全 文 ：龙牙楤木总皂苷对缺氧 /再给氧心肌细胞损伤的保护作用
孙桂波 ,徐惠波 ,温富春 ,张　伟 ,丁　涛 ,孙晓波
(吉林省中医中药研究院新药中心 , 吉林 长春　130021)
收稿日期:2006 -04-11,修回日期:2006-06-18
基金项目:国家中医药管理局资助课题(No2000-J-P-23)
作者简介:孙桂波(1973-), 女 ,博士 ,现为华南师范大学生命科学
学院博士后 ,研究方向:心血管药理学 , E-mail:sunguibo@
126.com;
孙晓波(1958-),男 , 博士 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方
向:药理学 ,通讯作者 , Tel:0431-6816859, E-mail:sun-xiao-
bo@ 163.com
中国图书分类号:R-332;R 284.1;R 322.11;R 345.49;
R345.57;R329.2;R542.201;R845.22;R977.3
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2006)09-1092-04
摘要:目的　探讨龙牙楤木总皂苷(As)对培养心肌细胞缺
氧 /再给氧损伤的保护作用及其机制。方法　取体外培养的
乳大鼠心肌细胞建立缺氧 /再给氧心肌细胞损伤模型 ,实验
分为 5组:空白对照组;模型组(A/R组), 缺氧 6 h再给氧 3
h;3个 As给药组 ,缺氧 6 h再给氧 3 h, 并于缺氧及再给氧开
始时分别加入终浓度为 1.25、 2.5、 5.0 mg· L-1的 As, 观察
As对细胞上清液中缺氧及再给氧后 LDH、CK漏出量 、MDA
含量 、SOD活性的影响。用 MTT法检测 As对缺氧再给氧损
伤心肌细胞线粒体的保护作用。结果　As可抑制缺氧及再
给氧后 LDH、CK漏出量 ,降低 MDA含量 ,提高 SOD活性 , 升
高 OD570吸光度值。结论　As对培养心肌细胞的缺氧再给
氧损伤具有保护作用 , 提示其作用机制与增强细胞抗氧化作
用 , 减少自由基及脂质过氧化物导致的细胞膜损伤有关。
关键词:龙牙楤木总皂苷;心肌细胞培养;超氧化物歧化酶;
乳酸脱氢酶;肌酸激酶
　　龙牙楤木 [ AraliaelatamandshuricaRupretMax-
im]系五加科楤木属植物。其性味辛苦 ,有小毒 ,药
用部位主要是根皮 、树皮及叶。具有补气安神 、活血
化瘀 、利尿消肿 、除湿止痛之功效。研究表明龙牙楤
木总皂苷(aralosides, As)具有明显的抗心肌缺血作
用 [ 1] 。为进一步探讨其作用机制 ,本试验采用原代
培养的 Wistar大鼠心室肌细胞 ,利用缺氧再给氧环
境模拟心肌细胞缺血 /再灌注损伤 ,在细胞水平上探
讨 As对缺氧再给氧心肌细胞损伤的保护作用。
1　材料与方法
1.1　动物 、药品与试剂　新生 1 ～ 4 d的 Wistar大
鼠 30只 , ♂♀,购于长春高新医学动物实验研究中
心 ,合格证号:10-5112;As(吉林省中医中药研究院
新药中心化学室提供 ,纯度:98%,批号 20021008);
DMEM/F12、胰蛋白酶 (Gibco公司);L-谷氨酰胺 、
MTT(Sigma公司);青霉素 、链霉素(华北制药股份
有限公司);胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究
所);PBS液 、Hanks液由国产分析纯试剂配制。超
氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、丙二醛
(malondialdehyde, MDA)试剂盒购自南京建成生物
工程公司;乳酸脱氢酶 (lactatedehydrogenase,
LDH)、肌酸激酶(creatinekinase, CK)试剂盒均购
自中生北控生物科技服务股份有限公司 。
1.2　心肌细胞的分离与培养　按文献 [ 2]方法并略
加改进 ,新生大鼠无菌条件下取心室肌 , 放入 PBS
液中清洗 2 ～ 3次 ,放入无血清的 DMEM/F12培养
液中 ,剪成 1 ～ 1.5 mm3的碎块 ,移入离心管中 , 50 ×
g离心 3 min,弃上清 ,加入 0.08%的胰酶置于 37℃
水浴中 ,分 6 ～ 7次消化 ,每次消化 10 min。第 1次
