全 文 ：收稿日期:2005-03-25;　修订日期:2005-12-15
作者简介:罗春丽(1978-),女(汉族),贵州毕节人 ,现任贵州大学农学院
药师 ,硕士学位 ,主要从事 “苗药的开发与利用 ”的研究工作.
民族药余甘子冻干粉免疫调节作用的血清药理学研究
罗春丽1 , 张永萍 2 , 邱德文 2 , 郑维发3
(1.贵州大学农学院 ,贵州 贵阳　550025;　2.贵阳中医学院 ,贵州 贵阳　550002;
3.徐州师范大学 ,江苏 徐州　221000)
摘要:目的 实验旨在应用中药血清药理学研究方法 , 研究民族药余甘子对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 , 对小鼠 S180腹
水肿瘤细胞存活率的影响以及对小鼠腹腔巨噬细胞细胞活化作用的研究。方法 余甘子采用鲜果榨汁经冷冻干燥冻干
保存 。小鼠随机分 6组 ,其中时效关系研究 2组 , 量效关系研究 4组。按 0.2 ml/10 g体重用余甘子溶液灌胃。灌胃后 30
～ 180min内不同时相无菌取血 , 利用中药血清药理学方法对实验血清作时效关系研究及量效关系研究。结果与结论
时效关系研究表明 , 用余甘子冻干粉溶液灌胃后 30 ～ 180min内不同时相含药血清对小鼠脾淋巴细胞具有活化作用 , 并
在给药 2 h时实验血清活化作用明显;量效关系研究表明 ,余甘子大剂量组实验血清对促进小鼠脾淋巴细胞增殖 ,促进小
鼠腹腔巨噬细胞细胞活化作用以及小剂量组实验血清对小鼠 S180腹水肿瘤细胞存活率的影响均具显著差异性。
关键词:余甘子;　含药血清;　腹腔巨噬细胞;　淋巴细胞;　S180腹水肿瘤细胞;　免疫调节
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2006)02-0188-02
StudyontheImmunoregulatoryEffectofPhyuanthusEmblicainMice
LUOChun-li1 , ZHANGYong-ping2 , QIUDe-wen2 , ZHENGWei-fa3
(1.AgricuturalSchoolofGuizhouUniversity, Guiyang550025, China;2.GuiYangColegeofTraditionalChi-
neseMedicine, Guiyang550002, China;3.XuzhouNormalUniversity, Xuzhou221000 , China)
Abstract:ObjectiveTheexperimentappliesthetraditionalChinesemedicinePlasmaPharmacology.Thisexperimentstudies
howPhyuanthusemblicaPhylanthusemblica, thetraditionalChinesemedicine, promotesthepropagateofthespleenlymphocyte
ofsmallmice, howitinfluentsthesurvivalrateofthemouseS180ascitestumorcelandhowitactivatesthemacrophageinthe
abdominalcavity.MethodsAdoptthefreshfruitjuiceofPhyuanthusemblica.Dryitandkeepinfreeze.Thesmallmiceareran-
domlydividedin6groups.Amongthem, 2groupsarestudiedintime-eficacyrelation, theother4arestudiedinquantity-efi-
cacyrelation.InfusethesolutionofPhyuanthusemblicaPhyllanthusemblica0.2mlper10gweightintothestomachofthesmal
mouse.Takethebloodinsterileenvironmentsatdifferenttimeafter30minbutbefore180min, thenstudythetime-eficacyrela-
tionandthequantity-efficacyrelationwiththetraditionalChinesemedicinePlasmaPharmacology.ResultsandConclusionThe
studyoftime-eficacyrelationexpressesthatafterinfusingthesolutionofPhyuanthusemblicaPhylanthusemblica, medicated
serumindifferenttimeactivatesthespleenlymphocyteofsmalmicediferentlyafterthe30minbutbefore180min.Duringthis
period, on2htheactivationofthemedicatedserumisthemostobvious.Thequantity-efficacyrelationresearchexpressesthat
megadosepromotesthepropagateofthespleenlymphocyteofsmalmouseandactivatesthemacrophageintheabdominalcavity
moreobviously.Ontheotherhand, thesmaldosageinfluentsthesurvivalrateofthemouseS180ascitestumorcelmoreobvious-
ly.
