全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Bio technology　2004 , 11(3):161 ～ 164
分子排阻色谱法测定螺旋藻多糖纯度和分子质量
张　 ,尹鸿萍 ,王　 ＊ ,乐晓桐
(中国药科大学生物制药教研室 , 江苏 南京 210009)
摘　要　使用分子排阻色谱法 ,用已知平均分子质量的硫酸化葡聚糖作为标准 ,分别用 5 种不同的流动相 ,
在 Shodex Sugar KS 柱上测定螺旋藻多糖的纯度以及分子质量 , 使用线性回归得出校正曲线。并且通过对结果
进行多种方法学的考查 ,选取最佳的分析条件。
关键词　螺旋藻多糖;分子排阻色谱;分子质量;方法学考查
中图分类号:Q539　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2004)03-0161-04
　　近30 年来发现多糖具有复杂丰富的生物活
性和功能 ,而具有硫酸根基团以及磷酸根基团的
酸性多糖 ,更是受到国内外学者的重视 。其中从
钝顶螺旋藻中提取的螺旋藻多糖(S pirulina
Platensis polysaccharide PSP)有明显的抗衰老 ,抗
病毒 ,修复 DNA 损伤 , 提高机体免疫和抑制癌
症[ 1]的作用 。对于多糖的研究 ,首要的问题是纯
度和分子质量的测定 。过去常用的测定方法有超
离心 、高压电泳 、渗透压法 、粘度法和光散射法
等[ 2] ,这些方法均操作繁琐而且误差很大 。70年
代以后 ,由于耐压合成凝胶的出现 ,可以应用分子
排阻色谱法高压凝胶渗透色谱法 ,HPGPC 来测定
多糖的纯度和分子质量 ,它具有快速 、高分辨和重
现性好的优点[ 3] 。根据经验公式 ,多糖的分子质
量 m 和分配系数 K av ,洗脱体积 V e存在如下关系:
Kav=K1 -K2 lgM ;Kav =(V e-V0)/(V t -V0)。
因此可以使用已知分子质量的标准多糖作出标准
曲线 ,再用线性回归求得样品的分子质量[ 4] 。现
今国内外文献报道的多是对中性多糖 HPGPC 的
层析条件 ,而对于象 PSP 这样的酸性多糖 ,由于
硫酸根和磷酸根在不同的缓冲系统中的解离情况
不同从而会使 PSP 带上不同的电荷 ,造成 PSP 在
HPLC 中的层析行为的差异 ,因此为了消除电荷
的影响 ,必须调整展开剂的 pH ,离子强度和离子
种类等 ,以减小离子间的静电效应 ,达到良好的排
阻分级效果 。
1　材料和方法
PSP精品(本实验室制备);硫酸化葡聚糖
(Sigma公司 ,M r 5 000 , 8 000 ,10 000和 500 000);
超纯水(总声 MUL-9000型实验室小型超纯水系
统);其他化学试剂均为国产分析纯;Agilent 高效
液相色谱仪:在线脱气机(Degasser/ JP);四元泵
(Quatpump/DE);自动进样器(ALS/DE);柱温箱
(Colcom/DE);示差折射检测器(RID/CN)以及
Agilent工作站 ,分析软件:Agilent data analy sis 和
Agilent GPC analysis , 色谱柱:Shodex Sugar KS-
804柱(8 mm×30 cm);Shodex Sugar KS-802柱(8
mm×30 cm)。
HPGPC流动相:A:H2O ,B:0.01 mol/L NaAc-
HAc(pH值 5.0),C:0.01mol/L NaAc-HAc(pH值 6.