弃上清 ,从第 2次起收集心肌细胞 ,并过 200目筛 ,
80 ×g离心后加入含 15%胎牛血清的 DMEM/F12
培养液制成细胞悬液 ,在 CO2培养箱中培养 2 h,以
差速分离法去除已贴壁的成纤维细胞 ,取上清液计
数并稀释细胞密度为 5 ×108· L-1。接种于 24孔
板 ,每孔 1 ml,于 37℃在 CO2培养箱中静置贴壁培
养。每 24 h更换 1次培养液 , 72 h后选生长状态良
好的心肌细胞进行实验 。
1.3　缺氧 /再给氧及给药处理 　参照文献 [ 3] 方法
进行实验处理。实验分 5组 ,每组 4孔 ,重复 3次。
空白对照组:用有糖 Hanks液 2 ml, CO2培养箱培养
6 h后换液 1次 ,再培养 3 h;A/R模型组:以氮饱和
(含 N2 99.9%)的无糖 Hanks液冲洗 2次 ,换氮饱和
的无糖 Hanks液 2 ml置持续通以 95% N2 -5% CO2
混合气的厌氧培养箱中 , 37℃培养 6 h。再换入有糖
Hanks液 2 ml,置持续通以 95% O2 -5% CO2混合气
的 CO2培养箱中 , 37℃培养 3 h;给药组:缺氧开始
及复氧开始时分别加入终浓度为 1.25、2.5、5.0 mg
·L-1的 As,其余过程同模型组。
1.4　培养液中 LDH、CK漏出量 、MDA的含量及
SOD活性测定　分别取缺氧 6 h及再给氧 3 h时细
胞培养液 ,紫外分光光度法测定 LDH含量;N-乙酰
半胱氨酸法测定 CK含量;硫代巴比妥酸法测定
·1092· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2006 Sep;22(9):1092 ～ 5
MDA含量 ,黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性。
1.5　MTT法测定心肌细胞存活率 [ 4] 　取实验处
理后的心肌细胞 ,吸弃培养液 ,每孔加入 5 g· L-1
MTT200 μl, 37℃孵育 4 h,弃培养液 ,加入 600 μl
DMSO震荡至形成的结晶完全溶解 ,用酶标仪比色 ,
检测 570 nm处的吸光度(A570 nm)值 。无细胞含培
养液的培养孔调零。
1.6　统计学处理　数据用 x±s表示 ,组间数据用
SPSS10.0软件进行 t检验 。
2　结果
2.1　As对培养乳大鼠心肌细胞乳酸脱氢酶和肌酸
激酶漏出量的影响 　培养心肌细胞缺氧或正常
Hanks液培养 6 h后 ,分别测定空白对照组 、模型组 、
缺氧加药组及再给氧 3 h后各组培养液中 LDH、CK
的漏出量。结果见 Tab1,模型组心肌细胞培养液中
的 LDH、CK漏出量显著高于空白对照组。与模型
组相比 , As2.5、5.0 mg· L-1组能降低心肌细胞
LDH、CK的漏出量(P<0.01),再给氧 3 h后 ,模型
组及各给药组 LDH和 CK的漏出量均有所增加 ,但
As2.5、5.0 mg·L-1剂量组与模型组相比均降低(P
<0.01)。
2.2　As对培养乳大鼠心肌细胞丙二醛生成量和超
氧化物歧化酶活性的影响　由 Tab2结果可见 ,缺
氧与再给氧损伤后 MDA含量升高 、SOD活性降低 ,
As组在缺氧后即表现出明显的降低 MDA含量 、升
高 SOD活性的作用 ,与模型组相比差异具有显著性
(P<0.01)。再给氧 3 h时 , As各剂量组均可使
MDA含量降至空白对照组水平 ,与模型组相比 P<
0.01。各剂量组和模型组 SOD活性明显升高 ,但 As
各剂量组与模型组相比差异有显著性(P<0.01)。
2.3　As对培养乳大鼠心肌细胞存活率的影响　由
Tab3结果可见 ,缺氧及再给氧造成心肌细胞存活
率降低 , As3个剂量组可提高细胞存活率 ,与模型
组相比 P<0.01。
3　讨论
　　本实验利用原代培养的心室肌细胞 ,建立缺氧
再给氧的病理模型 ,首次从细胞水平研究 As对心肌
细胞的直接作用。培养的心肌细胞缺氧再给氧后 ,
能量代谢紊乱 ,线粒体功能异常 ,其代谢功能及形态
结构均发生改变 , 细胞损伤甚至坏死 ,与活体内缺
血 /再灌注损伤相似 。LDH、CK是心肌细胞胞内酶 ,
其漏出量的多少反应细胞膜的受损程度。 As可使
缺氧再给氧后培养液中 LDH、CK含量明显下降 ,提
高心肌细胞的存活率 ,提示 As可减轻细胞膜的损伤
程度 ,降低细胞膜通透性 ,具有膜稳定作用。