Keywords:Phyuanthusemblica;　Drugcontainingsera;　Immunoregulation;　S180 ascitestumorcell;　Spleenlympho-
cyte
　　余甘子为大戟科植物余甘子 PhyllanthusemblicaL.的干燥成
熟果实 , 余甘子首载于《南方草木状 》(为晋朝嵇含所著 , 是世界
上最早的一部地方植物志)。余甘子在本草中首载于唐· 苏恭
《新修本草》。作为民族药最早被记载的是西藏帝玛尔· 丹增彭
措著的《晶珠本草》。实验研究证实 , 余甘子具有抗氧化 、抗致
畸 、防肿瘤 、抗病原微生物 、降压 、抗爱滋病毒 、降血糖及改善糖尿
病并发症 、补益及降脂减肥等作用。证明其在提高机体免疫力方
面具有很好的调节作用。 中药血清药理实验方法具有体外实验
条件可控性强 , 药物效应易于检测 , 可深入揭示药物作用机理等
优点 , 又能防止中药粗制剂本身理化性质对实验的干扰 , 还可反
映出药物中可吸收部分的直接作用。体现了体外和体内实验较
好的结合。实验采用较先进的血清药理学方法 ,用小鼠服药后的
含药血清代替中药煎剂进行体外实验 , 对脾脏淋巴细胞增殖活
性 、对小鼠腹腔巨噬细胞细胞活化作用以及对小鼠 S180腹水肿
瘤细胞存活率的影响进行免疫功能检测 , 通过时 -效关系及量-
效关系对余甘子的药理作用及免疫调节作用机理作进一步阐明。
1　材料
1.1　试剂 RPMI1640培养基(日本株式制药会社出品);10%新
生小牛血清(美国 Sigma公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)、刀豆蛋
白 -Ⅳ型(ConA-Ⅳ)、二甲基亚砜(DMSO)(美国 Sigma公司);
其余试剂均为分析纯。
1.2　药品 余甘子为鲜果榨汁的冷冻干燥粉 。
1.3　实验动物 昆明种健康小鼠 , 雌雄各半 , 体重(26 ±2)g, 由
江苏省药用植物生物技术重点实验室动物房提供。
1.4　实验仪器 超净工作台;SHELATC2323型 CO2孵育箱;日本
产 BIO-RED550型酶标仪;96孔培养板;24孔培养板;数控恒
温水浴箱;血球记数板(上海医用光学仪器厂 XB-K-25)。
2　方法
2.1　余甘子灌胃后不同时相含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖的
促进作用
2.1.1　含药血清的制备 参照文献 [ 1] , 小鼠用余甘子大剂量组
(40.0g鲜果 /kg)灌胃 , 为成人日剂量的 20倍。按 0.2 ml/10 g
体量灌胃给药 ,于给药后 30, 60, 90, 120, 180min分别用乙醚吸入
麻醉 , 摘眼球无菌取血 , 37℃促凝 , 3 000 r/min离心 10 min分离
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时珍国医国药 2006年第 17卷第 2期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2006VOL.17NO.2　
血清 , 血清呈透明 、清亮 、淡黄色 、无沉淀 、未溶血。 56℃, 30 min
灭活(除去血清中的补体)。 4℃保存备用(3d之内有效)。
2.1.2　正常小鼠对照血清的制备 小鼠用蒸馏水 0.2 ml/10 g体
重灌胃 , 30min后摘眼球取血 , 37℃促凝 , 3 000 r/min离心 10min
分离血清 , 4℃保存备用(3 d之内有效)。
2.1.3　脾淋巴细胞悬液制备 参照文献 [ 2] , 正常小鼠脱颈椎处
死 , 体积分数为 0.75的酒精浸泡消毒 , 无菌取出脾脏 , 置盛有 5
～ 10 mlHanks液平皿的 100目铜网上 ,轻轻捻碎 ,使单个细胞经
网进入 Hanks液中 , 并移吸至刻度离心管中 800 r/min离心
10min, 经 Tris-NH
4
Cl除去红细胞 , Hanks液洗 3遍 , 镜下细胞记
数 , 用 RPMI1640培养液配成 5×106 /ml悬液。
