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采用 5.0L全自动发酵罐
进行钝顶螺旋藻培养的研究
谯顺彬1，董汝晶1，田 辉2，张义明1，3，陶希芹1，罗 芳1
( 1.贵州工业职业技术学院，贵州贵阳 550008;
2.贵州茅台酒厂( 集团) 习酒有限责任公司，贵州习水 564622;
3.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550003)
摘 要:采用 5.0L全自动机械搅拌式发酵罐作为培养装置，分别进行了钝顶螺旋藻光合自养和混合营养培养研究。通
过测定最终藻体细胞中藻体干重( DW) 、藻胆蛋白和叶绿素 a等成分，可知混合营养条件下，藻体干重比光合自养培养
时提高 104.75%，但藻胆蛋白和叶绿素 a的含量分别降低 13.5%和 18.2%。在此基础上，进行了螺旋藻混合营养条件
下半连续培养研究，结果表明藻体干重比采用混合营养分批培养时提高 38.05%，而藻胆蛋白和叶绿素 a 的含量则分
别降低 3.76%和 1.75%。从最终培养结果可知，利用光生物反应器对螺旋藻进行规模化半连续培养是一种可行的培
养方式。
关键词:全自动发酵罐，钝顶螺旋藻，藻体干重( DW) ，半连续培养
The research of S.platensis cultivated using
a 5.0L automatic fermenter
QIAO Shun－bin1，DONG Ru－jing1，TIAN Hui2，ZHANG Yi－ming1，3，TAO Xi－qin1，LUO Fang1
( 1.Guizhou Industry Polytechnic College，Guiyang 550008，China;
2.Guizhou MouTai( Grounp) Xi Jiu Company limited，Xishui 564622，China;
3.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guiyang 550003，China)
Abstract: A 5.0L automatic fermenter，respectively was used to cultivate the S.platensis in the condition of
photoautotrophy and mixotrophy，respectively.Firstly，three critical ingredients were measured timely in the process
of the cultivating S.platensis under the photoautotrophy and mixotrophy，including dry weight ( DW ) ，
phycobiliproteins and chlorophyll－a.According to the experiment results，the DW that was in mixotrophy condition
was more 104.75% than the photoautotrophy，the phycobiliproteins and the chlorophyll－a yet were lower，the value
were 13.5% and 18.2%，respectively.The results showed that the DW was more 38.05% than batch cultivation.
However，the phycobiliproteins and the chlorophyll － a yet were lower，the value were 3.76% and 1.75%，
respectively. Therefore，the method which cultivated S.platensis in the condition of mixotrophy using the
semi－ continuous cultivation mode was a worthy method in photo bioreactor when S.platensis was cultivated in the
large－ scale.
