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茅苍术提取物含药血清对大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用
刘菊燕， 巢建国* ， 谷 巍， 席蓓莉， 李孟洋
(南京中医药大学，江苏 南京 210023)
收稿日期:2014-10-06
基金项目:国家工业和信息化部 2013 年度中药材生产建设项目 (2013018) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目 (ysxk-2014) ;国家
基本药物所需中药材种子种苗繁育基地建设项目 (2014-茅苍术)
作者简介:刘菊燕 (1988—) ，女，硕士，从事中药资源培育与利用研究。Tel:18252067609，E-mail:niupi909@ 163． com
* 通信作者:巢建国 (1960—) ，男，硕士，教授，硕士生导师，从事中药资源开发与研究。Tel:13851562488，E-mail:jgchaol016@
163． com
摘要:目的 利用中药血清药物化学及血清药理学方法，探讨茅苍术保护心肌细胞氧化损伤的物质基础。方法 测定
和比较茅苍术提取物及其灌胃给药前后大鼠空白和含药血清中的入血成分，然后体外培养 H9c2 大鼠心肌细胞，建立
H2O2 氧化损伤模型，以细胞形态、LDH释放量、SOD活力、MDA水平及细胞相对凋亡情况为指标，考察茅苍术提取
物及其含药血清对心肌细胞损伤的影响。结果 茅苍术提取物在血清中出现 11 个移行成分，其中 7 个为原型成分，
另外 4 个可能为代谢产物。H2O2 损伤组与正常对照组相比，细胞皱缩并且变圆，数量明显减少，LDH释放量及 MDA
水平明显升高，SOD活性降低，细胞凋亡率增加;与 H2O2 损伤组相比，阳性 Vc 对照组、茅苍术提取物及其含药血
清作用组的细胞数目增多，LDH释放量和 MDA水平均有不同程度的降低，SOD 活性升高，凋亡细胞数目减少。结论
茅苍术提取物的 11 个入血成分可能为茅苍术保护心肌细胞氧化损伤的物质基础。
关键词:茅苍术;血清药物化学;血清药理学;氧化损伤;H9c2 心肌细胞
中图分类号:Ｒ966 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2015)07-1585-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 07. 044
研究表明［1］，体内抗氧化功能减弱以及自由基，特别
是活性氧自由基 (ＲOS)的增加与各种心血管疾病的发生
和发展密切相关。H2O2是一种重要的 ＲOS，极易透过细胞
膜与细胞内 Fe2 +反应，形成高活性的自由基，从而导致一
系列反应。由于其易于获得，而且性质相对稳定，因此已
成为研究细胞氧化损伤的重要工具［2］。近年来研究发
现［3］，一些中药及其有效成分对心肌细胞的氧化损伤具有
保护作用，并且活性高、毒性小、临床效果优于单体。
茅苍术为菊科植物茅苍术 Atractylodes lancea (Thunb．)
DC． 的干燥根茎，中医临床应用历史悠久。药理和临床实
验表明［4-5］，它具有保肝、降血糖、抗炎、抗肿瘤和抗氧化
等作用，但对其抗氧化的作用机制及发挥药效的物质基础
研究较为薄弱。本实验采用中药血清药物化学和血清药理
学方法来探讨茅苍术保护心肌细胞氧化损伤的作用，为建
立该植物及其提取物的多指标质量控制标准奠定基础。
1 材料
1. 1 动物 SPF 级 SD 雄性大鼠，体质量 180 ～ 220 g，动
物许可证号 SCXK (京)2012-0001 (北京维通利华实验动
物技术有限公司) ，于 SPF 级动物房饲养，定时喂食全价
营养饲料，室温 20 ℃ ～25 ℃，相对湿度 50% ～70%。
1. 2 药材与试剂 茅苍术采自江苏省茅山地区，经南京中
医药大学中药资源学教研室巢建国教授鉴定为菊科植物茅
苍术 Atractylodes lancea (thumb．)Dc． 的根茎，除去其杂质
及泥土，自然晾干后粉碎，过 60 目筛。
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甲醇、乙腈为分析纯 (美国天地试剂公司) ;甲酸为
分析纯 (上海晶纯生化科技股份有限公司) ;澳洲胎牛血
清、DMEM 高糖培养液、0. 25% 胰蛋白酶 (批号分别为
1431602、NYH0948、20140216，美国 Gibco公司) ;青链霉