2.1.4　余甘子不同时相含药血清促进淋巴细胞增殖测定 参照
文献 [ 3] , 于 96孔培养板中每孔加入 100 μl脾淋巴细胞悬液 , 再
加入 100μl, 2 5 μg/mlConA溶液及 20μl的实验血清 , 4复孔;20
μl空白血清 , 4复孔 , 37℃、体积分数为 0.05的 CO2培养 48 ～ 72h。培养结束前 4 ～ 6 h每孔加入 MTT溶液 10 μl, 培养结束弃去
上清 , 每孔加入 DMSO溶液 200 μl, 充分震荡后静置 20 min,酶标
仪测定 A490nm值。
2.2　余甘子含药血清促进小鼠脾淋巴细胞增殖
2.2.1　含药血清的制备 参照文献 [ 4] , 小鼠随机分 4组 , 每组 6
只 , 生理盐水组 、余甘子大剂量组(40.0 g鲜果 /kg)、余甘子中剂
量组(20.0g鲜果 /kg)、余甘子小剂量组(10.0 g鲜果 /kg)。按
0.2 ml/10g体重量灌胃给药 , 1次 /d,连续给药 7 d。于末次给药
120min后 ,摘眼球取血 , 37℃促凝 , 3 000 r/min离心 10min分离
血清 , 血清呈透明 、清亮 、淡黄色 、无沉淀 、未溶血。 56℃, 30 min
灭活(除去血清中的补体)。 4℃保存备用(3d之内有效)。
2.2.2　正常小鼠对照血清的制备 小鼠用蒸馏水 0.2 ml/10 g体
质量灌胃 , 30 min后摘眼球取血 , 37℃促凝 , 3 000 r/min离心 10
min分离血清 , 4℃保存备用(3 d之内有效)。
2.2.3　脾淋巴细胞悬液制备 正常小鼠脱颈椎处死 , 75%酒精浸
泡消毒 , 无菌取出脾脏 ,置盛有 5 ～ 10 mlHanks液平皿的 100目
铜网上 , 轻轻捻碎 ,使单个细胞经网进入 Hanks液中 ,并移吸至刻
度离心管中 800 r/min离心 10 min,经 Tris-NH4Cl除去红细胞 ,Hanks液洗 3遍 , 镜下细胞记数 , 用 RPMI1640培养液配成 5 ×
106 /ml悬液。
2.2.4　余甘子含药血清促进小鼠脾淋巴细胞增殖测定 于 96孔
培养板中每孔加入 100 μl脾淋巴细胞悬液 , 再加入 100 μl, 2 5
μg/mlConA溶液及 20μl的实验血清 , 4复孔;20 μl空白血清 , 4
复孔 , 37℃、体积分数为 0.05的 CO2培养 48～ 72 h。培养结束前
4 ～ 6 h每孔加入 MTT溶液 10 μl, 培养结束弃去上清 , 每孔加入
DMSO溶液 200 μl, 充分震荡后静置 20 min, 酶标仪测定
A490nm值。
2.3　余甘子含药血清对小鼠 S180腹水肿瘤细胞存活率的影响
2.3.1　含药血清的制备 同上 2.2.1。
2.3.2　正常小鼠对照血清的制备 同上 2.2.2。
2.3.3　S180腹水肿瘤细胞悬液的制备 无菌条件下取 S180腹
水癌细胞 , 用基本 1640液洗涤离心 3次后 ,用完全 1640液配成 3
×105个 /ml备用。
2.3.4　S180腹水肿瘤细胞存活率的测定 于 96孔培养板中每
孔加入 100 μlS180腹水癌细胞悬液 , 再加入 100 μl, 25 μg/ml
ConA溶液及 20 μl的试验血清 , 4复孔;20 μl空白血清 , 4复孔 ,
37℃、体积分数为 0.05的 CO2培养 48 ～ 72h。培养结束前 4 ～ 6h
每孔加入 MTT溶液 10 μl, 培养结束弃去上清 , 每孔加入 DMSO
溶液 200μl, 充分震荡后静置 20 min,酶标仪测定 A490nm值。
2.4　余甘子含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞的活化作用
2.4.1　含药血清的制备 同上 2.2.1。
2.4.2　正常小鼠对照血清的制备 同上 2.2.2。
2.4.3　小鼠腹腔巨噬细胞分离 参考文献 [ 6] , 小鼠腹腔注射质
量分数为 3%的巯基乙醇酸钠溶液 2 ml, 3 d后脱颈椎处死 ,腹部
皮肤消毒处理 ,腹腔注射 RPMI1640液 8ml,轻揉腹部 60次 , 以使
