全 文 ： 论著 文章编号:1007 -8738(2007)01 - 0042 - 04
大青叶对 IL-1β作用下兔下丘脑 EP3mRNA表达的影响
董　军 1, 2*, 裘　晟 1 , 谢新华1 , 潘　锐 3 , 唐红梅 1 , 陆大祥 1, 2 (暨南大学:1医学院病理生理教研室 , 2国家中医药管
理局三 A级重点实验室 , 广东 广州 510632;3附属第一医院骨科 , 广东 广州 510630)
收稿日期:2006 - 09 -06;　接受日期:2006 - 10 - 20
基金项目:国家中医药管理局择优项目(国中医药科 2003LHR13);广
东省中医药管理局项目资助(1040074, 400017);广东省医
学科研课题(A2006334);暨南大学病理生理学重点实验室
开放基金(51206011)
作者简介:董　军(1964 - ), 女 , 安徽铜陵人 , 副教授 , 硕士生导师
*Correspond ing au thor, E-m ai l:dongjunbox@ 163. com
Tel:020-85220250
Effect of daqingye on EP3 mRNA ex-
pression of hypothalamus in IL-1β-in-
duced rabb its
DONG Jun
1, 2*, QIU Sheng 1, X IE X in-hua1 , PAN Rui 3 ,
TANG Hong-mei1 , LU Da-xiang1, 2
1Department o f Pathophy sio logy, 2K ey Lab of S tate Adm inistration
o f T rad itional ChineseM edic ine, M edical Co llege o f Jinan Unive r-
sity, Guang zhou 510632;3Departm ent o f O rthopaedics, the F irst
A ffilia ted Hospita l o f Jinan University, Guangzhou 510630, China
[ Abstract] 　AIM:To study the an tipyre tic effect and
m echan ism o f Daq ingye in jection (DQY I). METHODS:
The IL-1β-induced feb r ile New Zea land rabb its were chosen
as expermi en ta l mode ls and the an tipyre tic e ffect of DQYI
was obse rved. The exp ress ion o f EP3mRNA was investiga-
ted by us ing in situ hybr id iza tion( ISH) inPOAH. RESULTS:
F irst, the co lon ic tem pera ture wen t up g radua lly a fte r in tra-
venous(.i v) IL-1β. The peak va lue o f tempera tu re(△T)
and therm a l response index (TR I1) in IL-1β-trea ted g roup
w ere h ighe r than those in con tro l g roup (P <0. 01). The
△T and TR I1 o f in DQYI and IL-1β-trea ted g roup w ere low-
e r than those in IL-1β-trea ted g roup (P <0. 05). The tem-
pe ra tu re o f DQY I-trea ted g roup showed no d istingu ished
d iffe rence compared w ith tha t in con tro l g roup (P >0. 05).
Second, the expression o f EP3 mRNA in the POAH of IL-
1β-trea ted g roup increased marked ly com pared w ith tha t in
contro lg roup (P <0. 01). The exp ress ion o f EP3 mRNA
treated by IL-1β +DQY I in the POAH decreased str ik ing ly
com pared w ith tha t in IL-1β g roup(P <0. 05). CONCLU-
SION:DQYI has d istinct an tipyretic e ffec t on IL-1β-induced
feve r. The mechan ism m igh t be the inh ib ition o f EP3 mRNA
expression in POAH from rabb its.
