全 文 ：收稿日期： 2010-08-19； 修回日期： 2010-12-17
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（30771752）
作者简介： 李元春， 从事经济林培育与利用研究。 E-mail： biobar@126.com。 通信作者： 曾燕如， 教授， 博士，
从事经济林培育和利用研究。 E-mail： yrzeng@zafu.edu.cn
浙 江 农 林 大 学 学 报， 2011， 28（3）： 505 - 512
Journal of Zhejiang A＆ F University
山核桃 SRAP体系的建立及与 RAPD和 ISSR标记的比较
李元春， 沈 林， 曾燕如
（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地， 浙江 临安 311300）
摘要： 以山核桃 Carya cathayensis基因组 DNA为模板， 对聚合酶链式反应（PCR）体系各组分进行了梯度实验， 优化
出条带清晰、 重复性好的相关序列扩增多态性聚合酶链式反应 （SRAP-PCR）扩增体系， 并筛选了引物。 该体系
（25.00 μL）为： 1 × 缓冲液 0.20 mmol·L－1， 脱氧核糖核苷酸（dNTPs）， 0.20 μmol·L－1 引物， 2.00 mmol·L－1镁离子（Mg2+），
33.34 nkat Taq DNA 聚合酶， 0.80 mg·L－1基因组 DNA（以上均为终浓度）。 反应条件为 94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性
30 s， 35 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 2 min， 5 个循环； 94 ℃变性 30 s， 50 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 2 min， 30 个循环；
72 ℃延伸 8 min， 4 ℃保存， 反应时间比其他体系缩短了一半。 从 100 对引物中筛选出了适用于山核桃的引物 15
对。 在山核桃中， 随机扩增多态性 DNA（RAPD）， 简单序列重复区间（ISSR）， SRAP 等 3 种标记， 以 SRAP 标记每
对引物扩增的位点数及每对引物扩增的多态性位点数为多， 但 SRAP 多态性引物的比例、 多态性位点比例居于另 2
种标记之间。 在山核桃研究中可以考虑使用 SRAP及 RAPD标记。 图 6表 4参 28
关键词： 经济林学； 山核桃； 相关序列扩增多态性（SRAP）； 随机扩增多态性 DNA（RAPD）； 简单序列重复区间（ISSR）
中图分类号： S664.1； S718.43 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2011）03-0505-08
Establishment of a SRAP analysis protocol in Carya cathayensis and
a comparison among SRAP， RAPD， ISSR analysis protocols
LI Yuan-chun， SHEN Lin， ZENG Yan-ru
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang A & F University， Lin’an
311300， Zhejiang， China）
Abstract： In order to have a good molecular marker to reflect inherent genetic characteristics of Lin’an
hickory （Carya cathayensis）， the genomic DNA extracted from hickory leaves was used to optimize parameters
（constituents） included in a sequence-related amplified polymorphism-polymerase chain reaction （SRAP-PCR）
protocol run under the following conditions： pre-denaturing at 94 ℃ for 5 min； 5 cycles， each of which
