全 文 ：收稿日期:2008-03-28;　修订日期:2008-11-20
基金项目:江苏省科技基础设施建设计划项目(No.BM2006104);
江苏省科技厅专项资金项目(No.BM2006507);
南京市科技计划项目(No.200701056)
作者简介:贾晓东(1981-),女(汉族),内蒙古包头人, 现任江苏省植物研
究所研究实习员 ,硕士学位 ,主要从事药用植物的活性成分研究工作.
＊通讯作者简介:冯　煦(1961-), 男(汉族),江苏徐州人 , 现任江苏省植
物研究所研究员 ,博士学位 ,主要从事药用植物的活性成分研究工作.
茅苍术药材高效液相色谱 -
蒸发光散射检测指纹图谱的研究
贾晓东 , 赵兴增 , 王　鸣 , 郭可跃 , 赵友谊 , 冯　煦＊
(江苏省中国科学院植物研究所·南京中山植物园江苏省药用植物研究开发中心 ,江苏 南京　210014)
摘要:目的 研究茅苍术的 HPLC-ELSD指纹图谱。方法 高效液相色谱法 , 蒸发光散射检测器(ELSD),水(0.25%乙
酸)-乙腈梯度洗脱;流速 0.6 ml/min;柱温 30℃。 ELSD条件:不分流;漂移管温度 112.8℃;空气流量 3.1 L/min。结果
共有 10个共有峰 ,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》得出了茅苍术药材的对照指纹图谱。 精密度 、
稳定性 、重复性实验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD均 <3%。 结论 该指纹图谱方法简便 、重复性好 , 为
有效地控制茅苍术药材的内在质量提供了科学依据。
关键词:茅苍术;　指纹图谱;　高效液相色谱;　蒸发光散射
中图分类号:R283;R284.1　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)05-1054-02
　　苍术为菊科植物茅苍术 Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或
北苍术 Atractylodeschinensis(DC.)KoidZ.的干燥根茎 [ 1] 。始载
于《神农本草经》, 苍术性辛 、苦 、温 , 归脾 、胃 、肝经 , 具有燥湿健
脾 、祛风散寒 、明目作用。主治脘腹胀满 、泄泻 、水肿 、风湿痹痛 、
风寒感冒等 , 中医临床使用历史悠久。其中尤以产于江苏茅山地
区的茅苍术品质最好。茅山地区是茅苍术的道地产区。但近年
来国际市场对苍术的需求量日益增加 , 茅苍术被掠夺性采挖 ,加
之对茅苍术生态环境的人为破坏 ,造成茅苍术资源的枯竭 , 使其
濒于灭绝 [ 2] 。为了保护这一珍贵资源 , 需对其优良品质进行分
析。查阅相关文献发现对茅苍术传统意义上的活性部位 -挥发
油的研究 , 未发现与道地性的直接联系 , 所以我们选取了茅苍术
的水溶性部分进行初步的指纹图谱的研究。由于茅苍术水溶性
部位含有的主要成分为无紫外吸收单萜苷类 ,故选用蒸发光散射
检测器 , 获得了良好而稳定的结果。按照国家药品监督管理局
2000年颁发的 “中药注射剂指纹图谱技术要求”的有关规定 [ 3] ,
对产于江苏茅山地区的不同采集地点的 10批茅苍术进行了
HPLC-ELSD指纹图谱方法的建立。建立其指纹图谱是为了反
映其质量情况 , 为建立稳定 、可靠 、全面的质量控制方法提供科学
依据。
1　材料与仪器
1.1　样品 本实验植物样品包括茅苍术 Atractylodes.lancea
(Thunb.)DC.10份 ,南苍术 2份 , 北苍术 、白术各 1份 , 其编号 、
采摘地点及采摘时间等见表 1。样品采收后洗净切小块 ,在 55℃
下烘干备用。
1.2　对照品 苍术苷 A, 3, 4, 11, 14-四羟基愈创 -9-烯 -11 -
O-β -D-吡喃葡糖苷 , 纯度≥98%, 本课题组分得。
1.3　试剂及仪器 乙腈:HPLC级;乙酸:AR级;去离子水。 Agi-
lent1100液相色谱仪 , HPChemstation色谱工作站 , AltechELSD
2000ES蒸发光检测器 , AgilentINTERFACE35900E数模转换器 ,
XWK-Ⅲ无油空气泵 , PhenoxmenexSynergiHydro-RP80A柱
(4.6 mm×250 mm, 4μm)加 C18预柱。
2　方法
2.1　色谱条件 经方法学研究确定色谱条件 , 流动相 A:水(含
