全 文 ：第 22卷　第 3期
2004年 9月 　　　　　　
广西师范大学学报 (自然科学版 )
JOURN AL O F GUANGXI NORM AL UNIV ERSITY
　　　　　　 Vo l. 22　　 No. 3
September　 2004
收稿日期: 2004-04-02
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 30260013)
作者简介: 周俊亚 ( 1979— ) ,女 ,广西桂林人 ,广西师范大学硕士研究生 ;唐绍清 ( 1965— ) ,男 ,广西恭城人 ,广西师范大
学教授 ,博士 .
罗汉果 ISSR-PCR反应体系的建立
周俊亚 ,宾晓芸 ,彭云滔 ,唐绍清
(广西师范大学 生命科学学院 ,广西 桂林 541004)
摘　要: 以罗汉果 ( Siraitia grosvenorii ) DNA为材料 ,分析了模板 DN A, Mg2+ , dN TPs,引物的浓度 , Taq DNA
聚合酶的用量以及循环次数对 ISSR-PCR扩增结果的影响 ,确立了稳定的、可重复的罗汉果 ISSR最佳反应
体系和 PCR扩增参数: 在 25μL的 PCR反应体系中 ,含 20～ 50 ng模板 DNA, 1U Taq酶 , 1× PCR缓冲液 ,
2. 0 mmol /L MgCl2 , 4种 dN TPs各 200μmol /L, 0. 5μmo l /L引物 ; PCR扩增程序为 94°C预变性 3 min,接着
进行 40个循环: 94°C变性 1 min, 52°C退火 50 s, 72°C延伸 2 min,循环结束后 72°C延伸 7 min.
关键词: 生物化学 ;罗汉果 ; I SSR;反应体系 ;遗传多样性
中图分类号: Q503　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-6600( 2004) 03-0081-04
简单序列重复区间 ( inter-simple sequence repeat , ISSR) DN A标记技术是由 Zietkiewicz[ 1]等于 1994
年创建的 ,是在 SSR标记基础上发展起来的一种新技术 . ISSR技术利用在植物基因组中常出现的 SSR本
身设计引物 ,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行 PCR扩增 .由于 SSR在真
核生物中分布非常普遍 ,且串联重复的数目是可变的呈现高度多态性 [ 2] ,因而 ISSR-PCR可以检测基因组
中丰富的遗传变异 .目前 ISSR技术己用于植物品种鉴定 [3, 4 ]、遗传作图 [5, 6 ]、遗传多样性 [7～ 9 ]和居群遗传
学 [10 ]等研究中 .
罗汉果 ( Sirait ia grosvenorii ( Sw ingle) C Jef f rer ex A M Lu et Z Y Zhang )是单性、雌雄异株的葫芦
科 ( Cucurbi taceae)植物 ,系广西著名特产之一 ,盛产于桂林北部的永福县和临桂县 .罗汉果中所含的甜度
极高的甜味物质是一种低热量的理想天然甜味剂 [11 ] ,是肥胖症、糖尿病患者理想的糖替代品 .它的果实还
是传统中药 ,用于治疗支气管炎、急慢性咽喉炎、哮喘和感冒等 [12 ] .
ISSR技术也是基于 PCR的一种分子标记 ,所以其扩增反应如同 RAPD一样受反应成分和 PCR程
序的影响 [2 ] ,如模板 DNA, Mg2+ , dN T Ps,引物的浓度 , Taq DN A聚合酶的用量以及循环次数等都会影响
ISSR的稳定性和重复性 .本文以罗汉果为研究材料 ,对各因素的最佳反应条件进行筛选 ,获得了背景清
晰、可重复的扩增条带图谱 ,建立了适合罗汉果的 ISSR反应体系 ,目的在于利用 ISSR标记技术研究罗汉
果的遗传多样性 ,为罗汉果种质资源的保护和利用提供科学的依据 .
1　材料与方法
1. 1　材料
实验材料罗汉果 ( Sirait ia grosvenori i )采自广西永福县龙江乡驿马村 .样品为雄株 ,采用 CT AB法 [ 13]
提取罗汉果叶的总 DNA.
1. 2　 PCR反应与产物检测
PCR扩增反应在 UNOⅡ 48型扩增仪上进行 .初始反应条件: 在 25μL反应体系中 , 50 ng模板 DNA,
1U Taq酶 , 1× PCR缓冲液 , 2. 0 mmo l /L MgCl2 , 4种 dN TPs各 200μmol /L, 0. 5μmol /L引物 ;扩增程
序:模板 94°C预变性 3 min,接着进行 40个循环: 94°C变性 1 min, 52°C退火 50 s, 72°C延伸 2 min,循
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2004. 03. 018
环结束后 72°C延伸 7 min.扩增产物在 1. 5%的琼脂糖凝胶中电泳 ,用 Lambda DN A /EcoRⅠ + HindⅢ
Marker作为标准相对分子质量对照 ,溴化乙锭 ( EB)染色 ,复日 FR-980凝胶成像仪上观察照相、记录 .
