全 文 ：网络出版时间: 2013 － 5 － 28 14: 44 网络出版地址: http: / /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20130528． 1444． 008． html
龙牙楤木总皂苷对 H2 O2 诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用
孙桂波1，王 敏1，高蒙蒙1，徐惠波2，孙晓波1
( 1．中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193; 2．吉林省中医药科学院，吉林 长春 130021)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2013． 06． 008
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2013)06 － 0773 － 05
中国图书分类号:R-332;R284． 1;R329． 24;R329. 411
摘要:目的 研究龙牙楤木总皂苷(AS)对 H2O2 诱导乳鼠心
肌细胞氧化损伤的保护作用。方法 分次消化法分离原代
培养的乳鼠心肌细胞，建立 H2O2 诱导心肌细胞损伤模型;
MTT法检测不同浓度 AS 对细胞保护作用的量效、时效关
系;倒置显微镜下观察 AS对细胞形态学和细胞搏动频率的
影响;试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量及丙二醛
(MDA)含量，检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶
(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。结果 不同
浓度 H2O2 处理心肌细胞 2 h，100 ～ 400 μmol·L
－1对心肌细
胞具有明显的损伤作用，呈剂量依赖性;LDH 漏出量增加，
MDA含量升高，SOD、CAT 、GSH-Px活力明显降低。而 12. 5
～ 25 mg·L －1AS预处理 8、12 h 可明显地减轻损伤，有效保
护心肌细胞。明显减少 LDH 的漏出，降低 MDA 含量，提高
SOD、CAT 、GSH-Px活力;12. 5 ～ 25 mg·L －1 AS 于给药后 4
h明显减慢心肌细胞的搏动频率，并呈剂量依赖性，表明在
该剂量范围内 AS具有明显的负性频率效应。结论 AS 对
H2O2 致心肌细胞氧化损伤具有明显的保护作用，呈时间、剂
量依赖性。其作用机制可能与其清除自由基，提高心肌细胞
的抗氧酶活力有关;同时提示 AS的心肌保护作用可能与其
减少心肌做功、降低心肌耗氧量、增加心肌细胞稳定性有关。
关键词:龙牙楤木总皂苷;H2O2;乳鼠心肌细胞;抗氧化;搏
动频率;自由基
收稿日期:2013 － 01 － 23，修回日期:2013 － 02 － 26
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81173589) ;国家重大新
药创制专项(No 2009ZX09102-104) ;吉林省自然科学基金
项目(No 201015110)
作者简介:孙桂波(1973 －) ，女，博士，副研究员，研究方向:心血管
药理学，E-mail:sunguibo@ 126． com;
孙晓波(1958 －) ，男，博士，研究员，研究方向:心血管药
理学，Tel:010-57833013，E-mail:xbsun@ implad． ac． cn;
徐惠波(1963 －) ，女，研究员，研究方向:中药药理学，通
讯作者，Tel:0431-86058637，E-mail:xuhuiboyao@ yahoo．
com． cn
大量研究表明，氧化应激是导致心血管系统结
构功能异常的重要原因之一，可引发多种心血管疾
病，如动脉粥样硬化、心肌缺血 /再灌注损伤、高血
压、心力衰竭、心肌梗死、心肌病等［1］。因此寻找抗
氧化活性强的药物以减轻氧化应激引起的心肌损伤
具有重要的意义。
龙牙楤木［Aralia elata(Miq．)seem．］系五加科
楤木属植物，其性味辛、苦，有小毒，具有补气安神、
养心除烦、活血通络之功效。药用部位主要是根皮、
树皮及叶。文献报道其总皂苷为其主要有效成分，
具有抗炎、抗心肌缺血、保肝、降脂、保护心肌细胞等
作用。龙牙楤木在我国蕴藏量极大，且目前已进行
人工栽培，成本较低，其皂苷含量亦很高，可达 8%，
因此其药用资源丰富［2］。
本课题组通过前期的研究发现龙牙楤木总皂苷
(aralosides，AS)具有明显的抗心肌缺血、抗炎等作
用［3 － 6］。发现了 AS 在治疗冠心病、心绞痛方面的
新用途，为进一步在细胞水平上探讨其抗心肌缺血
的作用机制提供了理论依据。本文采用体外培养乳