素混合液 (100X)、PBS 磷酸盐缓冲液 (0. 01 mol /L)、3-
(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT)
(批号分别为 20140317、T20130825、509E024，北京索莱
宝科 技 有 限 公 司) ;二 甲 基 亚 砜 (DMSO，批 号 为
1028D005，国药集团化学试剂有限公司) ;抗坏血酸 (Vc，
批号为 100425-201103，中国食品药品检定研究院) ;LDH、
SOD、MDA 试剂盒 (批号分别为 20140417、20140331、
20140321，南京建成生物工程研究所)。
1. 3 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪，包括 Agilent
DAD二极管阵列检测器 (美国 Agilent Technologies 公司) ;
Hedra C18色谱柱 (4. 6 mm × 250 mm，0. 5 μm) ，包括 5 cm
保护柱 (江苏汉邦科技有限公司) ;CO2 细胞培养箱 (日
本 Sanyo 公司) ;CKX31 型倒置显微镜 (日本 Olympus 公
司) ;752 型紫外可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公
司) ;Model 680 型酶标仪 (美国 Bio-Ｒad公司) ;96 孔细胞
培养板 (美国 Corning 公司) ;AUW220D 电子天平 (日本
岛津公司) ;Milli-Q超纯水器 (美国 Millipore公司)。
1. 4 细胞系 H9c2 心肌细胞系 (中国科学院上海细
胞库)。
2 方法
2. 1 茅苍术提取物制备 茅苍术药材干燥粗粉用重蒸水浸
泡 1 h，回流提取 2 次，每次 1 h，提取液合并后过滤，滤
液减压浓缩得到浸膏，65 ℃下烘干，即得茅苍术提取物
(每 1 g相当于生药 3. 5 g) ，4 ℃冰箱保存备用。
2. 2 茅苍术提取物供试液制备 精密称取“2. 1”项下制
备的茅苍术提取物 0. 2 g，置于小烧杯中，缓慢加入 95%乙
醇，慢加快搅，至不再有絮状物析出为止。然后静置过夜，
抽滤后将滤液浓缩，甲醇溶解并定容至 50 mL，离心
(3 000 r /min，10 min) ，取上清液，过 0. 22 μm 微孔滤膜
后取续滤液，即得茅苍术提取物供试液，供 HPLC分析用。
2. 3 茅苍术提取物灌胃样品的制备 精密称取“2. 1”项
下制备的茅苍术提取物适量，重蒸水溶解并配置成 0. 052 1
g /mL的茅苍术提取物药液，即得茅苍术提取物灌胃样品
(约相当于临床成人用药量的 30 倍)。
2. 4 含药血清和空白血清样品制备［6］ 取成年健康 SD 大
鼠 10 只，禁食 12 h 后眼眶取血，以 1 mL /100 g 的量灌胃
给予 “2. 3”项下制备的茅苍术提取物药液 (0. 065
g /mL) ，空白组灌胃给予等量重蒸水，每日 2 次，连续 3
d，末次给药后 2 h采集含药和空白血液，取血前大鼠自由
饮水。将空白和含药血液低温静置 40 min，凝结后低速离
心 15 min (3 000 r /min) ，分离血清。取上层血清 1 mL，加
乙腈 5 mL后快速涡旋 3 min，混匀，高速离心后取上清液，
45 ℃氮吹仪吹干。残渣用初始比例的流动相复溶，离心 10
min (12 000 r /min) ，取上清液，供 HPLC 分析用。另取血
清适量，56 ℃下水浴灭菌 30 min，0. 22 μm微孔滤膜过滤，
－ 20 ℃下保存备用。
2. 5 HPLC 条件 Hedra C18色谱柱 (4. 6 mm × 250 mm，
0. 5 μm) ，保护柱 5 cm;检测波长 221 nm;流量 0. 6
mL /min;柱温 30 ℃;进样量 20 μL;流动相为乙腈 (A)-
0. 25%甲酸水溶液 (B) ，梯度洗脱顺序见表 1。
表 1 流动相梯度洗脱顺序
时间 /min A /% B /%
0 2 98
17 5 95
25 12 88
35 12 88
50 17 83
70 34 66
75 40 60
2. 6 心肌细胞培养［7］ H9c2 心肌细胞在含有 10%胎牛血
清的 DMEM高糖培养基中，37 ℃、5% CO2 条件下培养，
至贴壁细胞达到瓶壁的 85% ～ 90% 时，PBS 清洗 3 次，
0. 25%胰蛋白酶消化细胞，每 2 天更换 1 次培养液，按每
孔 5 × 104 个 /mL的密度接种于 96 孔培养板上。
