全 文 ：中国药房 2009年第 20卷第 24期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.24 · 1847·
Δ广西教育厅科研项目(200710MS 014);广西大型仪器协作共用
网资助项目(601-2008-014)
*讲师 , 硕士。研究方向:生化药理学、 心血管药理学。电话:
0771-5358342。E-mail:gx Lx 60@163.com
#通讯作者:教授 ,博士研究生导师。研究方向:心血管药理学、生
化药理学。电话:0771-5358272。E-mail:huangrenbin518@163.com
六月青含药血清对 HepG2.2.15细胞 HBV 复制的抑制作用 Δ
林 兴 1 * ,黄权芳 2 ,张士军 1 ,刘 曦 1 ,黄仁彬 1#(1.广西医科大学 ,南宁市 530021;2.广西中医学院第一附
属医院 ,南宁市 530023)
中图分类号 R285;R977 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)24-1847-03
摘 要 目的:研究六月青(LYQ)含药血清对 HepG2.2.15细胞乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用 。方法:采用血清药理学方
法 ,在 HBV 的体外细胞培养系统(HepG2.2.15细胞)中观察 LYQ 抗 HBV 的作用 。结果:LYQ 含药血清在 HepG2.2.15细胞培
养中可有效地抑制 HBV DNA 的复制 ,其作用呈显著的浓度-效应和时间-效应关系 。结论:LYQ 在体外能显著抑制 HBV ,可能
是复方六月雪主要活性成分之一。
关键词 六月青;含药血清;乙型肝炎病毒;HepG2.2.15细胞;抑制
Inhibitory Ef fect of Strobi lanthes aff inis -containing Serum on HBV Reproduction in HepG2.2.15 Cells
LIN Xing ,ZHANG S hi_jun ,LIU Xi ,HUANG Ren_bin(Guangx i Medical Universi ty , Nanning 530021 , China)
HUANG Quan_fang(The First Aff iliated Hospi tal to Guangxi T radit ional C hinese Medicine College ,Nanning
530023 , China)
ABSTRACT OBJECT IVE :To study the anti-HBV activ ity of St robi lanthes a f f inis in HepG 2.2.15 ce lls.M ETHODS :
The anti -HBV activity o f S.af fin is w as observed in the in vitro cell culture system of HBV(HepG 2.2.15 cells)by
serum -pharmaco logy method.RESULTS :The serum containing S.a f fi nis effectively inhibited the HBV DNA duplication
in H epG 2.2.15 cell culture , and its inhibito ry activity assumed dose-dependent and time -dependent m anner .CONCLU-
S ION :S.af finis can significantly inhibit HBV in vit ro and it maybe one of the m ain ac tive components o f Compound li-
uyuexue .
KEY WORDS S trobi lanthes af f inis ;Drug -containing serum ;HBV ;HepG 2.2.15 cells;Inhibition
3.3 还原 Fe3+的能力
3种提取物中 , 头状蓼甲醇提取物还原 Fe3 +的能力较强
(FRAP=(1 052.00±11.07)μmol TE ·g -1), 略低于 BHT
(FRAP=1 581.68±97.41 μmol TE ·g -1)。头状蓼乙酸乙酯 、
石油醚提取物的还原能力分别约为头状蓼甲醇提取物还原能