denatured at 94 ℃ for 30 s and annealed at 35 ℃ for 30 s with an extension at 72 ℃ for 2 min； 30 cycles，
each of which denatured at 94 ℃ for 30 s and annealed at 50 ℃ for 30 s with an extension at 72 ℃ for 2 min；
and a final extension at 72 ℃ for 8 min. Then， 15 pairs of primers out of 100 pairs were screened for SRAP
analysis and a comparison was made among SRAP， random amplified polymorphic DNA（RAPD）， and inter-
simple sequence repeat（ISSR）. The optimized（SRAP-PCR） protocol was as follows： a total volume of 25.00
μL containing 1 × buffer， 0.20 mmol·L-1 dNTPs（deoxynucleotide triphosphates）， 0.20 μmol·L-1 primers，
2.00 mmol·L-1 Mg2+， 33.34 nkat Taq DNA polymerase ， and 0 . 80 mg·L - 1 genomic DNA （ all at a final
concentration）. On the average， SRAP， compared to RAPD and ISSR， had the most loci and polymorphic
loci amplified by each pair of primers， but SRAP percentages for both polymorphic primer pairs and
polymorphic loci were between RAPD and ISSR. The optimized SRAP-PCR reduced the reaction time by half
compared with the former protocols. It has been shown that both SRAP and RAPD should be considered when
浙 江 农 林 大 学 学 报 2011 年 6 月 20 日
studying hickory. ［Ch， 6 fig. 4 tab. 28 ref.］
Key words： cash forestry； Carya cathayensis （hickory）； sequence-related amplified polymorphism （SRAP）；
random amplified polymorphic DNA （RAPD）； inter-simple sequence repeat （ISSR）
相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism， SRAP）是美国加州大学 Li 等 ［1］于
2001年提出的基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ， PCR）的分子标记， 其引物设计基于内含
子和外显子分别具有的一些共性序列。 SRAP-PCR 反应体系使用双引物， 即 17 个碱基的正向引物（F-
primer）和 18 个碱基的反向引物 （R-primer）。 正向引物含有一段 14 碱基的核心序列， 其 5′端前 10 个碱
基为 “填充” 序列， 无任何特异性， 其后为 CCGG 序列， 3′端 3 个选择性碱基与相同的核心序列组合成
一套正向引物。 外显子一般处于富含 GC 的区域。 正向引物中使用 “CCGG” 序列的目的是使之能特异
结合开放阅读框 （ORF）中的外显子。 反向引物的组成与正向引物类似， 但 “填充” 序列后连接的为
AATT， AATT序列后为 3个选择性碱基。 富含 AT 的序列通常见于启动子和内含子中。 反向引物 3′端的
AATT 旨在特异结合富含 AT 的区域。 SRAP 引物这样的设计使得有可能扩增出基于内含子与外显子的
SRAP 多态性标记 。 Ferriol 等 ［2］对西葫芦 Cucurbita pepo 2 变种 69 个类型的遗传多样性进行了 SRAP