鼠心肌细胞的方法，建立 H2O2 对乳鼠心肌细胞的
氧化损伤模型，进一步探究 AS 对心肌细胞损伤的
保护作用及其作用机制。
1 材料与方法
1． 1 主要材料 动物，SPF级 SD ♂乳鼠(24 h) ，由
北京维通利华实验动物技术有限公司提供。AS 由
吉林省中医药科学院化学室提供。用二甲基亚砜
(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后保存备用，DMEM
高糖培养基、胎牛血清均购自 Gibco 公司，胰酶、四
氮唑蓝(MTT)购自 Sigma 公司。SOD、MDA、LDH、
GSH-Px及 CAT试剂盒均购于南京建成生物工程研
究所。其余所用试剂均为国产分析纯。
1． 2 仪器和设备 超净台(ZHJH-C1109C) ，CO2 孵
箱 (Thermo scientific，HERA cell 150) ，显微镜(O-
LYMPUS JAPAN，IX2-SLP) ，离心机(Anke，TDL-
50B) ，MQX200 微孔板扫描酶标仪 (USA，BIO-
TEKINSTRUMENTS)
1． 3 实验方法
1． 3． 1 心肌细胞的分离与培养［4］ 新生大鼠 75%
酒精消毒皮肤，迅速开胸，无菌条件下取心室肌，放
入 PBS液中清洗 2 ～ 3 次，放入无血清的 DMEM 培
养液中，剪成 1 ～ 1. 5 mm3的碎块，移入离心管中，
·377·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Jun; 29( 6) : 773 ～ 7
1 000 r·min －1离心 3 min，弃上清，加入 0. 08%的胰
酶置于 37℃水浴中，消化 6 ～ 7 次，每次消化 10
min。前两次弃上清，从第 3 次起收集心肌细胞，过
200 目筛，1 000 r·min －1离心 5 min 后加入含 15%
胎牛血清的 DMEM培养液制成细胞悬液，在 CO2 培
养箱中培养 2 h，以差速分离法去除已贴壁的成纤维
细胞，取上清液计数并稀释细胞密度为 1 × 105 个·
L －1。接种于 96 孔板，每孔 100 μl，于 37℃、CO2培
养箱中静置贴壁培养。每 24 h更换 1 次培养液，48
h后选生长状态良好的心肌细胞分组处理，进行实
验。
1． 3． 2 细胞存活率测定 96 孔板接种细胞，单层
融合后，每孔加入 100 μl MTT(1 g·L －1) ，置于
37℃、5%CO2 孵箱中孵育 4 h，取出后吸弃培养液，
每孔加入 150 μl DMSO，微样振荡器震荡 10 min，于
酶标仪 570 nm处读取吸光度值，计算细胞存活率。
细胞存活率 /% =各组吸光度值(A)/空白组吸光度
值(A)× 100%。
1． 3． 3 H2O2 诱导的心肌细胞损伤模型的建立 取
接种于 96 孔板培养 48 h 后的心肌细胞，吸弃原培
养液，用 PBS液洗两次。正常组每孔加入不含 FBS
的 DMEM培养液 100 μl;模型组每孔加入 H2O2 终
浓度分别为 50、100、200、400 μmol·L －1不含 FBS
的 DMEM培养液 100 μl，在孵箱中继续培养 2 h后，
采用 MTT法检测细胞抑制率。确定建立 H2O2 损伤
模型的最适条件。
1． 3． 4 AS对正常乳鼠心肌细胞的影响 取接种于
96 孔板培养 48 h 后的心肌细胞，弃除原培养液，用
PBS液洗两次。正常组每孔加入不含 FBS的 DEMA
培养液 100 μl，给药组每孔加入含 AS终浓度分别为
6. 25、12. 5、25 mg·L －1的不含 FBS 的 DEMA 培养
液 100 μl，在孵箱中继续培养 12 h 后，MTT 法检测
细胞存活率。
1． 3． 5 AS对 H2O2 诱导的心肌细胞损伤的保护作
用 取接种于 96 孔板培养 48 h 后的心肌细胞，将
细胞分成正常组、模型组、AS(6. 25、12. 5、25 mg·
L －1)组。正常组，吸弃原培养液，用 PBS 洗两次，每
孔加入不含 FBS 的 DEMA 培养液 100 μl;模型组，
每孔加入不含 FBS、含 H2O2 的 DEMA 培养液 100
μl，终浓度为 200 μmol·L －1，放入 CO2 孵箱，37℃
培养;药物组预先加入含 AS(6. 25、12. 5、25 mg·
L －1)不含 FBS的 DMEM培养液 100 μl，放入 CO2 孵
箱，分别在 37℃条件下培养 4、8、12 h后，弃培养液，
加入不含 FBS、含 H2O2 的 DEMA 培养液 100 μl，终
浓度为 200 μmol·L －1，继续培养 2 h后观察细胞存
活率。倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化。
1． 3． 6 AS对心肌细胞搏动频率的影响 取接种于
96 孔板培养 48 h 后的心肌细胞，将细胞分成正常