0), D:0.01 mol/L KH2 PO4-NaOH(pH 值 7.6),
E:0.01mol/L Tris-HCl(pH 值 8.0)[ 5] ,(均用无油真
空泵经 G-5 玻璃漏斗抽滤)。样品溶于缓冲液 ,
4mg/ml ,离心 10 min(12 000 r/min),上清液再经
0.45μm的微孔滤膜 ,进样20μl。流速:1.0 ml/min;温
度50 ℃。
标准曲线的绘制:准确称取 Dex tran Sulfate[ 6]
5 000 ,8 000 , 10 000 各 2.5 mg 溶于 1 ml流动相 ,
Dextran Sulfate 500 000 , 1 mg 溶于 2 ml流动相 。
从小分子质量到大分子质量依次每个标准品进样
20μl。流速:1.0 ml/min;温度50 ℃。
161
收稿日期:2003-10-28　修回日期:2004-03-23
作者简介:张 ,男 , 1979年生 ,江苏省苏州人 ,硕士研究生。 E-mail:zyangsz@hotmail.com
联系人:王　 ,教授
2　结　果
2.1　HPGPC 测定 PSP 纯度
图 1表明在流动相 A 中样品扩散得极为严
重 ,且大分子和小分子之间的分离度极差。在流动
相 D和 E中 ,样品的扩散现象有所改善 ,大分子与
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(A)H2O;(B)0.01 mol/ L NaAc-HAc(pH5.0);(C)0.01 mol/ L
NaAc-HAc(pH6.0);(D)0.01 mol/ L KH2PO 4-NaOH(pH7.6);(E)
0.01 mol/ L Tris-HCl(pH8.0)
F ig 1 　Chromatogram of psp useing Shodex Sugar KS-804
combining KS-802 Column w ith five different mobile phases
小分子之间的出峰时间拉大 ,得到了有效的分离 。
同样在流动相 B和 C 中样品的扩散现象也得到抑
制 ,分离度进一步提高。特别是在流动相 B 中分
离效果更好。
2.2　系统适用性试验
Tab 1　Results of HPLC sy stem applicability ex amination in
five different mobiles
Mobile phase tR(min) tT(min) t0(min) K d
A 10.319 19.734 5.944 0.317
B 10.725 19.731 5.947 0.347
C 10.718 19.725 5.946 0.346
D 10.765 19.723 5.951 0.350
E 10.603 19.732 5.942 0.338
　　选用蓝色葡聚糖 ,测试完全被填料颗粒网孔排
阻的大分子的保留时间 t0 ,选用葡萄糖 ,测试能自
由进出填料颗粒网孔的小分子的保留时间 tT ,PSP
样品的保留时间为 tR ,分配系数 Kd =(tR-t0)/(tT-
t0)。
由于表 1中结果表明 ,PSP 在选用的 5种不同
流动相的 HPLC 系统中均为选择性渗透 ,说明选
用 Shodex Sugar KS柱系统无误 。
2.3　PSP 的 HPGPC 的方法学考察
2.3.1　进样精密度实验
2.3.1.1　精密度实验　在流动相 B中 ,同一样品
连续进样 5次 ,对其峰面积进行精密度考查 。各个
流动相的 RSD 为流动相 A:3.58 %, B:0.723 %,
C:0.885 %,D:1.63 %,E:1.13 %
2.3.1.2　重复性实验　对于同一样品在不同流动
相中重复进样 5次 ,结果见表 2 。
Tab 2　Retention times of PSP in different mobile phases
Mobile
phase 1
Peak
2
Time
3
(min)
4 5
Mean
(min)
RSD
(%)
A 10.298 10.379 10.334 10.313 10.270 10.319 4.094
B 10.725 10.722 10.723 10.725 10.729 10.725 0.268
C 10.707 10.715 10.723 10.726 10.719 10.718 0.742
D 10.750 10.779 10.755 10.765 10.776 10.765 1.267
E 10.606 10.587 10.623 10.626 10.573 10.603 2.288
2.3.1.3　进样时间的考查
样品处理完成后于 2 , 4 , 6 , 8 , 10 , 12 , 16 , 20 ,
24 h分别进样 , 其出峰时间 RSD %:流动相 A:
4.562 %,B:0.323 %, C:0.656 %, D:1.564 %,
E:3.065 %
162 药 物 生 物 技 术 第 11 卷第 3 期　
2.3.2　进样量的考查　将样品以 4 , 8 ,16 , 24 ,32 ,
40mg/ml分别进样 ,其出峰时间 RSD %:流动相A:
32.12 %, B:11.91 %, C:16.67 %, D:21.12 %, E:
25.32 %。
2.3.3　PSP 样品在不同流动相中的 GPC 检测　
表 3表明 PSP 在不同流动相中的测得的平均分子
质量和分子质量分布均不相同。流动相 B , C , D中
PSP的分子质量分布相似 ,且平均分子质量接近 ,
在流动相 B中 PSP 的分子质量分布范围最窄。因
此选用流动相 B作为 PSP 的 GPC 的检测流动相 ,
所得的 PSP 的平均相对分子质量为 26万 ,相对分
子质量分布为 5万至 65万。
Tab 3　GPC determination results of sample in different mobile phases
Mobile phase A B C D E
Averge of Mw(e5) 0.7747 2.643 2.682 3.508 1.996
Distrubution of Mw(e5) 0.01794～ 491.9
0.5308
～ 6.581
0.3774
～ 7.860
0.2366
～ 9.776
0.1753
～ 16.04
Mn(e4) 0.01712 5.832 3.201 9.538 2.209
Mw(e5) 386.1 3.633 4.202 3.835 3.132
Standard curve
lg Mw=-2.980tR
+35.67
lgMw=-1.781tR
+24.52
lgMw=-1.649tR
+23.06
lgMw=-1.252tR
+19.02
lgMw=-2.412tR
+30.88
3　讨　论
(1)实验室制得的 PSP 经过聚丙烯酰胺电泳