Key words: automatic fermenter; S.platensis; dry weight; semi－continuous cultivation
中图分类号:Q939.97 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2013)15－0144－05
收稿日期:2013－01－04
作者简介:谯顺彬( 1981－ ) ，男，硕士研究生，研究方向:应用微生物。
基金项目: 国家自然科学基金项目( 39860004) ;贵州省科学技术基金
项目( 黔科合) J字【2010】2068 号) 。
螺旋藻(Spirulina)是一种分布于热带、亚热带地
区淡水或盐碱性湖泊中的原核微生物，因其细胞呈
丝状、缠绕成螺旋状而得名，又称为蓝细菌，其细胞
内含有丰富的营养物质，包括蛋白质、碳水化合物、
维生素、叶绿素、藻多糖、不饱和脂肪酸及微量元素
等，易于人体消化和吸收［1］。作为一种新型蛋白食品
资源，细胞中蛋白质含量占藻体干重的 60% ～70%，
且细胞中的藻多糖因具有防癌、防辐射、抗突变、抑
制癌细胞 DNA的合成和抗衰老等作用，尤为引人注
目［2］。因此，螺旋藻已成为联合国粮农组织推荐的健
康食品之一。目前，螺旋藻规模化生产主要采用室
外大池培养，对地域和环境依赖强，培养产率低，只
有 0.5g /L左右［3］，这极大地制约了螺旋藻产业的发
展。为了满足市场需求，提高产率，各国研究人员一
直在探索螺旋藻的最佳培养方式。混合营养培养是
解决这一发展瓶颈的主要研究方向，这种培养方式
主要是通过添加合适的营养成分来降低藻体生长对
环境的依赖，促进藻体生长，实现高产［4］。目前有关
螺旋藻混合营养培养的研究报道甚多，有的也取得
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.15.014
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了较好的培养效果［5－6］。然而这些研究主要围绕培
养基成分、培养条件的优化或光生物反应器的研究
设计等为主，尽管培养产率有所提高，但在培养时仍
存在一些不足之处，主要集中在研究只限于摇瓶培
养阶段，研究结果难以扩大，反应器结构复杂，价格
昂贵等。本研究在前期摇瓶培养实验的基础上，利
用 5.0L全自动发酵罐作为培养装置，分别在光合自
养和混合营养两种条件下进行螺旋藻培养的研究，
探索摇瓶实验的培养条件在扩大培养中的变化情
况。同时，为降低培养成本，在混合营养分批培养的
基础上探索了半连续培养模式，旨在为规模化培养
螺旋藻提供具有一定参考价值的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
钝顶螺旋藻(S.platensis)fachb－350 中科院武
汉水生生物研究所;采用 AB 培养基作为基础培养
基，试剂均为分析纯。
BIOSTAT B5 5.0L全自动发酵罐 德国 B.Braun
Biotech International公司。根据螺旋藻的生长特性，
在螺旋藻培养过程中配置了温控系统、光照系统及
通气装置。
1.2 实验方法
本实验分别在光合自养和混合营养两种条件下
进行螺旋藻培养。在摇瓶实验的基础上进行 5.0L全
自动发酵罐的培养研究，旨在为螺旋藻规模化培养
提供理论依据。
1.2.1 两种培养环境下采用光合自养培养螺旋藻
分别在摇瓶及 5.0L 全自动发酵罐中进行，培养均采
用 AB培养基，两种环境下初始为 pH为 9.5 ± 0.1，培
养温度为(30 ± 1)℃，作为基础培养基。摇瓶培养方
式为:培养基灭菌冷却后，向 250mL 无菌三角瓶装入
150mL培养基，接种量为 10%，转速为 120r /min，光
照强度为(4 ± 0.3)klx，连续光照下培养 10d(前期实
验证明在此时已达平衡期)。5.0L 全自动发酵罐培
养方式为:培养基灭菌冷却后直接装罐，光照强度为
(4 ± 0.3)klx(反应器外壁处)、接种量为 10%，装液
系数为 0.8，搅拌转速为 120r /min，培养时间 12d。培
养期间每天按时测定螺旋藻藻体干重、pH 以及培养
结束后藻胆蛋白、叶绿素 a含量。
1.2.2 两种培养环境下采用混合营养分批培养 在
摇瓶及 5.0L全自动发酵罐中进行。根据前期研究结
果，实验采用优化后的培养基，即将 AB 培养基中碳
酸氢钠和硝酸钠的添加量改为 10、3.5g /L 后，再依次
加入葡萄糖1.5g /L、VB12 0.08、Arg 45和 NAA 0.3mg /L，