[ Keyw ords] daq ingye; IL-1β;an tipyre tic;preop tic an te r io r
hypo tha lamus(POAH);E-type p rostag land in
recep tor
[摘 要 ] 　目的:阐明大青叶的中枢解热机制 , 为其临床应用
提供实验依据和理论指导。方法:实验用新西兰兔复制白介
素-1β ( in te rleuk in-1β , IL-1β)发热模型 , 在观察大青叶注射液
(Daqingye injection, DQY I)解热作用的基础上 , 应用原位杂交
技术检测静脉注射 DQYI对 IL-1β 作用下新西兰兔视前区-下
丘脑前部(preoptic anterior hypo thalam us, POAH)组织中前列
腺素 E3受体(E-type pro stag landin recepto r, EP3) mRNA表达
的影响。结果:(1) DQY I静脉注射后对正常新西兰兔结肠温
度没有明显影响 , 与生理盐水组相比 , 最大体温上升高度
(△T)及 1 h体温反应指数 (TRI
1
)两组间无统计学意义
(P >0. 05);IL-1β 组在静脉注射 IL-1β后 , 结肠温度逐渐升高 ,
△T及 TRI1与生理盐水组相比 , 也有统计学意义(P <0. 01);
而 DQYI+IL-1β 组结肠温度上升峰值明显低于 IL-1β 组 , 两
组△T及 TRI
1
比较 , 有显著性差异(P <0. 05)。 (2)新西兰
兔下丘脑 POAH EP3mRNA在生理状态下仅有少量或没有表
达;IL-1β 诱导发热后 , EP3 mRNA表达明显增强;而 DQYI
能减少 IL-1β 作用下 EP3 mRNA的表达(P <0. 05)。 结论:
DQY I对 IL-1β 诱导的新西兰兔发热有解热作用;且其解热作
用机制可能与其抑制下丘脑 EP3 mRNA的表达有关。
[关键词 ] 大青叶;IL-1β;解热;POAH;前列腺素 E受体
[中图分类号 ] R285. 5　　　[文献标识码 ] A
　　发热是指由于致热原的作用 , 使体温调节中枢
的调定点上移而引起的调节性体温升高 (超过
0.5℃)。临床各种原因引起的过高的发热 ( >40℃)
都会促进疾病的发生发展并威胁生命。因此 , 维持
哺乳动物体温的相对恒定 , 是机体进行新陈代谢和
正常生命活动的必要条件 , 及时解热尤其重要 。目
前临床西药疗效肯定 , 但存在较多副作用 , 而中药既
具有很好的抗炎解热作用 , 且毒副作用小。因此 , 对
清热解毒类中药的抗炎解热作用机制研究很有必要 。
大青叶是重要的清热解毒中药 , 有较强的抗甲型流
感病毒 、抗内毒素及免疫增强作用 , 并能广谱抗
菌[ 1] 。以大青叶为主的复方制剂解热的临床观察和
药效学研究也较多 , 但对大青叶是通过何种途径起
解热作用 , 其作用靶点和机制究竟如何 , 至今国内外
文献少见报道。因此 , 我们采用 IL-1β复制新西兰兔
42 ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志(Ch in J Ce llM ol Immuno l)2007, 23(1)
DOI牶牨牥牣牨牫牬牪牫牤j牣cnki牣cjcmi牣牥牥牬牥牴牰
发热模型 , 在观察大青叶注射液 (daqingye injection,
DQY I)解热作用的基础上 , 运用原位杂交技术来检
测静脉注射 DQY I后对 IL-1β作用下新西兰兔下丘脑
组织中 EP3mRNA表达的影响 , 以阐明 DQY I的中枢
解热机制 , 为临床应用提供实验依据和理论指导 。
1　材料和方法
1. 1　主要设备及试剂　ST-1型数字温度计 (上海医用仪表
厂), 电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂), CM1900型
恒冷箱切片机 (德国徕卡公司), DMRA2正立电动荧光显微
镜(德国徕卡公司), Leica Qw in彩色图像分析系统(德国徕卡
公司), IL-1β (美国 S igm a公司), 大青叶注射液(山东鲁南制
药厂), 原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
1. 2　实验动物及分组　健康新西兰兔 24只 , 雌雄不限 , 质
量 1. 5 ～ 2. 0 kg, 随机分成 4组 , 每组 6只。 (1)生理盐水
(NS)对照组:每只动物静脉注射 NS 1mL;(2)大青叶注射液
(DQY I)组:每只动物静脉注射 DQYI 1 mL;(3)白介素-1β
组:每只动物静脉注射 IL-1β 100 ng(用无热原 NS稀释至
1 m L);(4)DQYI加 IL-1β 组:静脉注射 DQYI 1 mL /只 ,
30 m in后再静脉注射 IL-1β (剂量同 IL-1β组)。