分析， 11个 SRAP引物组合共获得了 88个可重复的位点， 平均每个引物扩增出了 8个位点， 其中 64个
位点具有多态性， 多态性比例为 72.7%。 山核桃 Carya cathayensis 是浙江省重要的经济树种， 目前种下
无品种， 多为实生繁殖。 以往对它开展的分子标记研究主要集中在随机扩增多态性 DNA（random amplified
polymorphic DNA， RAPD）， 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）等显性
标记上［3－5］， 结果显示无论是天然群体样品还是半同胞样品， 其多态性水平较低。 共显性简单重复序列
（simple sequence repeat， SSR） 标记具有种属特异性。 杨树 Populus的研究表明， SSR引物在不同的杨树
种间是高度保守的 ［6］， 可应用于不同的杨树种研究。 山核桃与美国山核桃 Carya illinoensis 为同属植物。
美国人从美国山核桃中开发出了 19 对 SSR 标记引物［7］， 但郭金剑［8］将美国山核桃中的 SSR 引物用于山
核桃 DNA 分析， 结果显示美国山核桃中开发的 SSR 标记不适用于山核桃。 SRAP 的多态性产生于 2 个
方面： ①由于小的插入与缺失导致片段大小改变， 而产生共显性标记； ②核苷酸改变影响引物的结合位
点， 导致显性标记产生。 该标记已经在其他物种的研究中广为使用， 但尚未见在山核桃研究中应用。 本
研究以来自天然群体的山核桃 DNA为样品， 建立了山核桃 SRAP分析体系， 并就 SRAP， RAPD 和 ISSR
等 3 种标记分析的多态性进行了比较， 以期从标记的角度来阐述针对山核桃反映其遗传多样性的能力，
为山核桃 DNA水平的深入研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
实验材料山核桃叶片采自山核桃产区浙江省临安市昌化镇正值盛果期的成年山核桃林， 山核桃树彼
此间相隔 50 m以上。 山核桃 × 美国山核桃杂种的叶片采自沈林培养的杂种苗。
1.2 试剂
参考 Li［1］等和 Ferriol等［2］的方法， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 SRAP， RAPD 和ISSR
引物， 并提供脱氧核糖苷酸（dNTPs）及引物（Fermentas）； Taq酶购自上海申能博彩生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 DNA 的提取 DNA 的提取参照 Xu 等 ［9］的方法稍加改进， 并用 10.00 g·L－1的 RNase 对所提取的
DNA 进行（37 ℃）RNA 消化。 使用 ND-1 000（NanoDrop）及 8.00 g·kg－1琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量
浓度及质量， 根据测定结果将 DNA稀释到 10.00 mg·L－1备用。
1.3.2 SRAP-PCR体系的优化 参照以往 AFLP标记、 ISSR（inter-simple sequence repeat）标记体系优化的
程序， 先优化 PCR体系， 随后再筛选引物［5－10］。 PCR扩增反应在 PTC-200（MJ Research）上进行。 就SRAP-
PCR， 以 Guo 等 ［11］的 SRAP 扩增体系（25.00 μL： 1 × 缓冲液， 0.20 mmol·L－1 dNTPs， 0.30 μmol·L－1引
物， 2.50 mmol·L－1镁离子（Mg2+）， 16.67 nkat Taq DNA 聚合酶， 1.20 mg·L－1基因组 DNA（浓度均为终浓
度）与扩增条件（94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 1 min， 35 ℃退火 1 min， 72 ℃延伸 2 min， 5个循环； 94
506
第 28 卷第 3 期
℃变性 1 min， 50 ℃退火 1 min， 72 ℃延伸 2 min， 30 个循环； 72 ℃延伸 8 min， 4 ℃保存） 为基础， 在
几个有扩增产物的引物对中， 采用 F1（TGAGTCCAAACCGGATA）/R1（GACTGCGTACGAATTAAT）引物组
合， 参照张彤等 ［12］、 柳李旺等 ［13］、 赵伟光等 ［14］的综述及郭大龙等 ［15］针对柿树属 Diospyros 植物优化