2. 7 心肌细胞药物预处理、H2O2 损伤及相关指标检测 将
96孔板中培养 24 h后的 H9c2细胞更换新的培养液，分组并
加药预处理方法如下。(1)正常对照组:用培养液正常培
养。(2)H2O2 损伤组:加入 H2O2 使其终浓度为 100
μmol /L，作用于细胞 2 h。(3)阳性 Vc对照组:加入 Vc溶
液使其终质量浓度为 500 μg /mL。(4)空白血清组:培养液
中加入空白血清。(5)含药血清组:培养液中加入含药血
清。(6)高剂量茅苍术提取物作用组:加入“2. 1”项下茅
苍术提取物使其终质量浓度为 500 μg /mL。(7)中剂量茅苍
术提取物作用组:加入茅苍术提取物使其终质量浓度为 250
μg /mL。(8)低剂量茅苍术提取物作用组:加入茅苍术提取
物使其终质量浓度为 100 μg /mL。各处理组均为先加入
H2O2 损伤 2 h，再加入药物作用 24 h，然后观察细胞的形
态，并收集各组培养液，检测 LDH 释放量、SOD 活力、
MDA水平及细胞活力。
3 结果
3. 1 茅苍术提取物入血成分的确定 含药血清主要含有
17 个成分峰，与空白血清图比较，6 个为血清中的固有成
分峰，但部分成分在含药血清中的含有量明显增大 (峰 2、
6、11) ，其原因有待进一步研究;与茅苍术提取物图的 18
个峰比较，有 7 个成分直接进入血清 (峰 1、2、4、6、11、
15、18) ，而且含药血清峰 1、2、3、4的来源可能是茅
苍术提取物在大鼠体内的代谢成分，其确切来源需进一步
鉴别，见图 1。
3. 2 茅苍术提取物及其含药血清对心肌细胞形态的影响
H9c2 心肌细胞进行不同药物处理之后，在倒置显微镜下观
察各组细胞的形态。结果发现，正常对照组的心肌细胞贴
壁生长，呈梭形或不规则三角形，细胞核呈卵圆形并居中
或紧贴细胞壁;H2O2 损伤组和空白血清组的细胞体积均缩
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a． 茅苍术提取物 b． 茅苍术提取物含药血清 c． 空白血清
图 1 空白血清、茅苍术提取物及其灌胃给药后含药血清的 HPLC图
小，呈圆形或者椭圆形，细胞核浓缩，细胞边缘模糊，出现
溶解现象;阳性 Vc作用组的细胞与 H2O2 损伤组细胞相比，
贴壁细胞数量较多，生长状态良好;含药血清组和不同剂量
茅苍术提取物作用组心肌细胞的生长状态有所改善，细胞形
态明显好于损伤组，且贴壁细胞数量也多于损伤组;含药血
清对细胞有一定程度的保护作用，其生长状态好于空白血清
组;不同剂量茅苍术提取物作用组的细胞生长状态不同，高
剂量组生长较好，中剂量组次之，低剂量组较差。
3. 3 茅苍术提取物及其含药血清对 H9c2 心肌细胞 LDH释
放量、SOD活力及 MDA水平的影响 乳酸脱氢酶 (LDH)
释放量、超氧化物歧化酶 (SOD)活力测定结果及丙二醛
(MDA)水平变化情况见表 2。由表可知，H2O2 损伤组的
LDH释放量和 MDA 水平明显增高，分别为正常对照组的
1. 38 倍和 4. 31 倍，而 SOD 活力明显降低，为正常对照组
的 34%;高、中、低剂量茅苍术提取物作用组的 LDH释放
量和 MDA水平均有不同程度降低，LDH释放量与 H2O2 损
伤组比较，分别降低了 16. 01%、14. 80%、8. 14%，MDA
与 H2O2 损伤组比较，分别降低了 28. 52%、60. 70%、
56. 36%，显示出剂量依赖关系;3 种剂量茅苍术提取物作
用组的 SOD活力均有不同程度升高，SOD 与 H2O2 损伤组
比较，分别升高了 60. 27%、48. 55%、6. 96%，而阳性 Vc
对照组 LDH释放量和 MDA 水平明显低于损伤组，但高于
茅苍术提取物作用组，并且 SOD 活力也明显高于损伤组，
但都没有恢复至正常对照组水平;与空白血清组比较，含
药血清组亦能显著升高 SOD 活力，降低 MDA 水平，但降
低 LDH含有量不显著。
表 2 茅苍术提取物含药血清对 H9c2 细胞 H2O2 损伤后 LDH释放量、SOD活力及MDA水平的影响 (x ± s，n =8)
组别 LDH /(U·L －1) MDA /(nmol·mL －1) SOD /(U·mL －1)
正常对照组 280. 63 ± 9. 06 9. 14 ± 0. 10 46. 54 ± 0. 18
H2O2 模型组 388. 09 ± 8. 11* # 39. 44 ± 0. 08＊＊## 15. 64 ± 0. 18＊＊##
阳性 Vc对照组 307. 29 ± 5. 85ΔΔ 13. 73 ± 0. 11ΔΔ 41. 45 ± 0. 19ΔΔ