检测为单一峰 ,而通过分子排阻色谱法检测仍有杂
质峰 ,证明分子排阻色谱 HPLC 检测法的准确性
更高 。
(2)PSP 为酸性多糖 ,带有电荷 ,在不完全惰
性的凝胶柱上 ,样品与凝胶发生吸附作用。由于
PSP 在水中解离情况的不一致 ,造成样品严重扩
散。同样吸附作用所导致的样品的出峰时间的推
迟也使得测出的 PSP 表观分子质量的明显偏小 。
(3)对于酸性多糖样品 ,其等电点和分子质量
并非均一值 ,而是在一定范围内呈正态分布。通过
等电聚焦电泳法测得 PSP 样品等电点范围约为
6.0 ～ 8.0。所以在流动相 B 中可以认为样品解离
被抑制 ,在 C和 D中部分解离 ,解离程度 D>C ,在
E中 PSP完全解离。结合高效图谱和GPC检测所
得的数据 ,可以认为在无法获得完全惰性的固定相
的情况下 ,样品电荷的有无以及所带电荷的数量对
于样品的 HPLC行为具有重要的影响。当抑制样
品的解离程度时 ,可以很好地排除固定相对于溶质
的吸附作用 ,从而使分析结果具有良好的重现性 ,
并且可以在一定程度上抑制溶质的扩散 ,有效改善
峰形 ,提高分析方法的准确性 。
(4)由于多糖为一松散的线性结构 ,其粘度远
大于相同分子质量的蛋白质 ,所以在GPC 检测中 ,
为了降低粘度对于样品层析行为的影响 ,通常采用
两种方法:一是尽可能降低溶液的浓度;二是尽可
能提高整个系统的温度 。由于多糖没有紫外吸收 ,
所以一般采用示差折射检测器 RID , RID为中等灵
敏度的通用检测器 ,其检测下限一般为 20μg ,而且
为了保证能够准确测出小量的杂质 ,一般进样量要
大于 50μg 。通过对进样量的考查可以得知不同的
进样量对分析结果有很大的影响 。随着进样量的
加大导致出峰时间的延长和峰型的扩散。因此根
据仪器的检测限和 PSP 样品的具体情况 , 选择
GPC进样量为 80 μg 。而市售的商品柱对于温度
也有一定的要求 ,因此选择 Shodex 柱可以耐受的
40 ℃～ 50 ℃来分离样品 。
(5)HPGPC 法测定大分子物质的 M r时 ,色谱
柱的淋出体积真正反映的是试样的流体力学体积 ,
因而只能用于测定与标准品相同的试样 ,不同类型
的大分子当 M r相同时它们的流体力学体积并不
相同 ,因此当使用不同的标准品时测定结果有较大
差异 。为了给出真实的 M r ,应选择与被测样品相
同的标准品或结构相似的标准品为好 ,否则误差较
大。PSP为中等分子质量的海洋硫酸多糖 ,其分子
本身带有电荷 ,因此选用也带有硫酸根基团的硫酸
化葡聚糖(Dextran Sulfate)作为标准品。而市场上
所售的 Dextran Sulfate 标准品只有 4种分子量 ,因
此标准曲线也只能选用 4个点。
(6)Shodex 公司的 Sugar KS系列柱为根据分
子排阻原理进行多糖分离的专用柱 ,其中 KS-802
排阻限为10 000 ,KS-804排阻限为 1 000 000。根
163张　 等:分子排阻色谱法测定螺旋藻多糖纯度和分子质量
据 Dextran Sulfate 标准品相对分子质量最小为
5 000 ,最大为 500 000 ,而 PSP 样品的大致 M r在
250 000左右 ,因此选用 KS-804与 KS-802串联
从而可以提高柱效和分离度 ,得到准确的结果 。
参考文献
[ 1] 　Liu YL , Mu XS , Yan M.Anti-aging effect s of polysaccharide of
S pi rulina Platensis [ J] .China Pharmacol B ul l , 1998 , 4(4):
362.
[ 2] 　方积年.多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子质量测定[ J] .
药学通报, 1984 , 19:46.
[ 3] 　张惟杰.糖复合物生化研究技术[ M] .杭州:浙江大学出版
社.1994 ,158.
[ 4] 　多糖的分子量与分子量分布测定法[ M] .中华人民共和国药
典二部 2000版 ,附录 VH , 39.
[ 5] 　Liu CP , Bao XF , Fang JN.Retention Behaviors of Uronic
Acid-containing Polysaccharides and Neut ral Polysaccharides in
HPGPC[ J] .Chinese Chemical Letters , 2001 , 12(10):909.
[ 6] 　吕志华 ,于广利 ,赵峡.不同标准品对 HPGPC法测定多糖相
对分子质量的影响[ J] .中国新药杂志 , 2002 , 11(3):220.
Determination of Purity and Molecular Weight of Spinulina Platensis
Polysaccharide by High Performance Gel Permeation Chromatography
ZHANG Yang ,YIN Hong-ping ,WANG Min , LE Xiao-tong
(Department of Biopharmacy , China pharmaceutical University , Nanjing 210009 , China)
Abstract　Spirul ina Platensis polysaccharide(PSP)was prepared in our laboratory .Its purity and molecular
w eight were determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC).The HPGPC system
consisied of a two-column set ,Shodex Sugar KS-804 and KS-802 columns.The MW of sample w as determined
from the standard curves w hich were made by standard Dextran Sulfates.We choosed the best condi tion by
the determination of content to the HPGPC results of PSP in five different mobile phases.
Key words　Spirulina Platensis , Polysaccharide , HPGPC , Molecular Weight , Determination of content
·信　息·
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