组、模型组、AS (6. 25、12. 5、25 mg·L －1)组，置于带
有恒温装置的倒置显微镜下观察给药后 2、4、8 h 细
胞搏动频率的变化。搏动节律计数时每孔取 3 个视
野进行计数。
1． 3． 7 AS 对 H2O2 诱导的心肌细胞损伤中 LDH、
CAT、SOD、MDA 、GSH-Px含量的影响 各组处理同
“1． 3． 6”，处理后收集各组上清，测定 LDH 活力;消
化收集各组细胞，每组加 1 ml PBS 使细胞重悬，采
取反复冻融的方法(－ 80℃冰箱 15 min，室温 20
min，如此重复 5 次)裂解细胞，进行 BCA定量，然后
按照试剂盒说明书对细胞裂解液进行 SOD、CAT、
GSH-Px活力及 MDA含量的测定。
1． 3． 8 统计方法 所有数据均用 珋x ± s 表示，各组
数据采用两样本均数的 t检验进行统计学处理。用
SPSS进行数据分析和统计。
2 结果
2． 1 H2O2 诱导心肌细胞损伤模型的建立 Fig 1
结果显示，与正常组比较，50、100、200、400 μmol·
L －1 H2O2 对心肌细胞损伤具有浓度依赖性，差异均
有统计学意义(P ＜ 0. 01)。其中 200 μmol·L －1
H2O2 孵育 2 h 细胞明显损伤，抑制率达到 50%左
右。因此选择 200 μmol·L －1 H2O2 作用 2 h作为最
佳造模条件。
Fig 1 H2O2 model(珋x ± s，n = 4)
* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 vs control．
2． 2 AS对正常乳鼠心肌细胞的影响 结果显示，
与正常组比较，AS 各组预处理 12 h 对正常的心肌
细胞活力无明显影响(P ＞ 0. 05)。
2． 3 不同浓度 AS在不同时间对H2O2 诱导的心肌
·477· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Jun; 29( 6)
Fig 2 Effects of AS on normal myocardial cells
after 12h incubation(珋x ± s，n = 4)
细胞损伤的保护作用 Fig 3 结果可见不同浓度 AS
预处理 8、12 h，12. 5、25 mg·L －1给药组对 H2O2 诱
导的心肌损伤呈剂量依赖性的保护作用。预处理 4
h保护作用不明显。
Fig 3 Effects of AS on H2O2-induced myocardial
cells injury(珋x ± s，n = 12)
* P ＜ 0. 05;＊＊P ＜ 0. 01 vs model;#P ＜ 0. 05 vs control．
2． 4 AS对 H2O2 诱导的心肌细胞损伤的形态学影
响 心肌细胞接种培养 24 h后，心肌细胞贴壁并单
层散开，并伸展形成伪足，部分聚集成团。培养 48 h
后形成同心圆放射状细胞簇，簇间借伪足相互连接
成功能合胞体搏动，并呈同步匀律搏动。此后，细胞
维持旺盛的代谢，细胞簇进一步形成，并相互连接成
网，搏动频率、节律、强度稳定。分组处理时，各细胞
状态良好。
AS预处理 12 h 对 H2O2 诱导心肌细胞损伤的
形态学影响见 Fig 4，与正常组相比，模型组心肌细
胞体积明显缩小，细胞间隙增大，细胞数减少，出现
明显损伤形态。AS 各浓度组均能改善 H2O2 诱导
心肌细胞损伤细胞形态。
Fig 4 Effects of AS on
the morphology of myo-
cardial cells injuried by
H2O2
2． 5 AS 对心肌细胞搏动频率的影响 由 Fig 5 结
果可见，各给药组于给药后 4 h 明显减慢心肌细胞
的搏动频率，并呈现剂量依赖性。8 h 有恢复趋势，
但均未达到刚给药时的水平。
Fig 5 Effects of AS on beating rate of myocardial cells(珋x ± s，n = 12)
* P ＜ 0. 05 vs control．
2． 6 AS 对 H2O2 损伤乳鼠心肌细胞中的 LDH 漏
出量的影响 LDH在细胞膜损伤时由细胞中漏出，
其可作为细胞损伤的标志。H2O2 损伤后，LDH 漏
出明显增加;而 AS预孵育可明显抑制 LDH的漏出，
减轻心肌细胞损伤。
·577·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Jun; 29( 6)
Fig 6 Effects of AS on LDH leakage of
myocardial cells injured by H2O2
##P ＜ 0. 01 vs control;＊＊P ＜ 0. 01 vs model．
2． 7 AS 对 H2O2 损伤乳鼠心肌细胞中 SOD 和
MDA、GSH-Px、CAT活性的影响 由 Tab 1 可见，