SRAP-PCR 的过程， 依次对镁离子（Mg2+）， 引物， dNTPs， Taq DNA 聚合酶和山核桃基因组 DNA 等实验
参数的反应终浓度进行优化。 根据微量移液枪操作的便利性， 将每一个 PCR 反应参数均设 12 个反应终
浓度（表 1）。 一个参数的最佳浓度确定后， 固定该浓度， 优化下一个参数浓度， 最后优化 PCR 扩增条
件。 扩增产物在 20.00 g·kg－1琼脂糖凝胶上电泳， 溴化乙锭（EB）染色， AlphaImager HP（Alpha Innotech）
成像系统成像保存。 在优化 SRAP体系的基础上， 从 Li等［1］的 10个正向引物、 10个反向引物共 100对组
合中筛选引物。
1.3.3 SRAP， RAPD 和 ISSR 标记的比较 王正加等 ［4］建立了山核桃 RAPD 分析体系， 沈林在此基础上
对退火温度及 DNA模板用量进行了优化。 本研究采用沈林优化过的 RAPD体系［PCR反应总体积为20.00
μL， 包括 10 × 缓冲液 2.00 μL， 25.00 mmol·L－1镁离子（Mg2+）1.76 μL， 2.50 mmol·L－1 dNTP 1.20 μL，
15.00 μmol·L－1 RAPD 引物 0.50 μL， 模板 DNA15.00 ng， Taq DNA 聚合酶 16.67 nkat； PCR 反应条件为
94 ℃预变性 2 min， 然后进入 40 个 PCR 循环， 每个循环 94 ℃变性 30 s， 35.2 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸
90 s； 最后 72 ℃延伸 7 min］及沈林建立的山核桃 ISSR 分析体系［总体积为 20.00 μL， 包括 10 × 缓冲液
2.00 μL， 25.00 mmol·L－1 镁离子（Mg2+）1.30 μL， 2.50 mmol·L－1 dNTP 2.00 μL， 10.00 μmol·L－1 ISSR 引物
0.70 μL， 模板 DNA 15.00 ng， 16.67 nkat Taq DNA 聚合酶； 反应条件为 94 ℃预变性 2 min， 然后进入
35个 PCR循环， 每个循环 94 ℃变性30 s， 退火 45 s（退火温度因引物而异）， 72 ℃延伸 90 s； 最后 72
℃延伸 7 min ［16］， 对来自天然群体的山核桃及山核桃 × 美国山核桃子代 DNA进行了分子标记分析， 并
对分析结果进行了比较。
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA的提取
采用 Xu 等［9］的方法提取的山核桃基因组 DNA 色素类物质少， D（λ）260 /D（λ）280值在 1.8 左右， 可用
于后续的分析。
2.2 SRAP-PCR体系的优化
2.2.1 镁离子浓度 镁离子（Mg2+）是维持 DNA 聚合酶活性的重要辅因子 ［17］， 在 PCR 中通过影响Taq 酶
表 1 实验参数（终浓度）设置
Table 1 Parameters （final concentration） tested in the experiment
Mg2+/（mmol·L－1） 引物/（μmo·L－1） dNTPs/（μmo·L－1） Taq DNA 聚合酶/（nkat） 基因组 DNA/（mg·L－1）
0.50 0.04 0.04 0.25 × 16.67 0.20
1.00 0.08 0.08 0.50 × 16.67 0.40
1.50 0.12 0.12 0.75 × 16.67 0.60
2.00 0.16 0.16 1.00 × 16.67 0.80
2.50 0.20 0.20 1.25 × 16.67 1.00
3.00 0.24 0.24 1.50 × 16.67 1.20
3.50 0.28 0.28 1.75 × 16.67 1.40
4.00 0.32 0.32 2.00 × 16.67 1.60
4.50 0.36 0.36 2.25 × 16.67 1.80
5.00 0.40 0.4 2.50 × 16.67 2.00
5.50 0.44 0.44 2.75 × 16.67 2.20
6.00 0.48 0.48 3.00 × 16.67 2.40
李元春等： 山核桃 SRAP 体系的建立及与 RAPD 和 ISSR 标记的比较 507
浙 江 农 林 大 学 学 报 2011 年 6 月 20 日
着浓度的增大， 当浓度达 1.75 × 16.67 nkat 时，