力的 1/2.46和 1/8.80。结果表明 , 头状蓼提取物和 BHT 对
Fe 3 +的还原能力顺序为:BHT >头状蓼甲醇提取物>头状蓼乙
酸乙酯提取物>头状蓼石油醚提取物 。
3.4 3种方法的比较
将 3种抗氧化法测定的结果分别进行相关性分析 , DPPH
和 ABTS 法 、DPPH和 FRAP 法 、ABTS 和 FRAP 法的相关系
数分别为 0.994 、0.957 、0.983 ,表明 3种体外抗氧化法能客观
地反映出头状蓼的总抗氧化能力 , 且 DPPH 和 ABTS法相关
性最高 。结果表明 ,头状蓼提取物和 BHT 的总的体外抗氧化能
力的顺序为:BHT >头状蓼甲醇提取物>头状蓼乙酸乙酯提取
物>头状蓼石油醚提取物。
4 讨论
笔者首次采用 DPPH 、ABTS 和 FRAP 3种方法对头状蓼
提取物进行体外总抗氧化活性考察 , 发现头状蓼有一定的体外
抗氧化活性 。不同提取溶剂的抗氧化活性不同 , 不同提取物清
除自由基的能力均随浓度增大而增大 。头状蓼甲醇提取物的总
的体外抗氧化活性最高 ,与 BHT 相近 ,可进一步进行体内抗氧
化活性筛选 。
参考文献
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(收稿日期:2009-01-20 修回日期:2009-04-14)
· 1848· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.24 中国药房 2009年第 20卷第 24期
六月青(LYQ)系爵床科植物肖鸡笼(顶花马兰)Taraphoc_
hlamys af f inis(Gr iff)Brem ekhu(S trobilanthes af finis (Gr_
iff)Y.C.Tang)的干燥地上部分 [1 ] ,是复方六月雪(CLYX)主要
成分之一。本课题组前期研究表明 ,CLYX 具有显著的抗乙型肝
炎病毒(HBV)和保护急性化学性肝损伤的作用 [2 ～4 ]。本研究以
转染有 HBV DNA 的 HepG2.2.15细胞为模型 , 采用中药血清
药理学方法 , 观察 LYQ 对 HBV 复制的影响 , 并初步探讨其作
用机制 , 为筛选出CLYX 中抗HBV 主要活性部位提供实验依
据 。
1 材料
1.1 仪器
iCycler FQ 实时荧光定量 PCR仪 (美国 Bio-rad公司);
M odel311型 CO 2孵箱(美国 Therm o Form a公司)。
1.2 试药
LYQ 水提物(广西医科大学药理学教研室和广西医学科学
实验中心提取);阿昔洛韦(ACV ,湖南迪诺制药有限公司医药工
业研究所 , 批号:20070518);RPM I1640培养基 、胎牛血清(美
国 Gibco 公司 ,批号分别为 21202-016 、21607-042);G418(美
国 Sigma公司 , 批号:228527-72);HBV DNA 荧光定量 PCR
试剂盒(深圳匹基生物工程股份有限公司 ,批号:20070613)。
1.3 动物和细胞株
3月龄Wist ar大鼠 50只 , ♀♂兼半 , 体质量(250±10)g ,
由广西医科大学实验动物中心提供 (动物生产许可证号 :
SCXKG 桂 2003-0003);HepG2.2.15细胞株由北京大学医学
部第一附属医院病毒研究所提供 , 广西医科大学药理教研室自
行传代 ,定期用 G418筛选 。
2 方法
2.1 LYQ含药血清的制备
Wistar 大鼠随机分为 5组 , 即空白对照 (等量的生理盐
水)、ACV(0.1 mg ·kg -1)及 LYQ 高 、中、低剂量(6.6 、3.3 、1.7
g ·kg -1)组。各组动物在同样条件下饲养 , 均以每天早、晚各 1
次ig 给药 ,连续 7 d。于末次给药(给药前禁食不禁水 12 h)后 2
h , 乙醚吸入麻醉 ,腹主动脉抽血 , 低速离心分离血清 , 并将每组
动物的血清混合 。经 56 ℃、30 min灭活处理 , 0.45μm微孔滤膜
过滤 ,再经 0.22μm 微孔滤膜过滤除菌 ,置 —20 ℃冰箱保存 ,备
用 。
2.2 荧光定量 PCR(FQ-PCR)法检测HBV DNA [5]
取 HepG2.2.15细胞 1瓶 ,用胰酶消化后制备成单细胞悬
液 , 计数后调整细胞浓度至 2×104个 ·mL -1 , 加入 24孔细胞
培养板 , 每孔 900 μL , 置 CO 2孵箱(37 ℃、5%CO 2)中培养 24
h ,分别加入各组含药血清 100μL ,每个浓度 3个复孔 。以等量
的完全培养液为空白对照 。连续培养 72 h 后分别吸出上清液 ,