与正常组相比，模型组心肌细胞内 SOD、CAT、GSH-
Px活力明显降低(P ＜ 0. 05) ，MDA 水平明显升高
(P ＜ 0. 05)。与模型组相比，AS 浓度为 12. 5 mg·
L －1与 25 mg· L －1组均可明显提高心肌细胞内
SOD、CAT、GSH-Px活力(P ＜ 0. 05) ;可明显降低心
肌细胞内 MDA 水平(P ＜ 0. 05) ，实验结果显示 AS
可以增强内源性抗氧化酶的活性，减轻氧化性损伤
(Tab 1)。
Tab 1 Effects of AS on activity of SOD，MDA，
GSH-PX and CAT(珋x ± s，n = 12)
Group
MDA/μmol·
g － 1 Pro
SOD/kU·
g － 1 Pro
GSH-Px /kU·
g － 1 Pro
CAT/ /kU·
g － 1 Pro
Control 0． 88 ±0． 41 23． 64 ±0． 42 4． 50 ±0． 16 35． 21 ±3． 42
Model 1． 89 ±0． 36## 11． 89 ±0． 82## 2． 40 ±0． 39## 14． 25 ±0． 39##
AS(6． 25 mg·L －1) 1． 65 ±0． 97 12． 08 ±2． 19 2． 38 ±0． 13 15． 22 ±1． 65
AS(12． 5 mg·L －1) 1． 08 ±0． 38＊＊ 18． 12 ±1． 65＊＊ 3． 17 ±0． 09 21． 34 ±0． 98＊＊
AS(25 mg·L －1) 0． 99 ±0． 16＊＊ 20． 31 ±1． 31＊＊ 3． 41 ±0． 35＊＊ 25． 35 ±1． 28＊＊
##P ＜ 0. 01 vs control;＊＊P ＜ 0. 01 vs model．
3 讨论
心血管疾病的发生和发展与体内抗氧化功能减
弱以及氧自由基的增多密切相关，体内代谢过程中
产生的氧自由基攻击细胞膜上多不饱和脂肪酸，形
成的有毒代谢物如丙二醛等能使膜损害、酶失活和
产生过氧化产物，导致毛细血管渗透性增加、血小板
聚集性增强。正常情况下，通过机体抗氧化防御系
统的作用，使得氧自由基和脂质过氧化物的产生与
清除保持动态平衡。而当机体的防御系统受到损伤
时，就会产生一系列反应，导致生物膜损伤而引发细
胞组织的病理改变。因此，研究抗氧化剂成为防治
心血管疾病的一条新途径。
本课题组通过前期的研究表明 AS 具有明显的
抗心肌缺血作用［3］，并对缺氧 /复氧诱导的心肌细
胞损伤具有明显的保护作用［4］，为进一步在细胞水
平上探讨其抗心肌缺血的作用机制提供了数据支
持。本文采用体外培养乳鼠心肌细胞的方法，建立
H2O2 对乳鼠心肌细胞的氧化损伤模型，进一步探究
AS对心肌细胞损伤的保护作用及其作用机制。结
果表明 AS 对 H2O2 诱导心肌细胞损伤具有明显的
时效、量效关系。减少心肌细胞中 LDH 的漏出，表
明 AS 对 H2O2 诱导心肌细胞损伤具有明显的保护
作用。
细胞具有一套内源性的抗氧化酶类物质用于对
抗 ROS 的可能的损伤作用，其中包括超氧化物歧化
酶(SOD) ，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化
氢酶(CAT)。SOD和 GSH-Px可通过代谢转化将细
胞内的活性氧自由基(ROS)转变为相对低毒性的物
质。SOD将 O －2 代谢为 H2O2，CAT则直接将 H2O2分
解为水和 O2，GSH-Px 维持巯基的氧化还原缓冲能
力［7］。研究显示提高抗氧化酶的活性可对不同形
式的氧化性损伤具有保护作用。本实验研究结果
H2O2 明显抑制 SOD、GSH-Px、CAT 酶活性，导致细
胞内 ROS不能被及时清除。AS 预孵育可明显增加
SOD、GSH-Px、CAT酶活性。提示 AS 抗氧化作用是
其保护心肌细胞、抗心肌缺血的重要机制之一，这与
以往报道的 AS 可以保护心肌组织中 SOD 活性，降
低 MDA含量的结果相一致。说明 AS 可能通过增
强机体清除氧自由基的能力，减少氧自由基、羟自由
基的生成、抑制脂质过氧化从而抑制心肌损伤，这可
能是 AS抗氧化应激的重要机制之一。
自发性、节律性搏动是体外培养心肌细胞的生
理特性之一，是反映细胞功能的一项重要观测指标。
AS各剂量组于给药后 4h明显减慢心肌细胞的搏动
频率，并呈剂量依赖性，表明在该剂量范围内 AS 具
有明显的负性频率效应，这与文献报道的 AS 具有
正性肌力、负性频率实验结果相一致［8 － 10］。董兆辉
等［11］报道 AS能够诱导心肌预适应对离体大鼠心脏
缺血 / 再灌注期的心室收缩与舒张功能障碍有明显
的改善作用，因此，本次实验结果提示 AS 的心肌保
护作用亦可能与减少心肌做功，降低心肌耗氧量、增
加心肌细胞稳定性有关。