0.25%乙酸), B:乙腈。 梯度洗脱程序见表 2。 柱温 30℃;流速
0.6 ml/min;进样量:30 μl。 ELSD采用不分流模式 , 漂移管温度
112.8℃, 空气流量:3.1L/min。
表 1　植物样品的采集情况
编号 品种 拉丁名 采集地点 采集时间
01-03 茅苍术 Atractylodeslancea (Thunb.)DC. 句容茅山 2007-07-30
04-06 茅苍术 Atractylodes1ancea(Thunb.)DC. 句容茅山 2007-09-17
07-10 茅苍术 Atractylodeslancea (Thunb.)DC. 句容茅山 2007-10-15
11 南苍术 Atractylodeslancea (Thunb.)DC. 湖北宝康 2007-10-25
12 南苍术 Atractylodeslancea (Thunb.)DC. 安徽金寨 2007-07-30
13 北苍术 Atractylodes chinensis (DC.)Koidz 北京云台山 2007-09-17
14 白术 AtractylodesmacrocephalaKoidz. 江苏射阳(栽培) 2007-07-30
表 2　梯度洗脱程序
时间 t/min B(%) 时间 t/min B(%)
0～ 20 5 ～ 8 35～ 50 11.5～ 17
20～ 30 8 50～ 70 17～ 30
30～ 35 8 ～ 11.5 70～ 100 30～ 45
2.2　供试液制备 取如上干燥植物样品 , 粉碎 ,过 40目筛。精密
称定 2 g, 置索氏提取器中 ,加 80 ml正己烷水浴加热回流脱脂 8
h。弃去正己烷液 , 取出样品纸包待正己烷挥发至干 , 再加 80 ml
甲醇提取 8 h。将甲醇提取液减压蒸至小体积 , 甲醇定容至 10
ml, 用 0.45 μm微孔滤膜滤过后备用。
2.3　参照物标准液制备 精密称取苍术苷 A, 3, 4, 11, 14-四羟
基愈创 -9-烯 -11-O-β -D-吡喃葡糖苷对照品 , 甲醇定容
配成 2.94及 1.00mg/ml的原液备用。
2.4　稳定性实验 取茅苍术 04号样品供试液 , 分别在 0, 4, 8, 12,
24 h检测指纹图谱。结果各色谱峰的相对保留时间和峰面积比
值基本一致 , RSD<3%, 供试品溶液在 24 h内稳定 , 符合指纹图
谱技术要求。
2.5　精密度实验 取茅苍术 03号样品供试液 ,连续进样 5次 , 检
测指纹图。比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积 , 结
果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致 ,
RSD<3%,符合指纹图谱的检测要求。
2.6　重复性实验 取茅苍术 09号样品 5份 , 按供试品溶液制备
方法制备供试品 ,检测指纹图。并分别按上述液相条件测定 , 对
共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计 , 5份供试品溶液
的 RSD<3%,符合指纹图谱的要求 。
2.7　样品测定 精密吸取供试品溶液各 30μl,注入液相色谱仪 ,
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.5
按 “ 2.1”中色谱条件测定 , 记录色谱图。以苍术苷 A(S峰)的保
留时间及峰面积为 1,计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰面
积比值。并按 “中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”建立茅苍
术药材的指纹图谱检测标准。
3　结果
3.1　相对保留值指纹谱的建立 采用相对保留时间标定指纹峰 ,
记录 80 min的色谱图 , 以图谱中苍术苷 A(3号峰)为参照物
(S),将各指纹峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间(设
定为 1)比较 , 其比值为各指纹峰的相对保留时间。计算 10批药
材指纹图谱中各指纹峰的技术参数(见表 3), 标定茅苍术的特征
指纹峰为 10个(见图 1)。 各特征指纹峰的保留时间为:峰 -1
(23.432 min);峰 -2(26.383 min);峰 -3(30.468 min);峰 -4