1. 3　 ISSR反应条件优化
为了确定最佳的罗汉果基因组 DNA的扩增条件 ,我们使用引物 UBC891,对 ISSR的影响因素 (模板
DNA, Mg
2+ , dN T Ps,引物浓度 , Taq酶用量及循环次数 )逐个作浓度梯度 ,进行了试验研究 ,各反应参数
表 1　 ISSR反应体系优化设计
项　目 反应参数
模板 DNA /( mg· L- 1 ) 0. 8 2. 0 3. 2 4. 8
镁离子 /( mmol· L- 1 ) 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0
4种脱氧核糖核酸 /(μmo l· L- 1 ) 100 150 200 250 300
引物 /(μmo l· L- 1 ) 0. 1 0. 3 0. 5 0. 8 1. 0
Taq DN A聚合酶 /U 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0
循环次数 30 35 40 45
　
变化量见表 1. ISSR反应体系优化时 ,固定其他条
件 ,每次改变 1个参数 ,以确定该参数对 ISSR结果
的影响 .实验所用引物 ,由上海生物工程公司合成 ,
引物序列参照加拿大哥伦比亚大学 ( UBC)公布的
第 9套 ISSR引物序列 . Mg2+ , 10× PCR缓冲液 ,
dN TPs和 Taq酶均购自上海生物工程公司 .
2　结果与讨论
2. 1　模板 DNA浓度的确定
最佳的模板浓度范围取决于研究物种和模板纯度 .在 DNA模板不纯的情况下 ,宁可使用有效浓度范
围内的最低限度 ,使抑制 Taq DN A聚合酶活性的影响降到最小 [14 ] .在其他条件不变的情况下 ,比较了模
板浓度的差异对 ISSR扩增结果的影响 .从图 1可以看出:模板浓度为 0. 8～ 4. 8 mg /L时 ,均能获得清晰
可辨、样式相同的带型 ,说明罗汉果的 ISSR反应对模板 DNA含量的许可范围较大 .在 25μL反应体系
中 ,使用 20～ 50 ng的模板量 ( 0. 8～ 2. 0 mg /L)即可满足扩增要求 .
图 1　模板 DNA浓度对 I SSR扩增的影响　　　　　图 2　 Mg2+ 浓度和 dN TPs浓度对 ISSR扩增的影响
M: DN A标准相对分子质量 M: DN A标准相对分子质量
( Lambda DN A/Eco RⅠ + HindⅢ Marker) ( Lambda DN A /EcoRⅠ + HindⅢ Marker)
1～ 4: DN A浓度分别为 0. 8, 2. 0, 3. 2, 4. 8 mg /L 1～ 5: Mg2+ 浓度分别为 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0 mmol /L
6～ 10: dN TPs浓度分别为 100, 150, 200, 250, 300μmol /L
2. 2　Mg2+ 浓度
Mg
2+ 浓度是制约 PCR结果的重要因素之一 . Taq DN A聚合酶需 Mg2+ 激活 ,对其浓度非常敏感 ;引
物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响 [2 ] ,所以需确定扩增反应的最佳 Mg2+ 浓
度 .实验设计了 5个浓度梯度 ,结果表明 (图 2): Mg2+ 浓度为 1. 0 mmol /L时 ,仅产生一些小的非特异性片
断 , M g2+浓度过低会导致 ISSR扩增无法正常进行 ;而浓度为 1. 5 mmol /L时 ,能产生清晰的扩增带 ,但是
大小在 1 100 bp左右的扩增带很弱 .当 Mg2+浓度在 2. 0～ 3. 0 mmol /L时都扩增出了清晰的带 ,但在重复
性实验中 2. 5和 3. 0 mmol /L的条带稳定性不及 2. 0 mmol /L,且高浓度的 Mg2+会使引物的错配频率增
加 ,影响扩增的特异性 [15 ] ,因此选择 2. 0 mmol /L的 Mg2+浓度作为罗汉果的 ISSR分析的最佳浓度 .
2. 3　 dNTPs浓度
dN TPs是 PCR的原料 ,常用 100～ 200μmol /L.浓度过低会导致扩增带产率低 ,而过高会产生错误掺
入 .从图 2可以看出在各 dN TPs浓度下 ,都能扩增出一致的条带 ,但浓度为 300μmo l /L时大小在 1 100
bp左右的扩增带不能进行有效的扩增 ,反而变弱 ,说明高浓度的 dN TPs会抑制相对分子质量相对较大的
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条带扩增 .考虑到反应的稳定性与可重复性 , 200μmol /L的 dN T Ps浓度较合适 .
2. 4　引物浓度
引物浓度关系到扩增产物的质量 ,浓度太低不能进行有效的扩增 ,浓度太高会增加引物二聚体的形
成 [14 ] ,导致条带不稳定及清晰度下降 .根据 Weising和 Nybom等确认的引物浓度范围 ( 0. 1～ 2. 0μmol /
L )
[2 ]
,实验设置了 5个浓度梯度 ,比较对 ISSR扩增结果的影响 .结果表明 (图 3):随着引物浓度升高 ,扩增
带由弱到强 ,当达到 1. 0μmo l /L时 ,条带的清晰度下降 .模板与引物浓度的比例还关系到可重复性问题 .