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Protective effects of Aralosides(AS)against H2O2-induced injury
in neonatal rat cardiomyocytes
SUN Gui-bo1，WANG Min1，GAO Meng-meng1，XU Hui-bo2，SUN Xiao-bo1
(1． Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education，
Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing
100193，China;2． Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province，Changchun 130021，China)
Abstract:Aim To investigate the protective effects of
Aralosides against H2O2-induced injury in neonatal rat
cardiomyocytes． Methods A model of H2O2-induced
injury in neonatal rat cardiomyocytes was established．
Cell viability was determined by 3-(4，5-dimethylthia-
zol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium (MTT)assay． The
changes of cell morphology and the myocardial beating
rate were detected with the invert microscope． The su-
pernates were collected to measure the LDH levels and
the cells were harvested to determine the MDA levels
and the activities of SOD，CAT and GSH-PX with the
respective detection kits according to the manufactur-
er’s instructions． Results 100-400 μmol· L －1 of
H2O2 could cause a significant injury in the neonatal
rat cardiomyocytes in a dose-dependent manner． How-
ever，Aralosides treatment could attenuate H2O2-in-
duced decrease in cell viability of myocardial cells，ac-
tivities of SOD，CAT and GSH-PX，as well as increase
in the levels of LDH and MDA． The beating rate of
myocardial cells got slower in a dose-dependent man-
ner，indicating that the myocardial cells were apparent-
ly effected by negative frequency． Conclusion Aralo-
sides exerts protective effects against H2O2-induced in-
jury in myocardial cells in dose- and time-dependent
manners． The mechanism of these protective effects
may be due to its scavenging free radicals and increas-
ing the activities of antioxidant enzymes，as well as de-
creasing myocardial performance and oxygen consump-
tion and increasing the stabilization of myocardial
cells．
Key words:aralosides;H2O2;neonatal rat cardiomyo-
cytes;anti-oxidative;beating rate;free radical
·777·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Jun; 29( 6)