(43.478 min);峰 -5(44.682 min);峰 -6(50.365 min);峰 -7
(52.176 min);峰 -8(63.336min);峰 -9(65.065 min);峰 -10
(70.435 min)。其中峰 6为 3, 4, 11, 14 -四羟基愈创 -9-烯 -
11-O-β -D-吡喃葡糖苷。
表 3　茅苍术指纹图谱的技术参数( x±s)
特征
峰号
保留时间
t/min
相对保留
时间 峰面积
百分峰面积
(%)
相对
峰面积
1 23.43±0.33 0.77±0.01 272.44±140.10 5.11±2.63 0.40±0.31
2 26.38±0.29 0.87±0.01 279.50±53.01 5.24±0.99 0.41±0.20
3(S) 30.47±0.20 1 919.07±431.67 17.23±8.09 1
4 43.48±0.10 1.43±0.01 1579.72±371.44 29.62±6.96 2.47±1.33
5 44.68±0.10 1.47±0.01 254.16±61.32 4.77±1.15 0.42±0.26
6 50.36±0.11 1.65±0.01 454.37±343.17 8.52±6.43 0.54±0.40
7 52.18±0.15 1.72±0.01 306.60±86.83 5.75±1.63 0.48±0.31
8 63.34±0.06 2.08±0.01 290.15±124.55 5.44±2.34 0.36±0.13
9 65.06±0.07 2.14±0.01 296.16±111.01 5.55±2.08 0.48±0.29
10 70.44±0.07 2.31±0.01 304.38±125.51 5.71±2.35 0.45±0.31
共有峰总面积 4 956.55 92.93
非共有峰总面积 377.20 7.07
总峰面积 5 333.75 100
3.2　共有指纹峰面积的比值 通过 10批药材测定 , 以图谱中苍
术苷 A为参照物(S), 将各特征指纹峰面积与同一图谱中参照物
的峰面积比较 , 其比值为特征指纹峰的相对峰面积。据 “中药注
射剂指纹图谱研究的技术要求”规定 , 各共有指纹峰的面积比值
必须相对固定。峰 -4单峰面积占总峰面积百分比 >20%, 其差
值 <20%;峰 -3单峰面积占总峰面积百分比 >10%, 而 <20%,
其差值 <25%;其余单峰面积比均 <10%, 峰面积比值不做要求。
符合指纹图谱的要求 。
3.3　非共有峰面积 通过 10批药材供试品的测定 , 统计非共有
峰与总峰面积的百分比 , 其结果为非共有峰面积百分比 7.07%,
符合指纹图谱研究的 <10%的检测要求。
3.4　相似度 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A
版)》对各样品色谱图的原始文件(输出格式为 aia)进行分析 , 自
动匹配并以 10批样品生成的对照谱图(中位数法)作为对照模
版 ,计算各色谱图的整体相似度介于 0.564 ～ 0.887之间。 见
表 4。
表 4　 10批药材相似度
样品批次 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照谱
S1 1 0.862 0.851 0.787 0.817 0.564 0.887 0.681 0.829 0.809 0.9
S2 0.862 1 0.886 0.907 0.873 0.759 0.898 0.879 0.793 0.839 0.965
S3 0.851 0.886 1 0.83 0.841 0.649 0.906 0.712 0.723 0.87 0.912
S4 0.787 0.907 0.83 1 0.861 0.853 0.845 0.878 0.799 0.805 0.949
S5 0.817 0.873 0.841 0.861 1 0.71 0.858 0.803 0.748 0.8 0.933
S6 0.564 0.759 0.649 0.853 0.71 1 0.659 0.82 0.591 0.641 0.793
S7 0.887 0.898 0.906 0.845 0.858 0.659 1 0.741 0.746 0.863 0.93
S8 0.681 0.879 0.712 0.878 0.803 0.82 0.741 1 0.759 0.685 0.888