500 bp 以下及 900 bp 以上的扩增产物逐渐增多；
当浓度达 3.00 × 16.67 nkat 时， 扩增产物又呈弥
散状而模糊不清。 从实验结果以及经济的角度出
发， 确定 2.00 × 16.67 nkat为最佳浓度。
2.2.5 模板质量浓度 PCR 对模板质量要求较
高。 本实验中， 低质量浓度 DNA 扩增效果很差，
当超过 1.40 mg·L－1 时， PCR 反应的扩增产物逐
渐减少。 本研究确定模板 DNA 为 0.80 mg·L－1时
扩增效果最好（图 5）。
图 5 山核桃基因组 DNA质量浓度对
SRAP-PCR的影响
Figure 5 Effect of genomic DNA concentration on SRAP-PCR
活性而间接影响 PCR 扩增［18］， 它还能与反应液中的 dNTPs、 模板 DNA 及引物结合， 影响引物与模板的
结合效率、 模板与 PCR产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成 ［19］。 本研究镁离子（Mg2+）
1.50 ~ 4.50 mmol·L－1浓度均可以扩增出清晰的条带。 经过重复实验确定 2.00 mmol·L－1为最优浓度（图1）。
2.2.2 引物浓度 引物与基因组 DNA 模板退火时启动 PCR 的进行。 引物浓度在 0.04 μmol·L－1时 PCR
扩增很弱； 当引物浓度超过 0.24 μmol·L－1以后， 小片段 DNA 得到了扩增， 但大片段扩增效果明显减
弱， 显示引物没有得到充分的利用。 因此， 确定 0.20 μmol·L－1为引物的最优浓度（图 2）。
2.2.3 dNTPs 浓度 dNTPs 是 PCR 反应的原料， 低浓度 dNTPs PCR 扩增效果很弱， 高浓度的 dNTPs 会
螯合镁离子（Mg2+）而反馈抑制 DNA聚合酶的活性［20］。 实验结果显示： 在 dNTPs浓度 0.04 ~ 0.20 mmol 泳
道 1 ~ 12 为引物的反应终浓度； 泳道 M 都可以扩展出清晰的条带， 确定 0.20 mmol 泳道 1 ~ 12 为引物
的反应终浓度； 泳道 M为最优浓度（图 3）。
2.2.4 Taq 酶浓度 由图 4 可知， 当 Taq DNA Polymerase 为 0.25 × 16.67 nkat 时几乎没有扩增产物； 随
图 1 镁离子（Mg2+）浓度对山核桃 SRAP-PCR的影响
Figure 1 Effect of Mg2+ concentration on the hickory genomic
DNA’s SRAP-PCR
图 2 引物浓度对山核桃 SRAP-PCR的影响
Figure 2 Effect of primer concentration on the hickory
genomic DNA’s SRAP-PCR
图 3 dNTPs浓度对山核桃 SRAP-PCR的影响
Figure 3 Effect of dNTP concentration on the hickory
genomic DNA’s SRAP-PCR
图 4 TaqDNA聚合酶浓度对山核桃SRAP-PCR的影响
Figure 4 Effect of Taq DNA polymerase concentration on the
hickory genomic DNA’s SRAP-PCR
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第 28 卷第 3 期
2.2.6 SRAP-PCR 反应条件的优化 按照 Guo 等［21］的方法， 完成一个 SRAP 反应约需 3.0 h， 时间较长。
我们将 SRAP 反应条件中 2 个循环每一个循环的变性及退火时间各减少一半至 30 s， 并将 PCR 结果与
前述反应条件的 PCR 结果进行比较， 发现变性及退火时间各减少一半并不影响 PCR 结果， 而整个 PCR
时间缩短至 1.5 h左右。 利用优化后的山核桃 SRAP体系以及扩增条件对山核桃基因组 DNA 进行扩增的
效果见图 6。
2.2.7 山核桃 SRAP-PCR 引物的筛选 利用优优化后的山核桃 SRAP 体系， 从 100 对 SRAP 引物组合中
筛选出了 15对扩增性强， 条带清晰， 适合于山核桃的引物对（表 2）。
2.3 SRAP与 RAPD和 ISSR分子标记的比较
以 10个来自天然群体的山核桃样品基因组 DNA 为材料， 用 SRAP， RAPD 和 ISSR 等 3 种分子标记
