系统进化分析
应用 MEGA 4.0 对 CcFLC 的 2 个 ORF 与其他物种 MADS-box 基因家族编码的氨基酸序列进行系统
进化树聚类分析（图 6）。 结果表明： CcFLC 基因的 2 个 ORF 聚类在同一个分支上， 但它们编码的氨基
酸序列进化距离不同步， 后与太行花 ABO61200.1和梨 BAI99733.1聚为一类， 亲缘关系最近； 其次是葡
萄和柑橘， 与波喜荡草 Posidonia oceanica AEP40955.1 （PoFLC）进化距离较远， 表明该基因的 2 个 ORF
编码的氨基酸序列在进化过程中可能存在种属差异性。
图 3 CcFLC蛋白的功能结构域分析
Figure 3 Function structural domain analysis of CcFLC
图 4 CcFLC的疏水性分析
Figure 4 Hydrophobity analysis of CcFLC
4
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图 5 不同物种 FLC基因编码的氨基酸序列的同源性比较
Figure 5 Alignment of predicted amino acid sequences of FLC gene from different plants
2.4 CcFLC基因在不同组织中的表达分析
CcFLC基因 2个荧光定量 PCR 分析的结果如图 7 所示， ORF1 和 ORF2 在山核桃的营养枝幼茎、 幼
叶、 顶芽， 以及短果枝的雄花芽和雌花芽中均有表达， 但相对表达量存在较大差异， ORF2 的表达水平
较低， ORF1 则有较高的表达量。 在山核桃整个经历低温过程中， ORF1 在雄花芽的表达量高达其他组
织 2～3 倍， 并且在 1 月 13 日雄花芽出现表达高峰， 1 月 5 日在茎、 顶芽和雌花芽表达达到高峰， 此阶
图 6 不同物种 FLC基因编码的氨基酸序列系统进化分析
Figure 6 Phyloenetic tree of the deduced coding amino acids sequences of FLC gene from different plants
杨希宏等： 山核桃 FLOWERING LOCUS C 同源基因鉴定与表达分析 5
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段是山核桃休眠的最高时期， 表明 FLC 作为抑制成花基因， 在山核桃休眠期表达量最高， 抑制了雌花
芽的发育， 延迟开花。 随着温度的升高， ORF1 的表达才出现下降的趋势， 但是 3 月 16 日在茎表达量
又出现表达高峰， 可能抑制开花基因积累于此， 正向调控其表达， 使之表达量增强， 但具体原因还需进
一步研究。 ORF2 在不同组织中从 11 月开始一直呈下调表达趋势， 但在雄花芽、 茎、 幼叶和顶芽中的
表达差异不显著； 在雌花芽中表达量最高， 可能抑制雌花芽的发育。 山核桃雌花芽最佳发育时期是 3 月
中下旬， 在这一阶段， ORF1 和 ORF2 的表达逐渐呈下降趋势， 这说明它们的表达量与长期的低温处理
呈明显的相关性。
3 讨论
FLC 是多种开花途径的交汇点， 对花分生组织特性基因 LFY 起抑制作用， 通过抑制 FT 和 SOC1 基
因的表达抑制植物开花。 植物只有通过低温处理抑制 FLC 的转录及蛋白质的表达水平才能促进开花。
低温处理时间越长， FLC 的表达越弱。 本试验以山核桃不同组织为材料， 从中获得 CcFLC 2 个 ORF 序
列。 相关研究表明， 其他物种也存在多个 FLC相关基因序列。 如李勇［9］在红菜薹 Brassica campestris 中也
克隆到 BrpFLC1， BrpFLC2和 BrpFLC3等 FLC同源基因， Schranz等［10］在甘蓝 Brassica rapa中分离出 3种
FLC同源基因 BoFLC1， BoFLC2 和 BoFLC3。 本研究通过山核桃 CcFLC的 2个 ORF核苷酸和氨基酸序列
的同源性及其编码氨基酸疏水性/亲水性预测结果， 推测山核桃 CcFLC 也可能以多个同源形式存在， 因
此， 还需要进一步对 CcFLC基因进行染色体定位验证。
对 CcFLC 等 2 个蛋白功能域分析结果表明： 该 2 个 ORF 具有典型的 MADS-box 结构域， 其蛋白都
属于典型的 MIKC型 MADS-box基因蛋白， 具有 2个保守结构域， 即 MADS-box 和 K-box。 其中 ORF1 编
