全 文 ：收稿日期:2013 － 03 － 20;修回日期:2013 － 04 － 07
基金项目:国家自然科学基金(41176144) ;国家海洋公益性行业科研专项经费项目(201205027) ;国家海洋公益性行业科研专项经费项目
(200905021 －3) ;山东省自然科学杰出青年基金资助项目 (JQ200914) ;广东省中国科学院全面战略合作项目(2011A090100040)
作者简介:邵明飞(1988 －) ，男，硕士研究生，研究方向，海洋藻类学及海洋微生物学。
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2013. 04. 093
响应面法优化螺旋藻藻蓝蛋白的超声波提取工艺
邵明飞1，张宏宇2，4，杨金萍3，张允允2，刘兆普1，秦 松2
(1. 南京农业大学 资源与环境科学学院 江苏省海洋生物学重点实验室，南京 210095;
2. 中国科学院烟台海岸带研究所 生物资源实验室，烟台 264003;
3. 烟台大学 生命科学学院，烟台 264003;
4. 中国科学院研究生院，北京 100049)
摘 要:利用超声波破壁技术提取螺旋藻中的藻蓝蛋白，采用响应曲面法对工艺条件进行优化，模型决定系数(R2
= 99. 95%)表明模型的拟合性好，得到的最佳工艺条件为:液料比为 21 mL /g，超声波功率为 640W，超声时间为 14
min。此条件下藻蓝蛋白的得率为 10. 76%，与模型预测值 10. 77%相近。对超声波提取法、冻融法、恒温浸提法进
行比较研究，藻蓝蛋白的得率分别为 10. 76%、7. 89%、6. 57%，得知超声波提取法用时短、藻蓝蛋白得率高。
关键词:超声波提取;藻蓝蛋白;螺旋藻;响应曲面法;比较
中图分类号:TQ936． 2 文献标识码:B 文章编号:2095 － 1736(2013)04 － 0093 － 04
Optimization of the ultrasonic wave extraction technology of the phycocyanin
from Spirulina (Arthrospira)using response surface analysis
SHAO Ming-fei1，ZHANG Hong-yu2，4，YANG Jin-ping3，
ZHANG Yun-yun2，LIU Zhao-pu1，QIN Song2
(1. Key Laboratory of Marine Biology in Jiangsu，College of Resources and Environmental Sciences，Nanjing
Agricultural University，Nanjing 210095;2. Biological Resources Laboratory，Yantai Institute of Coastal Zone
Research，Chinese Academy of Sciences，Yantai 264003;3. College of Life Sciences，Yantai University，
Yantai 264003;4. Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract:Ultrasound technology was used to extract phycocyanin from Spirulina platensis． The effects of processing parameters were
optimized by the response surface methodology (RSM)． The high determination coefficient (R2 = 99. 95%)indicated that the mathe-
matical model was quite accurate to be applied to optimize phycocyanin extraction． The results of the optimization were described as fol-
lows:ratio of PBS to raw material 21 mL /g，ultrasonic power 640W，and extraction time 14 min． The yield of phycocyanin was
10. 76% under these conditions，which perfectly matched the predicted value (10. 77%)． Comparison was made among three different
methods including ultrasonic wave extraction，freezing and thawing extraction and air incubating extraction． The phycocyanin yields