空白血清组 350. 37 ± 5. 93* 36. 54 ± 0. 15* # 29. 75 ± 0. 49* #
含药血清组 327. 11 ± 4. 53Δ 23. 26 ± 0. 14Δ 36. 69 ± 0. 25Δ
茅苍术提取物高剂量组 325. 97 ± 8. 22Δ 28. 19 ± 0. 16* # 39. 36 ± 0. 13ΔΔ
茅苍术提取物中剂量组 330. 65 ± 7. 30Δ 15. 50 ± 0. 15* ΔΔ 30. 40 ± 0. 21* #
茅苍术提取物低剂量组 356. 51 ± 10. 47* 17. 21 ± 0. 16* ΔΔ 16. 81 ± 0. 85＊＊##
注:与正常对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01;与阳性 Vc组比较，#P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01;与模型组比较，ΔP ＜ 0. 05，ΔΔP ＜ 0. 01
3. 4 茅苍术提取物及其含药血清对心肌细胞凋亡的影响
每个处理组细胞的相对凋亡率用 MTT 法初步检测判断，结
果如图 2。由图可知，以正常对照组的相对存活率为标准，
H2O2 损伤组的损伤率显著增高，为 44. 34%;3 种剂量茅
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苍术提取物作用组细胞的存活率分别为 72. 37%、66. 19%、
55. 44%，与茅苍术提取物浓度成明显的效应剂量关系，但
低剂量组对 H2O2 损伤的 H9c2 心肌细胞的保护作用不明
显;与空白血清组相比，含药血清组细胞的存活率也较高，
为 67. 08%;与 H2O2 模型组比较，正常对照组、阳性 Vc
对照组和茅苍术提取物高剂量组均有非常显著的差异，含
药血清组和茅苍术提取物中剂量组有显著性差异，其余组
的差异不明显。
注:与 H2O2 模型组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 2 不同处理组细胞的存活率
4 讨论
中药药效物质基础一直是困扰中药现代化研究的一个
瓶颈问题，目前相关研究的主要途径是从各种中药中提取
分离得到大量化合物，并对其进行一系列活性筛选，从而
判断它们是否具有活性。但由于中药成分的复杂多样性，
故仅依此来判断往往误差较大［8］。自从 20 世纪 80 年代末
日本学者田代真一初步提出血清药理学和 “血清药物化
学” (serum pharmacochemistry，SPC)的概念后，90 年代
我国学者王喜军教授也随之提出 “中药血清药物化学”
(serum pharmacocemistry of TCM)的概念，从此，血清药理
学和血清药物化学在研究中药药效物质基础方面日益凸显
出其重要地位［9］。通过两者的联合应用，既可以将体外与
体内实验相结合，又可以初步判定进入体内发挥药效的成
分 (即入血成分) ，从而更确切地反映中药的药效物质
基础［10］。
目前对茅苍术药效物质基础的研究较少，本实验首次
将血清药理学和血清药物化学结合起来，用以研究该植物
保护心肌细胞氧化损伤的物质基础。通过应用中药血清药
物化学的方法，比较了茅苍术提取物及其灌胃给药前后含
药和空白血清的 HPLC，结果发现 11 个与茅苍术相关的入
血成分，其中 7 个是原型成分，另外 4 个是其经过大鼠体
内代谢新产生的成分 (即血中移行成分)。同时，通过应
用中药血清药理学方法，并利用体外 H9c2 心肌细胞氧化
损伤模型模拟体内氧化损伤，对茅苍术提取物及其含药血
清作用 H2O2 处理过的 H9c2 心肌细胞进行研究。结果发
现，两者均具有保护心肌细胞氧化损伤的药理活性，说明
其保护心肌细胞氧化损伤的物质基础为入血成分，结合血
清药物化学研究结果，本实验初步判断为 7 个茅苍术的原
型成分或 4 个移行成分，其具体物质的鉴定尚有待于进一
步研究。
实验发现，茅苍术提取物的量效关系并不明显，对各
项相关指标的效应也并不平行，这可能正是中药作用相对
较缓和，以及“多成分、多靶点、多渠道”特点的集中体
现。而氧化损伤的病因机制是多环节多通路的，发挥药效
作用的往往不是一个有效成分，而是多个有效成分之间的
相互协同、相加甚至拮抗的共同效应来发挥疗效，因此使
其预防该疾病成为可能。本实验对探清茅苍术的药效物质
基础及作用机制，建立多指标质量控制标准具有积极意义。
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