置于 1.5 mL灭菌离心管中 , —20 ℃冰箱保存 ,统一待检 。再次
加入上述含药血清的培养液继续培养 72 h , 分别吸出上清液 ,
置于 1.5 mL灭菌离心管中 , —20℃冰箱保存 ,统一待检 。按试
剂盒方法提取样品 HBV DNA 。各反应管放入 FQ -PCR仪 ,
按以下条件进行扩增:94 ℃预变性 1 min , 95 ℃变性 5 s , 60 ℃
退火 、延伸 20 s。共反应 42个循环 。扩增过程及荧光信号检查 、
数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成 。
2.3 统计学方法
采用 SPSS 10.0统计软件分析数据 ,组间比较采用方差分
析 ,各均数两两比较 。
3 结果
与空白对照组比较 , LYQ 高 、中剂量组作用 72 、144 h后 ,
HepG2.2.15细胞上清液中 HBV DNA的拷贝数显著降低(P <
0.05或 P <0.01)。提示 LYQ 对 HBV DNA 具有显著的抑制
作用 , 并且随着药物浓度和作用时间的增加 , 其抑制作用逐渐
增强 。LYQ 含药血清对 HepG2.2.15细胞 HBV DNA 的抑制
作用见表 1。
表 1 LYQ含药血清对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制
作用(x ±s , n=3)
Tab 1 Inhibitory ef fect of the serum containing LYQ on
HBV DNA in the HepG2.2.15 cells(x ±s , n=3)
组别 剂量 72 h 144 h拷贝数 抑制率 /% 拷贝数 抑制率/ %
空白对照组 - 6.35±0.45 - 25.61±4.57 -
ACV组 0.1 mg ·kg- 1 3.37±0.68* 46.9 8.56±3.79* * 66.6
L YQ低剂量组 1.7 g· kg- 1 5.26±0.44 17.2 19.72±5.48 23.0
L YQ中剂量组 3.3 g· kg- 1 4.17±0.65* 34.3 15.34±4.19* 40.1
L YQ高剂量组 6.6 g· kg- 1 3.69±0.77* 41.9 12.66±5.13* * 50.6
与空白对照组比较:*P<0.05, **P<0.01
vs.blank control g roup:*P<0.05 , **P<0.01
4 讨论
CLYX 是通过长期民间临床观察而拟定的治疗急 、慢性
乙型肝炎和肝硬化的验方 , 主要由广西民间草药 LYQ 、白花蛇
舌草 、栀子花根等组成 。本课题组前期大量的实验研究表明 ,该
方可有效地抑制鸭乙型肝炎病毒 DNA 和HepG 2.2.15细胞
HBV DNA 的复制[2 ,6 ,7];无毒浓度的CLYX在HepG 2.2.15细胞
培养中可有效地抑制细胞 HBV DNA 的复制及乙型肝炎表面
抗原(HBsAg)和乙型肝炎 E抗原(HBeAg)的分泌 [ 3 , 8 ];此外 ,
CLYX 对四氯化碳(CCl4)、激活蛋白(AP)、D-半乳糖胺(D-
Gal)所致小鼠急性化学性肝损伤均有显著的保护作用 , 并由此
推测其保肝作用可能与诱导肝药酶有关 [4 ] 。
中药复方成分非常复杂 , 其组方配伍多数是以某一味药为
主其余为辅 ,诸药发挥协同治疗作用 。为了更好地保证 CLYX
疗效的稳定性 , 本研究对该方中的 LYQ 进行了抗 HBV 药效
学研究 , 旨在筛选出该方有效活性部位 , 进而为下一步分离纯
化有效化学成分 、建立处方质控标准提供实验依据 。研究结果
表明 , LYQ 中 、 高剂量含药血清作用 72 、 144 h 后 ,
HepG2.2.15细胞上清液中 HBV DNA 的拷贝数显著降低 ,提
示对 HBV DNA 具有显著的抑制作用 , 并呈显著的量效和时
效反应关系 , 鉴于此 , 认为 LYQ 应是 CLYX 中主要活性部位
之一 。
本研究与本课题组前期开展的 CLYX含药血清对 HepG
2.2.15细胞 HBV DNA 的抑制作用的实验比较 ,在相同剂量
前提下 , LYQ 对 HBV DNA 的抑制作用均比 CLYX 的抑制
作用差 , 提示 CLYX 中的其它药物也参与协同抑制作用 , 从
而提高了疗效 。至于诸药之间的相互作用有待于进一步研究 。
参考文献
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与显微鉴定[ J] .中药材 , 2005 , 28(7):541.