were 10. 76%，7. 89% and 6. 57%，respectively． Ultrasonic wave extraction method achieved a great reduction in time and got the
highest yield．
Keywords:ultrasonic wave extraction;phycocyanin;Arthrospiru (Spirulina)platensis;RSM (response surface methodology) ;com-
parison
藻蓝蛋白作为天然捕光色素蛋白，是由脱辅基蛋 白与藻蓝胆素(开链线性四吡咯)共价结合而成，其基
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本结构由 α 亚基(17000Da)和 β 亚基(19500Da)构成
单聚体(αβ) ，然后单聚体间通过连接肽构成三聚体
(αβ)3或者六聚体(αβ)6，α 亚基 84 位处的半胱氨酸
与 β亚基 84 位处、155 位处的半胱氨酸各通过硫醚键
共价连接藻蓝胆素［1，2］。藻蓝蛋白无毒、无致癌性，具
有抗氧化［3］、抗菌活性［4］、抗癌［5］、保肝护肝［6］、预防糖
尿病［7］、清除自由基［8］等生理活性，其不仅作为天然色
素、营养蛋白用于食品、化妆品行业，而且还可用作治
疗氧化性疾病的药物及生物医药研究的荧光标记
物［9］。藻蓝蛋白是螺旋藻中的一种天然蓝色色素蛋
白，占细胞干重的 10% ～ 20%。中国的螺旋藻养殖加
工技术已相当成熟，螺旋藻干粉年产近万吨，占世界总
产量的 50%以上，这为藻蓝蛋白的规模化制备提供了
原料基础。
诸多因素影响藻蓝蛋白的提取效果，其中细胞破
壁方法、液料比、浸提时间对藻蓝蛋白的提取效果影响
较为显著［10］。超声波破壁技术通过微喷射流和超微
束作用机制［11］，处理物料破壁率高，目的物质提取效
果好，已成为高效提取生物活性物质的必要环节［12，13］。
本实验通过响应曲面模型对藻蓝蛋白的超声波提取工
艺进行优化，得到藻蓝蛋白的最佳提取条件，并将此法
与冻融法、恒温浸提法进行比较，得知超声波提取法用
时短、藻蓝蛋白得率高，适用于藻蓝蛋白的快速检测分
析。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
螺旋藻粉，北海生巴达生物科技有限公司提供;所
有化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;
水为去离子水。
TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用有限
责任公司;DHP-9082电热恒温培养箱，上海一恒科学仪
器有限公司;KQ2200E 超声波清洗器，昆山市超声仪器
有限公司;BT125D电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)
有限公司;JY92 －Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科
技股份有限公司;BCD-209FDG冷藏冰冻箱，青岛澳柯玛
股份有限公司;CT15RT高速台式冷冻离心机，上海天美
科学仪器有限公司;Design Expert software(Version 8． 0．
5． 0)Stat-Ease Inc．，Minneapolis，America。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 提取与分析
称取一定量的螺旋藻粉，加入磷酸盐缓冲液(0. 1
mol /L，pH 值 7. 0，含有 0. 004 mol /L 的叠氮钠) ，混匀
后超声波处理，离心(15000 r /min，15 min) ，吸取 1 mL
上清液，用磷酸盐缓冲液定容至 100 mL，在 620 nm 与
652 nm处测定容量瓶中液体的吸光度，根据下式［14］计
算藻蓝蛋白的浓度:
PC =
A620 － 0． 474 × A652
5． 34
PC，藻蓝蛋白浓度;A620，样品在 620 nm 处的吸光
度;A652，样品在 652 nm处的吸光度。
根据下式计算藻蓝蛋白的得率:
Y = PC × V × nDB × 1000 × 100
Y，藻蓝蛋白得率;PC，藻蓝蛋白浓度;V，磷酸盐缓
冲液体积;n，稀释倍数;DB，螺旋藻粉重量。
1. 2. 2 优化试验设计
采用三因素的 Box-Behnken 设计(BBD)优化提取
工艺参数。根据单因素试验结果，规定了三个因素的
变动范围及中心点值(表 1)。BBD有 17 个析因点，其
中有五个重复的中心点(表 2)。采用 Design Expert 软
件分析实验数据，求解如下表达式:
Y = A0 +∑
3
i = 1
AiXi +
3
i = 1
AiiX
2
i +∑
2
i = 1
∑
3
j = 2
AijXiXj
Y，因变量即藻蓝蛋白得率;A0、Ai、Aii、Aij，模型系
数;Xi，Xj，因素水平。
表 1 Box-Behnken设计的因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
因素 代码
水平
－ 1 0 1
液料比(mL /g) X1 15 20 25