进行 PCR 扩增， 统计 3 种分子标记的扩增结果（表 3）。 从研究结果来看： 3 种标记扩增产物中， SRAP
标记每对引物扩增的多态性位点数最多， 其次为 RAPD 与 ISSR 标记， 且两者相差不大； 多态引物的比
例及多态性位点的比例以 RAPD 标记最高， 随后为 SRAP 和 ISSR 标记， 但每对引物所获得的多态位点
数以 SRAP标记为多， 随后为 RAPD与 ISSR标记。
以山核桃为母本， 美国山核桃为父本， 20 株杂交苗的基因组 DNA 为材料进行 3 种标记的分析， 扩
图 6 优化后的 SRAP体系山核桃 DNA PCR扩增产物的电泳图（引物组合 F4/R1）
Figure 6 Electrophoresis of PCR products amplified with an optimized SRAP protocol in hickory （primer pair F4/R1）
表 2 经过筛选的山核桃 SRAP引物对
Table 2 Primer pairs screened for hickory
引物对 序列（5’ - 3’） 引物对 序列（5’ - 3’）
F1/R1 TGAGTCCAAACCGGATA/GACTGCGTACGAATTAAT F4/R3 TGAGTCCAAACCGGACC/GACTGCGTACGAATTGAC
F1/R3 TGAGTCCAAACCGGATA/GACTGCGTACGAATTGAC F6/R8 TGAGTCCAAACCGGTAA/GACTGCGTACGAATTCTG
F1/R4 TGAGTCCAAACCGGATA/GACTGCGTACGAATTTGA F7/R2 TGAGTCCAAACCGGTCC/GACTGCGTACGAATTTGC
F1/R10 TGAGTCCAAACCGGATA/GACTGCGTACGAATTCCA F7/R4 TGAGTCCAAACCGGTCC/GACTGCGTACGAATTTGA
F2/R6 TGAGTCCAAACCGGAGC/GACTGCGTACGAATTGCA F8/R4 TGAGTCCAAACCGGTGC/GACTGCGTACGAATTTGA
F2/R7 TGAGTCCAAACCGGAGC/GACTGCGTACGAATTCAA F8/R10 TGAGTCCAAACCGGTGC/GACTGCGTACGAATTCCA
F2/R8 TGAGTCCAAACCGGAGC/GACTGCGTACGAATTCTG F9/R2 TGAGTCCAAACCGGTGT/GACTGCGTACGAATTTGC
F4/R1 TGAGTCCAAACCGGACC/GACTGCGTACGAATTAAT
表 3 3种分子标记天然群体山核桃样品扩增结果统计
Table 3 Statistical PCR results of samples from a natural population amplified with three kinds of molecular markers
标记名称 使用引物/个
获得多态的
引物/个
扩增总位
点数/个
扩增位
点数/引物
多态性位
点数/个
多态引物比
例/%
多态性位点
比例/%
多态位点数/
引物
RAPD 16 12 121 7.56 25 75.00 20.66 1.56
ISSR 17 9 143 8.41 20 52.94 13.99 1.18
SRAP 15 9 173 11.53 27 60.00 15.61 1.80
李元春等： 山核桃 SRAP 体系的建立及与 RAPD 和 ISSR 标记的比较 509
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增结果表明： 每对引物扩增的位点数以 RAPD 为多， ISSR 及 SRAP 相近， 正好与山核桃 DNA 的实验结
果相反， 但均以 ISSR标记居中； 多态性引物的比例及多态性位点的比例与来自天然群体山核桃 DNA 的
样品分析结果类似， 其中多态性位点的比例以 RAPD 标记最高， 随后为 SRAP 和 ISSR 标记， 分别达
27.6%， 26.2%和 17.0%， 且 SRAP 与 RAPD 的结果相差不大（表 4）， 但从每对引物扩增的多态位点数来
讲， 以 RAPD标记为多， 其次为 SRAP及 ISSR标记。
3 讨论
SRAP技术是一种基于 PCR反应的分子标记技术， PCR扩增效果与其他分子标记一样， 受诸多因素
的影响， 不同的材料其扩增体系及反应条件一般都有所不同， 这与不同材料基因组大小、 所提取 DNA
的纯度、 以及 PCR 仪的型号及工作状态有关。 对于山核桃基因组 DNA 来说， 研究结果确定的 SRAP-