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中国药房 2009年第 20卷第 24期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.24 · 1849·
Δ广西科学基金项目(桂科自 0832013Z)
*主管药师 ,硕士。研究方向:抗糖尿病药。电话:0773-2882506。
E-mail:huangguihong 120@126.com
#通讯作者:教授 , 博士 , 博士研究生导师。研究方向:生化药理
学。电话:0771-5358272。E-mail:huangrenbin518@163.com
杨桃根醇提物对糖尿病模型小鼠的血糖及抗氧化能力的影响研究 Δ
黄桂红 1 , 2* ,马杰津 3 ,贺 敏 1 ,黄仁彬 1#(1.广西医科大学药学院 ,南宁市 530021;2.桂林医学院附属医院 ,
桂林市 541001;3.广西卫生管理干部学院 ,南宁市 530021)
中图分类号 R285;R977 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)24-1849-03
摘 要 目的:研究杨桃根醇提物(ACLRE)对糖尿病模型小鼠的血糖及抗氧化能力的影响 。方法:通过对小鼠一次性腹腔注射链
脲佐菌素复制糖尿病模型 。将小鼠分成 5组 ,即正常 、模型 、格列本脲及 ACL RE高 、低剂量组 ,分别灌胃给药 14 d ,在第 0 、7 、14天
时测定小鼠的空腹血糖值;并于第 14天处死小鼠 ,测定小鼠血清及肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)值 。结果:与
模型组比较 ,ACLRE高 、低剂量组均能显著降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖(P <0.01),且杨桃根醇提物高剂量组小鼠血清及肝
脏中的 SOD 活性升高(P<0.01),MDA 含量降低(P <0.01)。结论:ACLRE能显著降低糖尿病模型小鼠血糖 ,提高机体 SOD 活
性 ,降低体内MDA 含量 ,从而提高其抗氧化能力 ,是一种潜在的治疗糖尿病及其并发症的药物 。
关键词 杨桃根醇提物;链脲佐菌素;糖尿病;降血糖;抗氧化
Effects of Alcohol Extracts of Averrhoa carambola on Blood Glucose Level and Antioxidant Activity in
Streptozocin-induced Diabetic Model Mice
HUANG Gui_hong , HE M in , HUANG Ren_bin(Pharmaceutical S chool , Guangxi Medical U nive rsi ty , Nan-
ning 530021 ,China)
HUANG Gui_hong(The Affi liated Hospital of Guilin Medical College , Guilin 541001 , China)
MA Jie_jin(Guangx i Health M anagement Cadre College , Nanning 530021 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:T o study the e ffects of a lcoho l ex trac ts o f Averrhoa carambola(ACLRE)on blood g lucose level
and antioxidant activ ity in STZ -induced diabetic mode l mice.METHODS :Diabetic model w as induced in mice by int raperi-
toneal injection o f streptozotocin(S TZ), and the model mice w ere divided into 5 diffe rent g roups:normal g roup , model g roup ,
g libenclamide group , high-dose group and low dose group o f ACLRE.The mice w ere administe red wit h cor responding drugs
for 14 days.The levels of fasting blood glucose(FBG)were dete rmined at 0 , 7 and 14 days.The experim ental mice were sac-
rificed on day 14 fo r the de term ina tion o f the activity of SOD and concentration of M DA in blood serum and liver.RESULTS:
As compared w ith model g roup , the FBG in mice t rea ted w ith either high dose or low dose ACLRE w ere dow n-regulated sig_
nificantly(P <0.01), and in mice t reated by high dose ACLRE , the activ ity o f SOD in blood serum and liver w as higher(P <
0.01)w hile concentration o f MDA w as low er(P <0.01).CONCLUS ION :The ACLRE has rem arkable hypog lycemic ef fect on
diabetic mode l mice.I t can improve the antiox idant activ ity by enhancing the activity o f SOD and decrease the concent ration of
M DA in mice and it is a po tential hypog lycemic agent fo r treatment of diabetes and it s com plication.
KEY WORDS Alcohol ex t racts of Averrhoa carambola;St reptozo tocin;Diabetes mellitus;Hypog lycemic effect ;Antioxidant
activiy
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(收稿日期:2008-09-03 修回日期:2009-02-28)
糖尿病是一种常见的多发性疾病 , 近年来发病率处于上升
趋势 , 是威胁人类健康的第三大疾病 [1 ] 。糖尿病及其并发症的
发病机制十分复杂 , 许多研究发现糖尿病及其并发症的发生与
机体的氧化应激水平有关 [ 2 , 3 ] 。中药治疗糖尿病的优势在于缓
解糖尿病综合征的发展 。民间用杨桃根作为偏方治疗糖尿病 ,
使用方便 , 效果良好 , 其对于糖尿病的治疗作用还未见有报
道 。本文就杨桃根醇提物(ACLRE)对链脲佐菌素(S TZ)致糖
尿病模型小鼠的降血糖作用及其抗氧化能力进行研究 。