　　临床上 CK用于心肌梗死的早期诊断 ,其特异
性较 LDH更高 , CK活性在急性心肌梗塞发病后 4
～ 6 h即明显升高 ,而 LDH活性在发病后 24 ～ 48 h
开始上升 [ 5] 。本实验中心肌细胞经再给氧 3 h处理
CK的漏出量与缺氧 6 h时相比虽有增高的趋势 ,但
差异未见显著性。而 LDH却见升高 ,分析可能是由
于 CK较 LDH对缺氧损伤更为敏感 ,缺氧 6 h时已
接近峰值 ,经再给氧 3 h处理虽略有增加 ,但增加幅
度较小 。心肌细胞在缺氧及再给氧时由于氧自由基
Tab1　EfectofdeglucoseAsonLDHandCKeffluxinculturemedium of
neonatalratmyocardialcelsafteranoxia/ reoxygenationinjury x±s, n=12
Group LDH/mmol· min-1· L-1Anoxia6 h Reoxygenation3 h
CK/mmol· min-1· L-1
Anoxia6 h Reoxygenation3 h
Control 23.6 ±8.2 23.9±7.7 19.1 ±4.4 19.9±2.8
A/R 35.1 ±7.1## 132.2±18.0## 27.2 ±3.2## 28.2±3.7##
A/R+As1.25 mg· L-1 34.2 ±8.6 122.1±21.4 24.7 ±4.8 26.7±3.5
A/R+As2.5 mg· L-1 27.2 ±8.6＊＊ 107.8±21.0＊＊ 22.5 ±3.7＊＊ 23.3±4.2＊＊
A/R+As5.0 mg· L-1 25.9 ±6.6＊＊ 88.6±10.4＊＊ 20.2 ±2.8＊＊ 21.6±3.9＊＊
　　##P<0.01 vscontrol;＊＊P<0.01 vsA/Rgroup
Tab2　EffectofAsonMDAcontentandSODactivityofneonatalratmyocardialcelsinjuredbyanoxia/reoxygenation x±s, n=12
Group MDA/nmol· L
-1
Anoxia6 h Reoxygenation3 h
SOD/kU· L-1
Anoxia6 h Reoxygenation3 h
Control 2.28 ±0.45 2.28±0.71 21.89 ±0.83 22.60±0.66
A/R 5.05 ±1.19## 4.71±1.27## 1.48 ±0.86## 18.07±0.99##
A/R+As1.25 mg· L-1 2.77 ±0.68＊＊ 2.54±0.26＊＊ 4.88 ±0.78＊＊ 17.34±0.35
A/R+As2.5 mg· L-1 2.39 ±0.39＊＊ 2.41±0.29＊＊ 4.85 ±0.93＊＊ 20.09±0.83＊＊
A/R+As5.0 mg· L-1 2.35 ±0.63＊＊ 2.32±0.42＊＊ 6.26 ±0.75＊＊ 20.36±1.25＊＊
　　##P<0.01 vscontrol;＊＊P<0.01 vsA/Rgroup
·1093·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2006 Sep;22(9)
Tab3　EfectofAsonviabilityofculturedmyocardialcels
injuredbyanoxia/reoxygenation( x±s, n=12)
Group MTT/A570 nm
Control 0.8657±0.0120
A/R 0.6121±0.0059##
A/R+As1.25 mg· L-1 0.6504±0.0096＊＊
A/R+As2.5 mg· L-1 0.6555±0.0165＊＊
A/R+As5.0 mg· L-1 0.6603±0.0177＊＊
　　##P<0.01 vscontrol;＊＊P<0.01 vsA/Rgroup
的生成 ,引起细胞膜脂质过氧化 ,破坏细胞膜的通透
屏障 , 心肌细胞内的心肌酶因细胞的损伤而漏
出 [ 4] 。MDA是体内氧自由基攻击生物膜脂质过氧
化的产物 ,测定细胞内 MDA的含量能够间接反应
细胞损伤程度;SOD是体内重要的抗氧化酶之一 ,
它可清除超氧阴离子 ,使机体免受损伤。其值高低
间接反应了机体清除氧自由基的能力 [ 6] 。本实验
中发现再给氧 3 h时 ,各剂量组和模型组 SOD活性