其他成分及培养条件与光合自养培养相同。每天定
时测定藻体干重和 pH，在混合营养条件下研究发酵
罐对螺旋藻培养效果。为了降低培养成本，实验还
探讨了在 5.0L全自动发酵罐中进行螺旋藻混合营养
半连续培养的生长情况，即在维持相同培养基成分
及其它培养条件的情况下，从开始接种 24h 后每天
按时取出 100mL 培养液，测定培养过程中的藻体干
重、pH，同时添加 100mL 新鲜培养基进行培养，并将
培养时间延长至 30d。在此期间，当培养至第 10d 和
第 20d时，分别取出 90%的培养液进行抽滤，然后再
将滤液加入发酵罐进行培养研究。
培养结束后，对几种培养环境下螺旋藻的形态
和染菌情况进行显微镜观察，并测定最终获得的螺
旋藻的藻胆蛋白、叶绿素含量等指标。
1.2.3 藻体生物量测定方法 采用干重法［7］(DW)
按式(1)计算干重。取培养液 20mL于已烘干至
恒重的纸片抽滤，蒸馏水冲洗两次，85℃烘干至恒
重，用精密电子天平称量。
DW(g /L)=
M2－M1
20 × 1000 式(1)
式中:M1－抽滤前纸片烘干至恒重质量，g;M2 －
抽滤后纸片烘干至恒重质量，g。
1.2.4 藻胆蛋白的测定方法 采用紫外分光光度法［8］。
采用低温冷冻干燥获得螺旋藻干粉。准确称取
螺旋藻干粉 0.020g，用 10mL 左右的 0.1mol /LpH 为
7.0 的磷酸盐缓冲溶液溶解。超声振荡 10min，使藻
粉分散并部分破碎。置于－20℃冰箱内冷冻 12h(或
放置过夜)取出解冻，反复冻融两次，在 3500r /min转
速下离心 10min。取出上清液于 25mL 容量瓶中，将
下层沉淀再加入磷酸盐缓冲溶液，摇匀，超声振荡
5min，在 3500r /min转速下离心 10min。取出上清液
于 25mL容量瓶中。反复上一步操作直到上清液无
明显蓝色为止。定容至 25mL，1cm比色皿，在分光光
度计上分别测定 562、620、652nm 处的吸光度，用缓
冲液做空白。根据式(2)～式(5)计算出试样中藻胆
蛋白的质量分数含量。
CPC =［A620－(0.474 × A652) ］÷ 5.34 式(2)
APC =［A652－(0.208 × A620) ］÷ 5.09 式(3)
CPE =［A562－(2.41 × CPC)－(0.849 × APC) ］÷
9.62 式(4)
PB =(CPC + APC + CPE)× V × 100m × 1000 式(5)
式中:CPC－测试样中藻蓝蛋白的含量，单位为
(mg /mL) ;APC－测试样中别藻蓝蛋白的含量，单位
为(mg /mL) ;CPE－测试样中藻红蛋白的含量，单位
为(mg /mL) ;A－相应波长处(562、620、652nm)测得
吸光值;PB－试样中藻胆蛋白的质量分数，单位为
(g /100g) ;V－样品定容体积，单位为(mL) ;m－试样
质量，单位为(g)。
注意:结果取平均实验结果，保留小数点后第三
位，平行实验允许误差(相对)不大于 4%。
1.2.5 螺旋藻中叶绿素 a 的测定方法 采用低温冷
冻干燥获得得螺旋藻干粉［9］。
准确称取螺旋藻干粉 0.010g，加入一定量的
90%乙醇溶液，用超声破碎藻体细胞。镜检藻细胞
破碎率达 90%时，于(53 ± 1)℃恒温水浴锅中萃取
10min。在 3500r /min转速下离心 5min。将上清液置
于 25mL 具塞比色管中。再将沉淀加入一定量的
90%乙醇溶液，振荡摇匀。重复上一步操作，直到上
清液无色。将上清液定容至 25mL。以 90%乙醇溶
液作为空白。用 1cm 比色皿，分光光度计测定其在
665、750nm处的吸光值 A665、A750。再将样品加入 3 滴
1mol /L HCl，进行酸化。15min 后测定其在 665、
146
750nm处的吸光值 B665、B750。
根据式(6)计算 chl－a的浓度:
chl－a = 27.9 ×［(A665 － A750 －(B665 － B750) ］
叶绿素含量(mg·g －1)= C × VA × 100 式(6)
式中:C－叶绿素 a 的浓度;A665－乙醇萃取液于波
长 665nm处的吸光值;A750－乙醇萃取液于波长 750nm
处的吸光值;B665－乙醇萃取液酸化后于波长 665nm
处吸光值;B750－乙醇萃取液酸化后于波长 750nm 处
的吸光值;V－乙醇萃取液的体积(mL) ;A－藻粉重
量(g)。
1.2.6 螺旋藻培养液 pH的测定方法 用 pH－3C 数