在重复实验中 ,引物浓度为 0. 5μmol /L时 ,反应稳定 ,条带清晰 ,故确定 0. 5μmo l /L为 ISSR反应的引物
浓度 .
图 3　引物浓度对 ISSR扩增的影响　　　　　图 4　 Taq DN A聚合酶含量和循环次数对 ISSR扩增的影响
M: DN A标准相对分子质量 M: DNA标准相对分子质量
( Lambda DN A /Eco RⅠ + HindⅢ Marker) ( Lambda DNA /Eco RⅠ + HindⅢ Mark er)
1～ 5:引物浓度分别为 0. 1, 0. 3, 0. 5, 0. 8, 1. 0μmol /L 1～ 4: Taq DN A聚合酶含量分别为 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0 U
5～ 8:循环次数分别为 30, 35, 40, 45
2. 5　 Taq DNA聚合酶含量
酶的用量也直接关系到实验结果 ,量多不仅增加实验成本 ,而且容易产生非特异性扩增产物 ,量少则
会使酶过早地消耗完 ,产物合成效率低 .在 25μL的反应体系中 ,分别使用 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0 U的结果表
明 (图 4): 4个浓度 Taq DN A聚合酶含量都能得到一致的扩增结果 .只是当酶的用量为 0. 5 U时 ,扩增条
带显得较弱 ;加大酶用量至 2. 0 U时 ,条带明显增强 ,但清晰度不及用量为 1. 0 U和 1. 5 U时的扩增条
带 .考虑到条带的强弱与清晰度及节约实验经费 ,确定 1. 0 U为 ISSR反应体系中 Taq DN A聚合酶的用
量 .
2. 6　循环次数对 ISSR结果的影响
选择适宜的循环次数将会获得良好的扩增图谱 .从理论上说 ,循环次数越多 ,扩增产物产率越高 .但实
际上会受到各反应成分的用量限制 .在原来反应程序的基础上 ,其他条件不变 ,分别试验了 30, 35, 40, 45
个循环对扩增结果的影响 .从图 4可以看出: 随着循环次数增加 ,扩增产物的量也增多 .相比之下 , 40个循
环得到的条带强弱合适 ,清晰可辨 ,为最佳循环次数 .
3　结论
ISSR技术具有 DNA用量少 ,检测方便、费用低廉等优点 ,且由于引物较长 ( 16～ 18个碱基序列 )和锚
定碱基的耙定作用 ,因此退火温度较高 (在 52°C左右 ) ,保证了扩增实验的可重复性 ,具有很好的稳定性
和多态性 [3, 16, 17 ] .
本实验选择 52°C为退火温度 .经过对反应成分和程序的优化固定 ,建立了反应稳定、重复性好的
ISSR反应体系 .在 25μL的 PCR反应液内含: 20～ 50 ng模板 DNA, 1U Taq酶 , 1× PCR缓冲液 , 2. 0
mmol /L Mg Cl2 , 4种 dN T Ps各 200μmo l /L, 0. 5μmol /L引物 . PCR扩增程序: 94°C预变性 3 min,接着
进行 40个循环: 94°C变性 1 min, 52°C退火 50 s, 72°C延伸 2 min,循环结束后 72°C延伸 7 min.采用这
一反应体系 ,从 69个 ISSR引物中共筛选出 13个扩增条带清晰、多态性高、背景清晰、反应稳定的引物用
于正式的罗汉果 ISSR分析 .
83第 3期　　　　　　　　　　　　　 周俊亚等: 罗汉果 ISSR-PCR反应体系的建立　　　　　　　　　　　　　
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ESTABLISHM EN T OF ISSR-PCR SYSTEM IN LUOHANGUO
( S IRAI T IA GROSVENORI I )
ZHOU Jun-ya, BIN Xiao-yun, PENG Yun-tao, TANG Shao-qing
( Colleg e of Life Sciences, Guangxi No rmal Unive rsity , Guilin 541004, China )
Abstract: In this paper , the influencing facto rs o f inter-simple sequence repea t ( ISSR) w ere analyzed by
using genomic DN A of Luohanguo ( Siraitia grosvenorii ) . By adjusting the concentration o f template
DN A, M g2+ , dN TPs and primer, the contents of Taq DN A polymerase and the number o f cy cles, the
stable and reproducible optimum reaction system of ISSR-PCR amplification and PCR ampli fication
parameters were established fo r Luohanguo. The optimal system w as in 25 μL reaction volume
containing 20～ 50 ng templa te DN A, 1 U Taq polymerase, 1× PCR Buffer, 2. 0 mmo l /L MgCl2 , 200
μmo l /L dN T Ps and 0. 5 μmmo l /L primer. The amplification prog ram was af ter 1 cycle ini tial
denatura tion a t 94°C for 3min, each 40 cycles consisted of 94°C 1 min, 52°C 50 s, 72°C 2 min, then final
ex tension w as at 72°C fo r 7 min.
Key words: bio chemistry; Siraitia grosvenorii ; ISSR; reaction system; g enetic div ersity
(责任编辑　马殷华 )
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