1640液充分洗腹腔 , 无菌取出腹腔液 , 1 000 r/min低速离心 5
min,弃上清液 , 以 RPMI1640液洗 3次 , 调整细胞浓度为 3.5 ×
105 /ml, 4℃保存于完全 RPMI1640培养液中备用。 以上操作过
程 , 细胞均置于 0 ～ 4℃冰浴中。
从杀死动物到将单个细胞悬液置入冰浴内的时间不宜超过
30 min;而细胞悬液在冰浴中放置时间不宜超过 3 h。
2.4.4　巨噬细胞活性测定 将巨噬细胞分装于 96孔培养板中 ,
每孔 100 μl, 分别加入含药血清 20 μl, 4复孔 , 空白血清 20 μl, 4
复孔 , 轻轻震荡 , 37℃、体积分数为 0.05的 CO2孵育 2 h, 每孔加
入 MTT溶液 10 μl, 轻轻震荡 , 37℃、体积分数为 0.05的 CO2 继
续孵育 2 h,取出 , 小心吸去上清液 ,每孔加入 DMSO溶液 200 μl,
轻轻震荡 ,酶标仪测定 A490nm值。
3　结果
3.1　 余甘子灌胃后不同时相含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖
活性的促进作用。与正常对照组比较 , 余甘子溶液 40.0 g鲜果 /
kg体重灌胃 , 其(60 ～ 120)min等不同时相的含药血清对小鼠脾
淋巴细胞增殖活性均具有促进作用(P<0.01), 而 30 min, (150
～ 180)min的含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性无明显促进
作用(P>0.05)。结果见表 1。
表 1　不同时相余甘子含药血清对小鼠淋巴细胞增殖活性( x±s)
组　别 OD值 百分率(%)
正常对照血清 0.679 5±0.030 5 　 0.00
30min血清 0.731 8±0.148 7 7.70
60min血清 0.771 0±0.096 0 13.47＊
90min血清 0.788 8±0.103 5 16.09＊
120min血清 0.948 8±0.111 2 39.63＊＊
150min血清 0.735 8±0.069 1 8.29
180min血清 0.712 0±0.087 6 4.78
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.01, ＊＊P<0.001;n=6
3.2　余甘子含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性 与正常对照
组比较 ,余甘子溶液大 、中 、小 3个剂量组灌胃 ,分别于末次给药
120min后摘眼球取血 , 含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性均
具有促进作用。其中大 、中剂量组含药血清对小鼠脾淋巴细胞增
殖活性具明显促进作用(P<0.01), 小剂量组对小鼠脾淋巴细胞
增殖活性促进作用不显著(P>0.05)。结果见表 2。
表 2　余甘子含药血清对小鼠淋巴细胞增殖活性( x±s)
组　别 OD值 百分率(%)
正常对照血清 0.387 8±0.084 7 　 0.00
大剂量血清 0.467 8±0.074 6 20.61＊＊
中剂量血清 0.424 8±0.024 1 9.53＊
小剂量血清 0.404 8±0.050 5 4.37
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.01, ＊＊P<0.001;n=6
3.3　余甘子含药血清对小鼠 S180腹水肿瘤细胞存活率的影响
与正常对照组比较 ,余甘子溶液大 、中 、小 3个剂量组灌胃 , 分别
于末次给药 120 min后摘眼球取血 , 含药血清对小鼠 S180腹水
肿瘤细胞存活率均具有抑制作用。其中小 、中 、大剂量组含药血
清对小鼠 S180腹水肿瘤细胞存活率具明显抑制作用 (P<
0.01)。结果见表 3。
表 3　余甘子含药血清对小鼠 S180腹水肿瘤细胞的影响( x±s)
组　别 OD值 百分率(%)
正常对照血清 0.120 8±0.006 1 　 0.00