超声波功率(W) X2 620 640 660
超声时间(min) X3 12 14 16
1. 2. 3 不同提取方法的比较
对 3 种不同藻蓝蛋白提取方法进行比较:冻融
法［15］、恒温浸提法［16］、本试验获得的超声波提取法。
2 结果与分析
2. 1 单因素试验
2. 1. 1 液料比对藻蓝蛋白得率的影响
超声波功率 600W，超声时间 14 min，研究不同液
料比对藻蓝蛋白得率的影响。如图 1 所示，当液料比
从 10 mL /g增大到 30 mL /g，藻蓝蛋白得率先升高后下
降。当液料比为 20 mL /g 时，藻蓝蛋白得率最高，为
10. 72%。曲文娟等也得到相似的实验结果，液料比为
20 mL /g时提取效果最好［17］。朱劼等研究结果表明，
粉量为溶剂量的 5%是最佳的提取参数［18］。本文试验
结果与 Sivleira 等的报道不一致，他们的研究结果表
明:液料比为 12. 5 mL /g 时，藻蓝蛋白提取浓度最
大［19］。这可能是由于所用螺旋藻原粉性质不同所致。
Sivleira等用的螺旋藻粉是将螺旋藻泥放于 40℃的烘
箱中烘 48 h得到的，本试验所采用的螺旋藻粉是螺旋
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藻泥喷雾干燥所得。
图 1 液料比对藻蓝蛋白得率的影响
Fig 1 Effect of different ratios of PBS to raw material on extraction yield
2. 1. 2 超声波功率对藻蓝蛋白得率的影响
液料比 20 mL /g，超声时间 14 min，研究不同超声
波功率对藻蓝蛋白得率的影响。当超声波功率从
400W增大到 640W时，藻蓝蛋白得率由 9. 93%升高为
10. 79%(图 2)。超声波功率增大导致细胞膜表面及
周围的空化泡破裂［20］，产生大量的微裂缝及孔洞，促
进物质转移，藻蓝蛋白溶出量增加。当超声波功率从
640W继续增大到 800W 时，藻蓝蛋白得率逐渐降低。
这可能是由于功率的进一步增大，产生的热量无法及
时地散去，溶液温度过高引发藻蓝蛋白的结构受到破
坏而降解，导致得率下降。朱劼等试验结果表明，超声
波功率为 630W时，藻蓝蛋白提取效果最好［18］。然而，
曲文娟等研究结果为:1400W 是最优的超声波功
率［17］。
图 2 超声波功率对藻蓝蛋白得率的影响
Fig 2 Effect of different ultrasonic power on extraction yield
2. 1. 3 超声时间对藻蓝蛋白得率的影响
液料比 20 mL /g，超声波功率 600W，研究不同超
声时间对藻蓝蛋白得率的影响。当超声时间从 10 min
延长到 14 min时，藻蓝蛋白得率显著提高(图 3)。延
长超声时间可引发更多的空化泡破裂，更多的溶剂进
入细胞，促使物质转移［21］。当超声时间从 14 min继续
延长，藻蓝蛋白得率下降，可能是产生的热量不能及时
散去导致藻蓝蛋白分解。
图 3 超声时间对藻蓝蛋白得率的影响
Fig 3 Effect of different extraction time on extraction yield
2. 2 响应面法优化
采用 Design Expert软件对表 2 的实验结果进行回
归拟合，得到藻蓝蛋白得率对三个因素的多元二次回
归模型:
Y = 10. 73 + 0. 36X1 － 2. 5 × 10
－3 X2 － 0. 02X3 －
0. 85X21 － 0. 2X
2
2 － 0. 27X
2
3 + 0. 045X1X2 － 0. 015X2X3
表 2 Box-Behnken试验设计与试验结果
Table 2 Results of Box-Behnken design
试验编号 X1 X2 X3 藻蓝蛋白得率(%)
1 － 1 0 1 9. 25
2 0 0 0 10. 74
3 1 0 1 9. 93
4 0 0 0 10. 75
5 0 － 1 1 10. 25
6 － 1 － 1 0 9. 36
7 0 － 1 － 1 10. 26
8 － 1 1 0 9. 26
9 0 0 0 10. 72
10 0 0 0 10. 73
11 1 － 1 0 10. 01
12 0 0 0 10. 73
13 － 1 0 － 1 9. 29
14 1 1 0 10. 09
15 0 1 1 10. 22
16 1 0 － 1 9. 97
17 0 1 － 1 10. 29
从表 3 二次响应面回归模型的方差分析结果可
知，回归模型高度显著(P 值 ＜ 0. 0001)、失拟项不显
著(P 值 = 0. 0834 ＞ 0. 05)、R2 = 99. 95%、R2adj =
99. 89%、C． V． = 0. 18，这些数据表明回归方程拟合度
和可信度均很高，能很好地对最优工艺条件进行预测。
表 3 回归模型方差分析结果
Table 3 Analysis results of regression and variance
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 p值
模型 4. 79 9 0. 53 1572. 29 ＜ 0. 0001