S9 0.829 0.793 0.723 0.799 0.748 0.591 0.746 0.759 1 0.68 0.855
S10 0.809 0.839 0.87 0.805 0.8 0.641 0.863 0.685 0.68 1 0.877
对照谱 0.9 0.965 0.912 0.949 0.933 0.793 0.93 0.888 0.855 0.877 1
3.5　其它药材和茅苍术 HPLC-ELSD标准指纹图谱的比较 在
同样条件下分别测定了产于湖北和安徽的南苍术 、北苍术 、白术
药材的色谱图 , 并与茅苍术 HPLC-ELSD标准指纹图谱比较相
似度。结果见表 5。
图 1　典型茅苍术 HPLC-ELSD色谱图
4　讨论
苍术为中医常用药 , 临床应用历史悠久 , 具有健脾燥湿 、祛风
散寒的功效 , 尤以产于江苏茅山地区的茅苍术品质最好 , 历来认
为茅山是茅苍术的道地产区。 对茅苍术道地性的研究集中在对
其挥发油的研究。大量实验证明道地产区与非道地产区茅苍术
含油量有显著性差异 , 且道地产区低于非道地产区 , 这提示我们
茅苍术的道地性可能不是体现在挥发油上 , 而是在水溶性成分
中。日本学者在对茅苍术的研究中 , 从其水溶性部分分得了大量
的单萜苷类成分 , 且显示具有较好的药理活性。基于这种原因 ,
我们对茅苍术的水溶性化学成分进行了系统的化学分离 ,并对其
指纹图谱进行研究。实验发现 , 苍术水溶性部分成分多为没有紫
外吸收的单萜苷类成分 , 采用紫外检测器在图谱中基本看不到吸
收峰 ,故本实验选用 ELSD检测器并获得了满意的结果。
表 5　与其它药材的比较结果
品种 茅苍术标准谱 白术 北苍术 南苍术(湖北)南苍术(安徽)
茅苍术标准谱 1.000 0.062 0.236 0.867 0.730
白术 0.062 1.000 0.755 0.102 0.151
北苍术 0.236 0.755 1.000 0.280 0.281
南苍术(湖北) 0.867 0.102 0.280 1.000 0.753
南苍术(安徽) 0.73 0.151 0.281 0.753 1.000
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.5 时珍国医国药 2009年第 20卷第 5期
4.1　提取条件摸索 比较了甲醇 、95%乙醇 、50%甲醇 、50%乙
醇等对样品的提取效果 ,以甲醇提取的样品液出峰较多 , 故选定
甲醇做为提取溶剂。
4.2　液相条件摸索 本实验采用 ELSD检测方式 , ELSD检测器
能检测到任何挥发性低于流动相的化合物 ,因此溶剂中极微量的
残留成分也能检测出来 , 造成峰的干扰或基线不稳。在液相洗脱
条件的摸索中 , 尝试了使用甲醇 -水 , 乙腈 -水两种溶剂系统。
即使在使用高纯度甲醇溶剂时 ,谱图中仍有含量较大的杂峰 , 而
在选用乙腈时杂峰较少 ,故选择乙腈 -水做为梯度洗脱的溶剂系
统。茅苍术所含成分较复杂 , 给液相分离带来了很大的困难 , 通
过加入一定的缓冲溶液可以大大的改善峰形 ,提高分离度。对几
种挥发性的缓冲溶液进行比较 ,选定加入 0.25%的乙酸。
所采集的 10批药材均为野生茅苍术药材 , 生长年限等因素
可能会对药材的内在质量产生一定的影响 ,所研究的指纹图谱所
表达的信息 , 仅代表茅苍术药材的整体情况 , 故而 10批茅苍术药
材的指纹图的相对峰面积值变异较大。
10批茅苍术药材图谱与茅苍术标准指纹图谱的相似度介于
0.965～ 0.855之间 , 产于湖北的南苍术与茅苍术标准指纹图谱
的相似度为 0.867, 显示两者有较接近的化学成分组成。产于安
徽的南苍术与茅苍术标准指纹图谱的相似度为 0.73, 明显不如
产于湖北的茅苍术近 , 这与其它实验证明的结论相符。茅苍术在
茅山地区生长具有较好的道地性优势 , 引种于湖北地区的茅苍术
道地性优势优于其它地区。产于北京的北苍术与茅苍术标准指
纹图谱的相似度为 0.236, 显示二者之间化学成分相差大 , 不能
混用。白术与茅苍术标准指纹图谱的相似度为 0.062, 相似度最
低。本实验建立的 HPLC-ELSD指纹图谱为快速鉴定苍术类药
材提供了依据。
本实验在中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)的
辅助下 ,得到了茅苍术药材的 HPLC-ELSD指纹图谱 , 为茅苍术
药材的进一步研究及质量控制提供了依据。
参考文献:
[ 1 ] 　国家药典委员会.中国药典 [ S] .北京:化学工业出版社 , 2000:127.