较缺氧 6h时明显升高 ,主要是由于在正常的生物体
内 ,自由基的形成和清除处于一种相对稳定的动态
平衡 ,再给氧后 ,自由基迅速增多 ,为清除自由基 ,细
胞内的 SOD水平代偿性增加 ,呈一种防御性代偿反
应表现 [ 7] 。但过多的自由基又对细胞造成了过氧
化损伤。 As可显著降低缺氧及再给氧心肌细胞
MDA的生成量 ,提高 SOD活性 。说明 As可能通过
增强机体清除氧自由基的能力 ,减轻细胞膜的脂质
过氧化损伤从而发挥对细胞膜的保护作用 。
　　本实验结果与以往报道的 As能显著减少缺血
心肌组织 CK的释放 , 改善心肌缺血时脂肪酸
(FFA)代谢 ,保护缺血心肌组织 SOD活性结果相一
致 [ 1] 。提示其抗心肌缺血的作用机制与抗氧自由
基损伤有关 。
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Protectiveefectsofaralosidesonculturedmyocardialcels
subjectedtoanoxia/reoxygenationinjury
SUNGui-bo, XUHui-bo, WENFu-chun, ZHANGWei, DINGTao, SUNXiao-bo
(CenterofNewMedicine, AcademyofTraditionalChineseMedicinesandMateriaMedicaof
jilinProvince.Changchun, Jilin　130021, China)
Abstract:Aim　Tostudytheprotectivemechanismof
aralosides(As)onmyocardialcelsinjuredbyanoxia/
reoxygenation(A/R).Methods　Ananoxia/reoxy-
genationmodelofmyocardialcelsfromneonatalWistar
ratswasestablished.Thecelswererandomlydivided
into5 groups:control, withoutanytreatment;A/R
group, preconditional6 hanoxiafolowedby3 hreoxy-
genation;A/R+As(1.25, 2.5 , 5.0 mg· L-1 )
groups, preconditioned6 hanoxiafolowedby3 h
reoxygenation, andAswasaddedintothecultureme-
·1094· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2006 Sep;22(9)
diumwithafinalconcentration1.25, 2.5, 5.0 mg·
L-1 beforeanoxiaandreoxygenation.Lactatedehydro-
genase(LDH)release, Malondialdehyde(MDA)con-
tentsandSuperoxidedismutase(SOD)activityinthe
bathingmediumwereassayedfortheevaluationofmy-
ocardialcelsinjury.TheprotectiveroleofAsonmito-
chondriaofmyocardialcelswasmeasuredbyMTTaf-
terA/Rinjury.Results　AscouldrestraintheLDH
releaseevidently, decreasetheMDAcontentanden-
hancetheSODactivityandincreaseOD570 ofmyocardi-
alcelsinjuredbyA/R.Conclusion　Ashasfunction
ofprotectingtheculturingmyocardialcelsinjuredby
A/R.Themechanismisrelatedtotheenhancementof
antioxidativeefectoncels, andthereductionmem-
branedamagecausedbyfreeradicalandlipidperox-
ide.