大剂量血清 0.136 8±0.013 2 13.25＊
中剂量血清 0.142 2±0.017 8 17.72＊
小剂量血清 0.144 6±0.009 5 19.70＊
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.01;n=6
3.4　余甘子含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞的活化作用 与正常
对照组比较 ,余甘子溶液大 、中 、小 3个剂量组均具有一定促进作
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2006VOL.17NO.2 时珍国医国药 2006年第 17卷第 2期
用。其中大剂量组具明显促进作用(P<0.01), 中 、小剂量组对
小鼠腹腔巨噬细胞细胞增殖活性促进作用不显著(P>0.05)。
结果见表 4。
表 4　余甘子含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞的活化作用( x±s)
组　别 OD值 百分率(%)
正常对照血清 0.192 7±0.004 5 　0.00
大剂量血清 0.230 5±0.010 8 19.64＊
中剂量血清 0.209 0±0.009 0 8.48
小剂量血清 0.208 5±0.005 0 8.22
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.01;n=6
4　讨论
本实验旨在应用中药血清药理学研究方法 ,研究民族药余甘
子鲜果汁冷冻干燥粉促进小鼠脾淋巴细胞增殖 , 对小鼠 S180腹
水肿瘤细胞存活率的影响以及对小鼠腹腔巨噬细胞活化作用。
在采用血清药理学方法进行实验前 ,进行余甘子时效关系研究是
必要的 , 以便找出给药后的最佳采血时间 , 这样可以避免由于药
物被代谢或尚未吸收造成的假阴性结果 ,理想的采血时间应在血
药浓度的高峰期。由实验结果可以看出 ,余甘子对免疫功能的药
效影响集中在服药后 60 ～ 120, 180min后药效逐渐消失 , 这对临
床用药可能有一定的指导意义 。因此 , 首先通过考察时 -效关系
以确定余甘子含药血清的最佳采血时间 ,在此基础上进一步对余
甘子免疫调节作用做量 -效关系研究。
采用中药血清药理学研究方法 , 中药粗制剂经口服吸收后 ,
用含有药物成分的血清代替中药粗制剂进行体外实验则可排除
中药粗制剂直接加入离体反应体系中各种影响因素的干扰 , 更接
近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程 ,使实验结果的可
信度大大提高。另外 , 若能将血清药理学与血清药物化学有机的
结合起来 ,将有助于中药药代动力学的研究和中药药效物质基础
的阐明 。
余甘子为民族传统习用药材 , 贵州又为八大产区之一 , 野生
资源丰富。余甘子药物制剂及保健品的开发 ,必将促进余甘子药
材资源开发 ,也将推动贵州地方经济的发展。
参考文献:
[ 1 ] 　梁春敏 ,王贤喜 ,董　群 , 等.玉屏风散对小鼠免疫调节作用的血
清药理学研究 [ J] .上海免疫学杂志 , 2003, 23(6):385.
[ 2 ] 　董子明 ,张义国.树突状细胞的特性和功能 [ J] .河南医学研究 ,
1999, 8(1):77.
[ 3 ] 　许化溪 ,刘龚植.小鼠脾脏树突状细胞的分离与鉴定 [ J] .上海免
疫学杂志 , 1991, 11(3):129.
[ 4 ] 　王勇 ,王亚平 , 祝彼得.人参总皂苷对小鼠造血细胞增殖的影响
[ J] .解剖学杂志 , 1995, 18:153.
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草的抗肿瘤作用 [ J] .中国中医药科技 1995, 2(5):19.
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理学研究 [ J] .基层中药杂志 , 2001, 15(6):11.