1. 3　发热动物模型的制备　使用 ST-1型数字温度计(使用
前用标准温度计校正 )测量结肠温度。实验前 3 d将兔置于实
验环境中模拟操作以适应实验条件 , 每天 4 ～ 6 h, 第 4天正
式实验。实验时 , 实验室温度保持在 23±1℃, 将新西兰兔置
于特制兔箱中 , 用涂有石蜡油的测温探头经肛门插入 10 cm ,
并用胶布固定于尾根部 , 待体温稳定后 , 每隔 10 m in记录 1
次结肠温度 , 取 3次的平均值作为基础体温。 IL-1β组从耳缘
静脉注射 IL-1β , 并每隔 10 m in 记录体温 1次 , 共记录
70 m in;NS对照组从耳缘静脉注射 NS。各实验组记录体温方
式相同。
1. 4　取材和切片　记录至 70 m in时 , 用 200 m L /L氨基甲酸
乙酯进行麻醉 , 迅速分离双侧颈总动脉和一侧颈外静脉 , 其
中一侧颈总动脉插管 , 另一侧颈总动脉结扎 , 开放颈外静脉 ,
快速(2 m in内)输入 37℃ 1 g /L肝素焦碳酸二乙酯 (DEPC )
水 100 m L, 再先快后慢灌注 4 ℃ 40 g /L多聚甲醛 200 mL, 维
持灌注 30 m in;取兔脑 , 放入 40 g /L多聚甲醛后固定 , 置于
4 ℃冰箱保存 4 h。再置入 200 g /L蔗糖溶液中过夜 , 次日作
冰冻切片。切片厚度为 10μm, 隔二取一 , 于 37℃干燥 4 ～ 10 h
后进行原位杂交。
1. 5　下丘脑 EP3 mRNA原位杂交　随机选取每只动物下丘
脑前部 5张切片行原位杂交检测 EP3 mRNA , 杂交过程参见
试剂盒说明。主要步骤为:300 mL /L H2 02 10 m in, 30 m L /L
柠檬酸稀释的胃蛋白酶 10 m in, 0. 1 m ol /L PBS洗后加预杂交
液 40℃ 3 h, 加杂交液(含 EP3寡核苷酸探针)40℃过夜 , SSC
洗涤后加封闭液 37℃ 30 m in, 加生物素化鼠抗地高辛 37℃
1 h, 0. 1 mo l /L PBS洗后加 SABC 37℃ 20 m in, PBS洗后加生
物素化过氧化物酶 37℃ 20 m in, PBS洗后 DAB显色 5 m in,
常规脱水透明封片。 阴性对照做如下设置:(1)加含探针的
杂交液前 , 切片先用 RnaseA预处理(37℃, 30 m in);(2)在
杂交时 , 以不含探针的杂交液进行杂交。 原位杂交探针为寡
核苷酸探针 , 序列为:
(1)5′-TCTGCACCCGCCTCAACCACTCGTATCCAGGCATG -3′
(2)5′-TGTCGCGTAGCTACCGGCGTCGGGAGAGCAAGCGC-3′
(3)5′-TGCAC CTTCTTTGGTCTGAC CATGACTGTTTTCGG -3′
由武汉博士德生物工程有限公司提供 , 并用地高辛标记探针
5′端。
1. 6　图像分析　每只动物选片 5张 , 以细胞胞质内呈现棕黄
色颗粒为阳性染色 , 并对 POAH阳性细胞进行记数;每张切
片取 3个视野 , 计算平均值。采用 Le ica Qw in彩色图像分析
系统 , 分别测出下丘脑的平均灰度值。
1. 7　统计学分析　所有实验数据均以均数 ±标准差 ( x±s)
表示 , 用 SPSS11. 0进行 t检验。
2　结果
2. 1　大青叶注射液对 IL-1β 性发热效应的影响　分别静脉
注射 DQYI和 NS对两组新西兰兔体温没有明显的变化 , 两组
比较△T及 TRI1均无明显差异 (P >0. 05);而 IL-1β 组在注
射 IL-1β 后 , 结肠温度逐渐升高 , 与 NS组相比 , △T及 TRI1
有显著性差异(P <0.01);DQY I+IL-1β 组在事先注射 DQYI
后 , 温度上升峰值明显低于 IL-1β 组 , 两组△T及 TRI1相比
较具有统计学差异(P <0. 05, 图 1)。
图 1　大青叶注射液对 IL-1β 性发热的影响
F ig 1　 The an tipy re tic effe ct of DQYI on IL-1β-induced feb rile
rabb its
表 1　大青叶注射液对 IL-1β 性发热的影响
Tab 1　The antipy re tic effe ct of DQYI on IL-1β-induced feb rile
rabbits (n =6, x±s)
G roup △T(℃) TRI1
NS 0. 05±0. 03 1. 04±0. 25
DQYI 0. 02±0. 02 0. 15±0. 10
IL-1β 1. 10±0. 17b 18. 35±2. 07b
IL-1β +DQY I 0. 70±0. 08a 10. 61±2. 01a
aP <0. 05 vs IL-1β group;bP <0. 01 vsNS group.