字式酸度计测定培养液的 pH。
1.2.7 光照强度的测定方法 用 LX－101 数字光度
表来测定光照强度，单位为 klx。
1.2.8 螺旋藻形态检测 用 ECLIPSE－E200 显微镜
观察细胞的形态和可能的染菌情况，并采用平板涂
布的方法进行进一步的检查。
2 结果与分析
2.1 光合自养培养结果对比
图 1 是光合自养培养条件下螺旋藻在摇瓶与发
酵罐中的生长情况。
图 1 两种培养模式下螺旋藻光合自养生长曲线
Fig.1 The growth curve of S.platensis with
the photoautotrophic mode in two fermenters
由图可知，在发酵罐中，螺旋藻随培养时间的延
长，干重逐渐增大，培养至 12d 时细胞生长基本趋于
稳定，藻体干重最终为 0.7889g /L。与摇瓶培养相
比，尽管发酵罐中干重略有增加，但细胞生长的适应
期、对数生长期要弱于摇瓶培养。主要是因为发酵
罐直径比摇瓶大，为确保细胞免受剪切力损伤，反应
器的搅拌转速取得较低，细胞在反应器中循环时由
于离子间的屏蔽效应，单个藻体细胞受光照时间较
少，生长速度较慢，因此在发酵罐中培养周期延长 2d
后藻体细胞生长才达到生长平衡期。
2.2 混合营养培养结果对比
图 2 是混合营养培养条件下，螺旋藻在摇瓶与
全自动发酵罐中的生长情况。
由图 2 可以看出，采用混合营养培养时，摇瓶与
发酵罐中螺旋藻生长曲线基本一致。摇瓶培养至第
10d时藻体干重达为 1.6145g /L，而发酵罐培养至第
12d时藻体干重为 1.6153g /L，比同等条件下光合自
养培养时增加了 104.75%，这主要是因为在混合营养
图 2 两种培养模式下螺旋藻混合营养培养生长曲线
Fig.2 The growth curve of S.platensis with
the mixotrophic mode in two fermenters
条件下，由于添加了有机碳源葡萄糖，为螺旋藻细胞
生长提供了一定的能源，降低了细胞生长过程中对
光照的依赖性。在混合营养培养条件下，在培养前
期藻体细胞先以异养生长为主，当葡萄糖消耗殆尽
后，才进行光合自养生长。通过对螺旋藻培养液中
葡萄糖含量的跟踪测定发现，培养至第 5d 时，摇瓶
和发酵罐培养液中均检测不到葡萄糖的含量。
图 3是在混合营养条件下，培养时间延长至 30d
时藻体细胞的生长情况。在整个培养过程中，分别在
第 10d、第 20d时依次取出 90%的培养液，经抽滤分离
藻体细胞后将滤液再放入反应器中重新培养，余下
10%培养液作为藻种。培养结束后，三次收集藻体细
胞经干燥后质量为 15.6098g，按每天添加 100mL 新鲜
培养基计算，培养液体积共约 7L，则藻体干重为
2.2300g /L，比混合营养分批培养时增加了 38.05%。
图 3 螺旋藻混合营养半连续培养生长曲线
Fig.3 The growth curve of S.platensis with
the mixotrophic mode in 30d
2.3 几种不同培养方式下螺旋藻培养结果分析
图 4 是在发酵罐中，分别进行光合自养和混合
营养培养时 pH的变化情况。由图可知，光合自养培
养时培养液 pH 都要略高于混合营养培养。在培养
的前 5d，两种培养方式下 pH 变化趋势基本一致，而
在培养后期，采用光合自养培养时 pH 变化幅度较
大，而混合营养培养方式下培养液 pH变化较小。pH
的变化趋势在一定程度上反映出培养液中无机碳源
被利用的情况，这是因为培养液中的碳酸氢根与碳
酸根离子是一组缓冲体系，两者含量变化会导致 pH
变化是一个动态变化过程，随着无机碳源不断消耗
从而使培养液中的 pH 不断上升。到目前为止进行
螺旋藻混合营养培养时，普遍认为藻体细胞先利用
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有机碳源葡萄糖，但也有研究人员认为在混合营养
生长的前期，螺旋藻先以光合自养方式生长，同时将
葡萄糖转化到螺旋藻细胞中，当细胞进入生长后期，
光照强度不足以提供细胞生长的要求时，便将细胞
中的葡萄糖氧化生成能源和释放出螺旋藻生长所需
的碳源进一步生长［10］。根据图 4 所示，假设培养过
程中葡萄糖是在培养后期才被螺旋藻细胞转化成其
生长所需的碳源和能源，就能解释混合营养培养后
期 pH变化较小的原因了。但螺旋藻培养前期为什
么会选择将培养液中的葡萄糖提前转化到螺旋藻细
胞而没有利用呢?这个问题还有待进一步研究。