收稿日期:2005-03-25;　修订日期:2005-12-17
作者简介:徐　标(1979-),男(汉族),湖北武汉人 ,现在读华中科技大学
同济医学院硕士研究生 ,主要从事肝纤维化防治研究工作.
和络舒肝胶囊对日本血吸虫病肝纤维化的治疗作用研究
徐　标
(华中科技大学同济医学院附属普爱医院 ,湖北 武汉　430033)
摘要:目的 研究和络舒肝胶囊对小鼠日本血吸虫病肝纤维化的治疗作用及其机理 , 并与吡喹酮的作用对比。方法 80
只小鼠随机分为 4组。其中 3组小鼠感染日本血吸虫 8周后 , 分别以和络舒肝胶囊 0.1粒 /只 /d治疗 8周 、吡喹酮 500
mg· (kg· d)-1治疗 2 d以及不作任何治疗(实验对照组),第 4组小鼠作为正常对照组。应用免疫组化染色及 HE染色
法 , 观察和分析和络舒肝胶囊及吡喹酮治疗前后各组小鼠肝组织病理改变及血小板衍生生长因 -BB(platelet-derived
growthfactor, PDGF-BB)和Ⅰ , Ⅲ型胶原的表达变化。结果 和络舒肝胶囊治疗后肝纤维化组织病理损伤减轻 , PDGF-
BB和Ⅰ , Ⅲ型胶原含量均明显低于实验对照组(P<0.01)和吡喹酮组(P<0.01或 P<0.05)。结论 和络舒肝胶囊对小
鼠日本血吸虫肝纤维化具有较好的治疗作用 ,其远期抗肝纤维化效果优于吡喹酮。
关键词:和络舒肝胶囊;　日本血吸虫病;　肝纤维化;　血小板衍生生长因 -BB;　胶原
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2006)02-0190-03
TherapeuticalEffectsandMechanismsofHeluoshuganCapsuleonSchistosome-infected
MicewithLiverFibrosis
XUBiao(DepartmentofInfectiousDiseases, PuaiHospitalofTongjiMedicalColege, HuazhongUniversityofScienceand
Techology, Wuhan430033, China)
Abstract:ObjectiveTostudythetherapeuticalefectsandmechanismsofHeluoshugancapsuleonschistosome-infectedmice
withliverfibrosis.Comparetheefectswithpraziquantel.MethodsEightymiceweredividedintofourgroups:threegroupswere
infectedwithSchistosomajaponicum.Aftereightweeks, onegroupwastreatedwithHeluoshugancapsule0.1capsulepermiceev-
erydayfor8weeks, onegroupwastreatedwithpraziquantel500mg/(kg· d)for2daysandtheotherwastakenasexperimental
controlwithoutanytreatment.Thefourthgroupwastakenasnormalcontrol.ImmunohistochemicaltechnologyandHEstaining
wereappliedtoobservethecontentofhepaticPDGF-BB, typeⅠ andtypeⅢ colageninmiceinfectedwithS.japonicumbefore
andaftertreatments.ResultsHeluoshugancapsuletreatmentsignificantlyrelievedpathologicdamagesinlivertissuewithfibrosis,
reducedthecontentofPDGF-BB, typeⅠ andtypeⅢ collagencomparedtotheexperimentalcontrol(P<0.01)andthegroup
treatedwithpraziquantel(P<0.01orP<0.05).ConclusionHeluoshugancapsulehasbetertherapeuticalefectsonSchisto-
some-infectedmicewithliverfibrosisandtheefectssurpasspraziquantelinthelongrun.
Keywords:Heluoshugancapsule;　Schistosomajaponicum;　Liverfibrosis;　PDGF-BB;　Collagen
　　日本血吸虫病的肝纤维化是导致门静脉高压 、腹水和上消化
道出血的主要原因 ,也是日本血吸虫病患者死亡的主要原因 , 目
前国内外尚无理想的抗纤维化药物。文献报道 , 和络舒肝胶囊
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时珍国医国药 2006年第 17卷第 2期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2006VOL.17NO.2