2. 2　大青叶注射液对发热新西兰兔 POAH EP3 mRNA表达
的影响　EP3mRNA原位杂交阳性信号呈棕黄色颗粒 , 分布
于胞质和近端突起中。 NS组和 DQY I组 EP3mRNA原位杂交
呈阴性(不显色)或弱阳性 (胞质中仅见少量淡棕黄色颗粒 ,
细胞不可辨识)(图 2A、 B), 阳性细胞数 、平均灰度值两组间
均无统计学差异(P >0. 05)(表 2);IL-1β 组 EP3 mRNA表达
43ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志(Chin J Ce llM o l Immuno l)2007, 23(1)
明显增强 , 阳性细胞数显著高于 NS组 (P <0. 01)(图 2C),
平均灰度值低于 NS组(P <0. 01);而 DQYI能抑制 IL-1β 诱导
的 EP3mRNA表达 , IL-1β +DQYI组的阳性细胞数低于 IL-1β
组(P <0. 05), 其平均灰度值高于 IL-1β 组(P <0. 05)(表 2,
图 2D)。
表 2　EP3mRNA原位杂交阳性细胞数及平均灰度值变化
Tab 2　Positive ce ll number and average g ray sca le of EP3 mRNA
by ISH (n =30, x±s)
G roup Positive cell number Average gray scale
NS 0. 8±0. 6 178. 36±19. 14
DQYI 0. 7±0. 4 170. 51±16. 12
IL-1β 38. 5±7. 3b 101. 58±10. 01b
IL-1β +DQYI 11. 6±3. 5a 158. 33±13. 90a
aP <0. 05 vs IL-1β group;bP <0. 01 vs NS group.
图 2　各组 POAH EP3 mRNA原位杂交染色
Fig 2　The exp ression of EP3 mRNA in POAH by in situ hybrid ization in
rabb its(×400)
A:NS group;B:DQY I group;C:IL-1β group;D:IL-1β +DQYI group.
A rrow ind icated positive cells of EP3mRNA.
3　讨论
在发热研究中可采用多种动物模型 , 如细菌或
细菌产物 、无菌性炎症 、化学药物 、暴露于高热环境
及刺激下丘脑体温调节中枢等。虽然大多数发热模
型都是通过内生致热原导致下丘脑体温调节中枢调
定点上移 , 从而使机体产热增加 、散热减少 , 体温升
高 , 但不同的外源性致热原在起始阶段的作用途径
不同 , 加之药理学研究要求致热刺激的强度应尽可
能稳定并易于控制 , 所以应根据研究目的和条件选
择致热方法 。发热实验的动物选择中 , 小鼠 、豚鼠恒
温功能差 , 不宜用于复制发热模型;新西兰兔体温恒
定 , 发热反应典型而稳定 , 敏感性和重复性甚佳 。因
此内毒素性或内生致热原性发热新西兰兔模型最为
常用。在药物解热实验中 , 给药时间的选择可以在
致热前或致热后 , 采用中药解热作用的实验研究常
选择在致热前给予受试药物 。本实验室 [ 2, 3]曾多次
使用新西兰兔 IL-1β性发热模型 , 已熟练掌握了其相
应的实验方法 , 故本实验也选用该模型来研究 DQYI
的解热作用及其作用机制 。
在本次实验中 , 给新西兰兔静脉注射 IL-1β 100
ng /只后 , 体温逐渐上升 , 约 60 m in到达发热高峰 ,
最高可达 1.1℃;而预先给予大青叶注射液 , 30 m in
后再注射 IL-1β的新西兰兔 , 其发热高峰和发热时程
均明显减低;而大青叶注射液对正常新西兰兔的体
温没有明显影响。以上结果表明:大青叶注射液对
IL-1β诱导的新西兰兔发热有解热作用。
根据目前的发热理论 , 要想取得解热效果 , 只要
打断发热的某个或某些环节即可 。中药解热作用机
制的研究结果也同样遵循这一规律 。目前认为药物
解热作用的机制包括:直接作用于体温调节中枢 、抑
制内生致热原产生 、抑制下丘脑组织前列腺素 E2
(PGE2)的合成 、降低下丘脑组织内环磷酸腺苷
(cAMP)含量 、降低 N a+ /Ca2+比值 , 增加精氨酸加