Keywords:aralosides;myocardialcelsculture;su-
peroxidedismutase;lactatedehydrogenease;creatine
kinase
EGCG抑制心肌肥厚胶原生成和细胞增殖
盛　瑞 1, 2 ,顾振纶 1, 2 ,谢梅林1, 2 ,周文轩 2, 3 ,郭次仪 2, 3
(1.苏州大学医学院药理学教研室 , 江苏 苏州　215123;2.苏州中药研究所 ,
江苏 苏州　215007;3.香港保健协会 ,香港 九龙)
中国图书分类号:R-322;R 282.71;R 322.11;R 329.2;
R329.24;R542.202.3;R542.205.3
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2006)09-1095-05
摘要:目的　研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的抗
心肌肥厚作用以及对心肌肥厚胶原生成和细胞增殖的影响。
方法　异丙肾上腺素(Iso)致小鼠心肌肥厚 , 测定心脏重量
指数和血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)活力。
腹主动脉缩窄致大鼠心肌肥厚 ,测定心脏重量指数和心肌羟
脯氨酸(Hp)含量 , HE和 VG染色观察心肌组织形态改变 ,
增殖性核抗原(PCNA)免疫组化检测细胞增殖。 结果　
EGCG50、100、 200 mg· kg-1剂量依赖的降低 Iso致小鼠心
肌肥厚的心脏重量指数及血清 LDH、CK的漏出量。 EGCG
25、50、100 mg· kg-1剂量依赖的降低腹主动脉缩窄致大鼠
心肌肥厚的心脏重量指数和心肌 Hp含量 , 明显改善心肌组
织胶原增生和纤维化 , EGCG50、100mg· kg-1明显降低细胞
PCNA免疫组化阳性率。结论　EGCG对大鼠和小鼠心肌肥
厚模型有明显的抑制作用 , 该作用可能与改善肥厚心肌组织
胶原增生和细胞增殖有关。
关键词:EGCG;心肌肥厚;胶原;PCNA
　　心肌肥厚(cardiachypertrophy)是心脏对慢性压
收稿日期:2006 -04-09,修回日期:2006-06-17
基金项目:香港保健协会研究资助项目(NoHK200208)
作者简介:盛　瑞(1975 -),女 , 博士生 , 讲师 ,研究方向:心血管药
理 , Tel:0512-62198011, E-mail:sheng rui@ 163.com;
顾振纶(1936-),男 , 教授 ,博士生导师 , 研究方向:心血
管药理 , Tel:0512-65190599
力或容量超负荷产生的靶器官反应 ,见于高血压 、瓣
膜病 、急性心肌梗死和先天性心脏病等 。大量临床
研究表明 ,心肌肥厚是一种极其重要的心血管危险
因素 ,可使心肌缺血 、心律失常发生猝死的几率增加
6 ～ 8倍 ,而且往往随疾病进程发展为心力衰竭。因
此 ,防治心肌肥厚的研究具有重要的临床意义 [ 1] 。
心肌组织包括心肌细胞和间质两部分 ,其中心肌细
胞占心脏总体积的 75%,间质仅占 25%,但其细胞
数约为心肌细胞的两倍 ,主要包括成纤维细胞 、平滑
肌细胞等 。心肌肥厚时 ,心肌成纤维细胞受到 Ang
Ⅱ等体液因子的调节 ,会发生明显的增殖 ,导致纤维
组织增生 ,产生大量胶原和纤维素 ,引起心肌纤维化
和结构紊乱。研究表明 ,心肌纤维化是心肌肥厚最
重要的病理改变之一 ,往往导致心脏收缩和舒张功
能障碍 ,预防与逆转心肌胶原生成和纤维化已成为
治疗心肌肥厚的重要目标[ 2] 。
　　研究证实从绿茶中提取的茶多酚(teapolyphe-
nol, TP)单体表没食子儿茶素没食子酸酯(epigal-
catechingalate, EGCG, Fig1)具有抗氧化 、清除自由
基 、保护心脑缺血再灌注损伤 、抗肿瘤和抗衰老等多
方面作用 。本室前期研究表明 TP能够有效抑制大
鼠和小鼠心肌肥厚损伤 [ 3, 4] 。本文应用异丙肾上腺
素致小鼠心肌肥厚以及腹主动脉缩窄致大鼠心肌肥
厚模型 ,研究茶多酚单体 EGCG对心肌肥厚的影响 ,
并探讨 EGCG对心肌肥厚胶原增生和细胞增殖的影
响。
·1095·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2006 Sep;22(9):1095 ～ 9