图 7 CcFLC 基因 2个开放阅读框（ORF）相同组织表达量的比较
Figure 7 Relative expression of two ORF from CcFLC gene in the same tissue
02-18 03-19
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第 30 卷第 1 期
码蛋白的 1～70 位氨基酸和 ORF2 编码蛋白的 1～73 位氨基酸是 MADS 结构域， 蛋白中部分别是 12 个氨
基酸 K-box（AA112-123）和 9个氨基酸 K-box（AA118-131）。 ORF1的 MADS 区和 K 区之间为 42 个氨基酸
的 I 区， ORF2 的 MADS 区和 K 区之间为 45 个氨基酸的 I 区， I-box 和 3′端均不保守， 表明它们都属于
MADS-box 家族中的成员。 MADS-box 基因编码一类转录调控因子， 是调节植物发育的重要基因， 在植
物开花时间和花形态建成起决定性作用 ［11］。 对其亲疏水性分析显示， CcFLC 基因 2 个 ORF 的蛋白质具
有较强的亲水性， 羧基端主要是疏水性氨基酸， 而氨基端主要是亲水性氨基酸， 大部分氨基酸残基是疏
水性的， 这与 MADS-box 的基因结构特点 N 端为亲水区、 C 端高度疏水相一致， N 端并富含碱性氨基
酸。 在系统进化上， CcFLC 基因 2 个 ORF 聚在同一分支上， 但它们的氨基酸序列进化距离不同步； 与
太行花和梨的进化距离较近； 其次是葡萄和柑橘， 与桉树进化距离较远， 表明该基因在进化过程中可能
存在种属差异性。
Real time RT-PCR 分析 CcFLC 在不同组织表达差异， 结果显示： CcFLC 等 2 个 ORF 在山核桃的幼
茎、 幼叶、 顶芽、 雌花芽和雄花芽中都有表达， 且存在很大差异。 在葡萄中 VvFLC 在叶片、 卷须、 休
眠芽、 花序及果实中也都有表达， 且在叶片的表达量最高［12］。 CcFLC 的 ORF1 在雄花芽中的表达丰度高
于其他组织， 这与拟南芥 FLC主要定位在茎尖中的表达模式［13］不一致， 这可能是由于植物外界环境、 取
材时间及其物种间的差异等因素造成的。 随着温度的升高， ORF1 在幼茎、 幼叶中的表达出现高峰。 茎
和叶属于营养器官， 大量抑制开花的基因表达物质积累于此， 正向调控 CcFLC 的表达， 使之表达量增
强［14］。 花芽成花后， CcFLC基因作为开花抑制因子， mRNA转录水平受到 FCA和 FLD等基因的抑制［15－16］
而使表达量自然减少， ORF1 的表达水平降低。 因此， 茎、 叶中含量较高， 花中含量较低， 说明经过长
期的低温 CcFLC基因的表达受到抑制， 花芽开始分化发育。 ORF2 在雌花芽中的表达量最高， 可能抑制
雌花芽的发育； 在幼茎、 雄花芽、 顶芽和幼叶中的表达最低， 且差异不显著， 这可能在长期的进化过程
中其表达模式和功能发生了变化， 也有可能是其调控元件如启动子 ［17］等造成的差异， 还有待进一步研
究。 山核桃雌花芽最佳发育时期是 3 月中下旬。 在这一阶段， ORF1 和 ORF2 的表达呈逐渐下降趋势，
这说明它们的表达量与长期的低温处理呈明显的相关性。
山核桃雌雄同株， 雌雄花芽分化存在时空差异。 3 月初雌雄花芽开始在短果枝尖端分化， 直到 4 月
完成授粉。 在这一阶段， ORF1 和 ORF2 的表达都呈下降趋势， 但在不同组织 ORF1 的表达下降趋势从
高到低依次为茎、 叶、 雌花芽、 顶芽、 雄花芽。 5-6 月底次年雄花芽发育， 这一阶段雌花芽大量脱落，
之后进入休眠期， 次年 4月初休眠的雄花芽继续发育并授粉。 因此， 推测山核桃雌雄花芽在发育过程中
存在不同的成花途径： 雌花芽分化可能与春化有关， 而雄花芽发育可能与光照有关。 5 月底山核桃叶片
接受光周期信号后可能引起 CO 的表达， 诱导了下游基因 SOC1 和 FT 的表达， 促进花分生组织特异性
基因 LFY 和 AP1 的表达量增加 ［18－21］， 从而启动了雄花芽的分化。 结合本实验室已经克隆到的山核桃开
花相关基因 CcFT， CcAG， CcAP1［22］， CcLFY［23］的研究， 将有助于山核桃花芽分化的分子调控机制的进
一步研究， 控制雄花芽的分化对提高山核桃产量有着重要的价值和意义。
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