压素 (AVP)、促黑细胞刺激素的合成 , 舒张皮肤血管
以及兴奋汗腺促进体内热扩散等。
IL-1β是参与多种致热原性发热的重要细胞因
子[ 4] , IL-1β结合到靶细胞(如巨噬细胞 、内皮细胞 、
小胶质细胞等 )的白介素-1受体 (IL-1R)时 , 其构象
发生改变 , IL-1R即与胞浆内 IL-1 I受体辅助蛋白
(IL-1RacP)结合 , 该复合物吸引并激活髓样细胞分
化因子 (mye loid diffe rentiation factor, MyD88), 通过
Toll样受体信号转导途径促进细胞因子 (IL-1β 、
IL-1α、 IL-6、 TNF、 IL-10等 )的表达 [ 5 - 7] , 进而调节
发热反应 。 PGE2是多种致热原诱导发热的重要中枢
介质 , 中枢 PGE2主要通过与其受体结合引起一系列
与发热有关的细胞功能变化。
PGE2受体有 4种亚型:EP1、 EP2、 EP3、 EP4,
其中 EP2、 EP4与 G蛋白亚基 G s偶联 , 可引起胞内
cAMP水平升高;EP1与 G蛋白亚基 Gq偶联后可升
高胞浆 Ca2+浓度;EP3可与蛋白亚基 G q、G i和 G s偶
联 , 胞内主要效应表现为 Ca2+、 IP3升高和 cAMP升
高。多数学者认为 EP3是介导发热的主要受体 。
EP3主要分布在下丘脑的内侧视前区 (MPO)和正中
视前区(M nPO)[ 8] 。 IL-1β能刺激多种细胞的花生四
烯酸代谢 , 使 PGE2合成增多。 Pierro等[ 9]实验证明
外周生成的 IL-1β 能促进脑血管内皮细胞合成
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PGE2;王达安等 [ 10]采用体外下丘脑组织培养法观察
到 IL-1β能使下丘脑 PGE2 cAMP含量明显升高。故
推测 IL-1β有促进下丘脑组织释放 cAMP的作用 。由
此 IL-1β引起发热的可能机制之一是:IL-1β与终板
血管器 (o rganum vascu lo sm lam inae term inalis, OVLT)
处血管内皮细胞及其周围的巨噬细胞的 IL-1R结合 ,
促进靶细胞内 PGE2合成 , 并以旁分泌形式诱导并结
合于下丘脑温度敏感神经元的 PGE2 受体 , 促进
cAMP的合成 。
因此 , 本课题从这一环节入手 , 在了解大青叶解
热作用的效应后 , 利用 ISH技术 , 观察了大青叶注射
液对兔下丘脑中 POAH EP3 mRNA表达的影响。我
们的实验结果表明 , IL-1β能使 POAH EP3 mRNA表
达增加 , 而大青叶注射液能抑制 IL-1β诱导的 EP3
mRNA表达 。提示其解热作用可能与抑制 EP3mRNA
的表达有关。
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(上接 41页)
即含有 Matrige l胶。我们通过使用专门检测肿瘤细
胞对 ECM黏附与侵袭力的试剂盒 , 进行了转染 siR-
NA后 SW480细胞对 ECM黏附与侵袭力的进一步探
讨 , 结果发现 , 与 3个对照组相比 , ST6G al I siRNA
组细胞对 ECM 的黏附与侵袭力均降低 , 间接说明
ST6Ga l I的确参与了结肠癌细胞的转移过程。
本研究中采用目前较为先进的 RNA i技术 , 设计
并化学合成了靶向 ST6Ga l I的 siRNA , 将其转入结肠
癌 SW480细胞 , 有效干扰和降低了 SW480细胞的
ST6G al ImRNA表达水平及细胞表面 α-2, 6-唾液酸
含量 , 从而使 SW 480细胞黏附和侵袭细胞外基质的
能力也降低 , 表明靶向 ST6G al I的 RNA i不失为一种
降低结肠癌细胞黏附和侵袭细胞外基质的有效手段 ,
有望成为抑制肿瘤转移的基因治疗的一种新途径或
新靶点 。本研究的结果还为下一阶段的深入研究奠
定了良好基础 , 因为 siRNA高效的细胞递呈是 RNA i
技术应用的关键 , 所以进一步的研究拟构建靶向
ST6G al I的 siRNA的腺病毒表达载体 , 以便提高细
胞中 siRNA的表达量 , 延长 RNA i的作用时间 。
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