残差 2. 370 × 10 －3 7 3. 386 × 10 －4
失拟项 1. 850 × 10 －3 3 6. 167 × 10 －4 4. 74 0. 0834
误差项 5. 200 × 10 －4 4 1. 300 × 10 －4
总和 4. 79 16
R2 = 99. 95%;R2Adj = 99. 89%;CV = 0. 18
表 4 回归方程系数显著性检测结果
Table 4 Significance of regression coefficients
变异来源 回归系数 自由度 标准误差 F值 p值 显著性
常数项 10. 73 1 8. 229 × 10 － 3
X1 0. 36 1 6. 505 × 10 － 3 2977. 81 ＜ 0. 0001 ＊＊
X2 － 2. 5 × 10 － 3 1 6. 505 × 10 － 3 0. 15 0. 7122
X3 － 0. 02 1 6. 505 × 10 － 3 9. 45 0. 018 *
X12 － 0. 85 1 9. 2 × 10 － 3 23. 92 0. 0018 ＊＊
X22 － 0. 2 1 9. 2 × 10 － 3 0. 000 1. 0000
X32 － 0. 27 1 9. 2 × 10 － 3 2. 66 0. 1470
X1X2 0. 045 1 8. 967 × 10 － 3 8974. 55 ＜ 0. 0001 ＊＊
X1X3 0. 000 1 8. 967 × 10 － 3 520. 08 ＜ 0. 0001 ＊＊
X2X3 － 0. 015 1 8. 967 × 10 － 3 937. 07 ＜ 0. 0001 ＊＊
＊差异显著(P值 ＜ 0. 05) ，＊＊差异极显著(P值 ＜ 0. 01)
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由回归方程系数显著性检测结果(表 4)可知，试
验中一次项 X1极显著、X2不显著、X3显著;二次项 X
2
1极
显著、X22不显著、X
2
3不显著;交互项均为极显著。
根据 Box-Behnken 试验结果作响应曲面图，考察
拟合的响应曲面的形状，分析液料比、超声波功率、超
声时间三者之间交互作用对藻蓝蛋白得率的影响，其
响应曲面如图 4、5、6 所示。
利用 Design Expert 软件对模型方程求解，得到响
应值藻蓝蛋白得率最大值为 10. 77%时，液料比、超声
波功率、超声时间相应值为 21. 05 mL /g、640. 35W、
13. 93 min。按照模型预测的最优条件，根据实际情
况，在液料比为 21 mL /g、超声功率为 640W、超声时间
为 14 min的工艺条件下进行验证性试验，得到的藻蓝
蛋白得率(10. 76 ± 0. 087)%(n = 3)和预测值吻合较
好，表明该模型工艺参数准确可靠，能较好地预测实际
情况。
2. 3 不同提取方法比较
从图 7 可知，超声波提取法藻蓝蛋白得率为
10. 76%，冻融法藻蓝蛋白得率为 7. 89%，恒温浸提法
藻蓝蛋白得率为 6. 57%。不同方法对螺旋藻细胞壁
的破坏程度不同，导致藻蓝蛋白溶出量各异。超声波
提取法半天即可完成测定工作，而另外两种方法所需
时间较长。
图 7 不同提取方法对藻蓝蛋白得率的影响
Fig 7 Effect of different extraction methods on extraction yield
3 结论
1)由单因素试验和 Box-Behnken 试验设计及分析
结果得到的超声波提取螺旋藻中藻蓝蛋白的最佳工艺
条件为:液料比为 21 mL /g、超声波功率为 640W、超声
时间为 14 min，此时藻蓝蛋白得率为 10. 76%。
2)对不同提取方法进行比较，结果表明，超声波提
取法操作时间短、藻蓝蛋白得率高。本方法适用于藻
蓝蛋白的快速检测分析。
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对实验组 94 位学生进行无记名 PBL 教学效果问
卷调查，结果如表 2 所示。80% 以上的学生都认为
PBL教学有助于他们对相关知识的掌握，并能拓宽知
识面。同时他们也发现自己的综合素质，如自学能力、
团队协作能力、沟通和交流能力以及发现问题及解决
问题的能力也有所提高。
5 结语
为了提高教学质量，促进学生综合素质的提高，近
年来我们积极进行教学改革，结合微生物学课程特点，
将 PBL教学模式引入课堂，受到了学生的欢迎，获得了
很好的教学效果。实践结果表明，通过 PBL教学，学生
对微生物课程产生浓厚的兴趣，学习积极性和主动性
被激发，自主学习意识提高，同时学生的自学能力、合
作意识、沟通能力等综合素质也得到显著提升。PBL
是一种理想的教学方法，值得在微生物教学中推广。
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第 30 卷第 4 期
2013 年 8 月
生 物 学 杂 志
JOURNAL OF BIOLOGY
Vol. 30 No. 4
Aug，2013
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