PCR反应体系是： 1 × 缓冲液， 0.20 mmol·L－1 dNTPs， 0.20 μmol·L－1 引物， 2.00 mmol·L－1镁离子（Mg2+），
33.34 nkat Taq DNA 聚合酶， 0.80 mg·L－1基因组 DNA（均为反应终浓度）； 反应条件是： 94 ℃预变性 5
min， 94 ℃变性 30 s， 35℃退火 30 s， 72 ℃延伸 2 min， 5 个循环； 94 ℃变性 30 s， 50 ℃退火 30 s， 72
℃延伸 2 min， 30个循环； 72 ℃延伸 8 min， 4 ℃保存。
Budak 等［21］在水牛草 Buchloe dactyloides 中比较了 SSR， RAPD， ISSR 和 SRAP 等 4 种分子标记， 结
果发现 RAPD 与 SRAP 的相似性指数高度相关， 而 RAPD 与 SSR 之间的斯皮尔曼等级相关系数极低，
SSR 与 ISSR 之间的斯皮尔曼等级相关系数较高。 这意味着 RAPD 与 SRAP 标记之间有很好的一致性。
水牛草是一个异花授粉、 高度杂合的物种， 有着丰富多样的遗传背景。 在此情况下， 很难观察到不同标
记技术间高水平的相似性。 Degani 等 ［22］用 AFLP 及 RAPD 标记研究了草莓 Fragaria ananassa 品种间的多
态性， 发现 RAPD标记数据获得的近亲系数要好于 AFLP 标记数据获得的近亲系数， 且标记间没有相关
性。 沈林等［23］利用 AFLP 标记对山核桃天然群体 100 个单株进行分析， 使用 11 对引物共产生 32 个多态
性位点， 平均每对引物产生的多态位点数 2.91 个， 结果说明山核桃 DNA 多态性水平低； 并从连锁不平
衡的角度研究， 发现山核桃天然群体的遗传多样性为低至中等水平。 王正加［24］利用 AFLP 对山核桃进行
分析也得到了类似的结果。 对于遗传多样性水平不高的山核桃来讲， 不同标记技术间的比较更能反映标
记本身体现不同个体间遗传多样性的能力。
我们的研究表明： 在山核桃中， RAPD， ISSR 和 SRAP 等 3 种标记以 SRAP 标记每对引物扩增的位
点数及每对引物扩增的多态性位点数为多， 尽管其产生多态位点的引物比例及产生多态性位点的比例居
中， 次于 RAPD。 与 RAPD 相比， 其正向和反向引物的碱基数分别是 17 和 18， 要远远多于 RAPD 的10
个碱基数， 所以 SRAP 在 PCR 扩增中的特异性相对更好， 结果也更可靠。 从每对引物产生的多态性位
点数来讲， 与 AFLP相比， AFLP要优于 SRAP［23］。 对基因组背景不清楚的林木来说， 共显性的标记开发
不多， 对简单、 廉价显性标记技术的依赖性还很强 ［25］， 不断有相关的研究论文发表［26－28］。 在所有 4 种分
子标记中， 相比 AFLP 操作的复杂性， RAPD， ISSR 和 SRAP 标记的操作要简单得多， 且 SRAP 可显示
大量的共显性［12］， 在山核桃研究中可以考虑使用 SRAP并结合 RAPD标记。
参考文献：
［1］ LI G， QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP）， a new marker system based on a simple PCR
reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica ［J］. Theor Appl Genet， 2001， 103： 455 － 461.
表 4 3种分子标记山核桃 × 美国山核桃全同胞子代样品扩增结果统计
Table 4 Statistical PCR results in the full-sib progeny of hickory × pecan amplified with three kinds of molecular markers
标记名称 使用引物/个
获得多态的
引物/个
扩增总位
点数/个
扩增位点数/
引物
多态性位
点数/个
多态引物
比例/%
多态性位点
比例/%
多态位点数/
引物
RAPD 23 21 225 9.78 62 91.30 27.60 2.70
ISSR 29 17 171 5.90 29 58.60 17.00 1.00
SRAP 15 10 84 5.60 22 66.70 26.20 1.47
510
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