表 1 不同培养方式下钝顶螺旋藻生长情况
Table 1 The difference of several indicators with the different conditions of culture
不同培养方式 藻体干重(g /L) 藻胆蛋白(mg /g) 叶绿素 a(mg /g) pH
光合自养培养 0.7889 182.30 10.803 11.58
混合营养培养(12d) 1.6153 160.69 9.137 11.14
混合营养培养(30d) 2.2299 154.87(均值) 8.980(均值) 11.08
注:表中“均值”指三次细胞采集后的测得的平均值。
图 4 两种培养方式下螺旋藻 pH变化
Fig.4 The difference of pH value in two conditions of culture
培养结束后，分别对几种培养方式下的藻胆蛋
白、叶绿素 a 含量以及 pH 进行测定，结果如表 1 所
示。由表可知，从藻体干重来看，在三种培养方式
中，混合营养分批培养与半连续培养的效果明显高
于光合自养培养，藻体干重分别增加 104.75%、
182.65%;从藻胆蛋白含量来看，在光合自养培养条
件下螺旋藻能积累更多的藻胆蛋白，分别比混合营
养分批培养和半连续培养下多 13.5%、17.7%。这主
要是因为在光合自养培养下细胞生长对光照的依赖
性更强，细胞中光合色素需要吸收能量才能生长，为
了满足生长的需要，因此在细胞质的合成中就积累
了更多的光合色素，尤其是其中的藻胆蛋白。同时，
光合自养条件下获得的藻体细胞中叶绿素 a 含量比
混合营养条件下两种培养方式获得的叶绿素 a 含量
分别高 18.2%和 20.3%。
在进行混合营养半连续培养时，由于在此期间
进行了两次藻体细胞收集，而且培养液在每次循环
使用时除每天补加的 100mL 新鲜培养基外，未曾添
加其他营养成分，随着培养时间的不断延长，培养液
中营养成分逐渐下降，细胞生长达平衡期时最大生
物量也逐渐减小，每一次收集的藻体细胞因培养营
养成分含量降低而造成细胞内各成分含量略有不
同。此外，在光合自养条件下，培养液最终 pH 大于
混合营养培养。
2.4 细胞形态及染菌情况观察
图 5 表示几种培养条件下藻体细胞的镜检结
果。由于螺旋藻细胞一直处于较高的 pH 范围内
(9.50 ± 0.01～10.50) ，大多数杂菌难于生长，因此，在
整个培养过程中，未检测到螺旋藻染菌情况。在光
合自养条件下，细胞生长速率慢，衰亡细胞较少;在
混合营养条件下，由于补加一定的营养成分，细胞生
长速率较快，培养液黏度比光合自养时高，在反应器
底部有少量死亡的聚集细胞。在半连续培养方式
下，由于培养液重复利用，且培养时间长，底部除有
少量的死亡细胞外，培养液中断裂的细胞也较多，一
方面是搅拌器的机械损伤，另一方面是由于在抽滤
时人为造成的损伤。
图 5 螺旋藻形态及染菌情况
Fig.5 The cell morphology of S.platensis
and the situation of bacterial contamination
3 结论
3.1 在本实验中，采用摇瓶和 5.0L 全自动发酵罐分
别进行了光合自养和混合营养培养实验。首先在光
合自养条件下，采用 AB培养基进行螺旋藻培养对比
实验，结果表明，在两种反应装置下藻体细胞生长情
况基本一致，差别在于两种反应器容积不同，由于离
子间屏蔽效应导致发酵罐中藻体细胞达到平衡期较
摇瓶培养晚 2d。其次，在混合营养条件下，两种反应
装置中藻体干重均有较大提高，比光合自养条件下
提高约 104.75%。由于混合营养条件下降低了细胞
生长对光照的依赖性，因此两种培养装置中细胞生
长情况差别也不大。在进行半连续培养时，由于培
养时间延长，最终获得了更多的藻体干重，比分批培
养提高了 38.05%。最后，对几种培养条件下细胞中
藻胆蛋白、叶绿素 a 含量及培养液 pH 进行了比较，
148
在光合自养下细胞中能积累更多的藻胆蛋白和叶绿
素 a，培养液最终 pH大于混合营养培养。
3.2 结果表明，尽管混合营养半连续培养的藻体细
胞品质比光合自养条件下略差，但最终藻体干重得
到了极大提高，降低了培养成本。因此，从长远来
看，混合营养半连续培养是一种可行的培养方式。
如果在每次回收培养液时测定其各组分含量，根据
需要补加相应的成分应该会得到更好的培养结果，
这有待今后进一步的研究。
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