[ 2 ] 　贺善安 ,贺慧生 ,吕　晔 ,等.茅苍术资源的保护和利用 [ J] .植物资
源与环境 , 1993, 2(1):1.
[ 3 ] 　国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂
行)[ J] .中成药 , 2000, 22(10):671.
文献综述
收稿日期:2008-09-08;　修订日期:2008-12-10
基金项目:国家自然科学基金(No.30660236)
作者简介:汪　华(1984-),女(汉族),宁夏回族自治区银川人 , 现为江西
中医学院在读硕士研究生 ,主要从事药理学研究工作.
血管内皮生长因子在增生性瘢痕中的作用与研究进展
汪　华 1 , 彭旦明2 , 吴东风 2
(1.江西中医学院 ,江西 南昌　330006;　2.江西省中医药研究院 ,江西 南昌　330006)
摘要:增生性瘢痕组织的增生与微血管密度有密切关系 , 而血管内皮生长因子是微血管再生的关键调控因子 , 可促进
瘢痕血管的生成 , 进而促进成纤维细胞的增殖和胶原的形成 , 导致瘢痕增生。
关键词:血管内皮生长因子;　增生性瘢痕
中图分类号:R619+.6　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)05-1056-03
EffectandStudyProgressofVEGFinHypertrophicScar
WANGHua1 , PENGDan-ming2 , WUDong-feng2
(AcademyofTraditionalMedicineofJiangxiProvince, Nanchang, Jiangxi330001, China)
Abstract:Theformationmechanismofhypertrophicscarsisnotfulyappreciatetoday, andthereisnotsatisfyingthetreatment
inclinic.Withtheresearchprogressofmolecularbiologyandcellbiology, alargenumberofpeoplebegantostudythehyper-
trophicscarformsmolecularmechanisminrecentyears.Mostofthemthoughtthattheformationofhypertrophicscarsassociated
withthebloodvesseldensityinhypertrophicscarsandtheexcessiveexpressionofvascularendothelialgrowthfactorandothercy-
tokines.Vascularendothelialgrowthfactoristhekeyregulatoryfactoronregenerationofmicrovascular.VEGFcanpromotethe
formationofscarvascular, therebypromotetheproliferationoffibroblastsandcolagenformation, eventuallyleadtoscarforma-
tion.
Keywords:VEGF;　Hypertrophicscar
　　增生性瘢痕(Hypertrophic, HS)是病理性瘢痕的一种 , 是因成
纤维细胞增殖 、生长失控 ,胶原过度沉积导致真皮纤维化 ,并随时
间推移有自然软化趋势。但深层的发病机制尚未完全明确。在
众多的影响因素里 , 已有研究表明瘢痕增生的程度与微血管的密
度亦密切相关 , 其中血管内皮生长因子(Vascularendothelial
growthfactor, VEGF)在生理及病理血管再生中起关键性作用 ,本
文探讨 VEGF与增生性瘢痕的关系 , 进一步阐明增生性瘢痕的生
成机制 , 为预防和治疗增生性瘢痕提供依据。
1　VEGF及其受体研究现状
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)
又称血管通透因子(vascularpermeabilityfactor, VPF), 是一种高
度特异性的血管内皮细胞有丝分裂素 , 是 1989年由 Ferrara等 [ 1]
首次在牛垂体滤泡星状细胞培养物中纯化分离到的一种肝素结
合因子 , 能特异作用于血管内皮细胞 , 并在体内诱导血管形成。
近年来发现 , VEGF基因家族主要包括 VEGF-A, VEGF-B,
VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E和胎盘生长因子 , 它们都是分泌
型二聚体糖蛋白 , 具有相似的氨基酸序列 , 含有特征性的 8个半
胱氨酸残基 , 与血小板源性生长因子(plateletderivedgrowthfac-
tor, PDGF)具有结构同源性。[ 2]其中 VEGF-A主要与血管发生
有关 , 人类 VEGF-A基因位于染色体的 6p21.3, 全长 28 kb,由 8
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.5