全 文 ：海洋科学/2003年/第 27卷/第 2期32
研究报告REPORTS
节旋藻(螺旋藻)高分子量 DNA 的两种制备方法 *
茅云翔 张宝红 杨官品 张学成
(青岛海洋大学海洋生命学院 青岛 266003)
提要 DNA的简便高效制备方法是研究基因结构 、功能及开展其它各项研究的基础 。首次
报道了针对节旋藻的结构和组成特性而建立的制备节旋藻高分子量 DNA的两种方法 。其中第
一个方法是常规方法 , 可大量提取纯度较高 、分子量达 50 kb的节旋藻 DNA , 可用于构建节旋
藻质粒文库 、Southern杂交和 PCR操作等;第 2种方法是用脉冲电场凝胶电泳分离 DNA片段 ,
制备的 DNA 片段达数百 kb ,可用于构建节旋藻噬菌体文库 、粘粒文库 、BAC文库等 ,从而为构
建节旋藻物理图谱 ,定位克隆基因奠定基础 。
关键词 节旋藻(Arthrospira),高分子量 DNA ,脉冲场凝胶电泳
中图分类号 Q949.22 +1 文献标识码 A 文章编号 1000-3096(2003)02-0032-05
*国家 863计划资助项目(819-06-10)
第一作者:茅云翔 , 出生于 1967年 , 博士 , 讲师 , 研究方向:
藻类分子生物学及基因工程。E-mail:maoyunxiang@yahoo.
com.cn
收稿日期:2001-03-23;修回日期:2001-08-20
节旋藻 (Arthrospira , 又常被称作螺旋藻 Spiruli-
na), 是原核丝状蓝藻 ,由于其所蕴涵的高品质营养成
分而成为一类具有重要经济价值的微藻 [1 ] 。目前 , 节
旋藻的分子遗传学 、基因组学 、基因工程和遗传育
种 [2 ]研究已成为微藻研究领域的热点之一 。高纯度 、
高分子量 DNA的简便高效制备方法是开展各项研究
的基础 , 但节旋藻自身结构和成分上的特性给高纯度
DNA 的高效分离造成了一些困难 。节旋藻外被胶质
鞘 ,使其可耐受高浓度溶菌酶 、冻融裂解 、煮沸裂解等
处理;同时节旋藻含有丰富的蛋白质、多糖和多种色
素 , 并具有非常高的核酸酶活性 ,在 DNA制备过程中
这些成分不仅会干扰所提取 DNA的纯度 , 而且还易
使 DNA 被核酸酶降解 。
目前 , 节旋藻 DNA 的制备方法可分为两类:一类
是采用提取细菌基因组 DNA的方法 ,如 Riccardi等在
克隆节旋藻谷氨酰胺合成酶 (glutamine synthe tase)基
因的研究中所采用的 DNA 提取办法即是根据 Mar-
mur[ 3]所建立的从微生物中分离 DNA的流程;Kawata
等 [ 4 ,5 ]则直接使用了商品化的细菌基因组 DNA提取
试剂盒(Wizard Genomic DNA purificaition kit)来制备
节旋藻 DNA , 并用于构建节旋藻 TA载体基因文库 。
此类方法一般首先用表面活性剂或超声破碎 、冻融法
等物理手段裂解细胞 , 再用酚 、氯仿等使蛋白变性以
纯化 DNA 。由于其操作流程和试剂配伍未针对节旋藻
的结构和组成特性 , 往往提取效率较低且 DNA纯度
难以保证 。另一类方法则是沿用Williams制备集胞藻
(Synechocystis)DNA 的方法及其改进方法 [6 ] ,但此类方
法采用 CsCl密度梯度离心来纯化 DNA , 操作比较复
杂 ,花费较大;这两类方法提取的 DNA分子量一般为
20 ～ 50 kb 。近年来 ,随着基因组学的兴起 ,构建细菌人
工染色体(Bacterial Artificial Chromosome , BAC)或酵母
人工染色体(Yeast Artificial Chromosome ,YAC)文库 、绘
制大尺度物理图谱和染色体步查等工作要求制备更
大分子量 , 甚至Mb级的基因组 DNA , 但目前在节旋
藻中 ,甚至在蓝藻中尚未见相关的研究报道 。
本研究针对节旋藻结构和组成的特性 , 报道了制
备节旋藻大分子量 DNA的两种方法 , 其中第一个方
法是常规方法 , 是对 Sahgai-Maroof [7 ]等建立的十六烷
基三甲基溴化铵 (CTAB)提取方法的改进 , 可大量提
取纯度较高 、分子量达 50 kb的节旋藻 DNA , 可用于
构建质粒文库、 Southern杂交和 PCR操作等;第二种
方法则是以Schwartz和 Cantors [8 ]发明的脉冲场凝胶电
泳技术为基础 , 将节旋藻细胞用琼脂糖包埋后原位裂
解 、消化蛋白质 、限制性酶切 ,然后用脉冲场凝胶电泳
仪分离 DNA片段 , 可用于构建(噬菌体文库 、粘粒文
库 、BAC文库等 ,从而为构建节旋藻基因组物理图谱 ,
定位克隆基因等研究奠定基础 。★R
M arine Sciences/Vol.27 , No.2/2003 33
1 材料与方法
1.1 材料
处于对数生长中期 (OD560=0.8)的钝顶节旋藻
(Arthrospira platensis)S6品系经筛绢过滤收集 , 并用灭
菌双蒸水冲洗 2～ 3次后备用。用常规方法提取 DNA
时 , 新鲜或冷冻材料均可;而用包埋方法制备 DNA时
须用新鲜材料 。
1.2 缓冲液
1.2.1 常规提取方法中所使用的缓冲溶液
CTAB提取缓冲液[ 2%(W/V)CTAB;1.4 mol/L
NaCl;50 mmol/L EDTA(pH8.0);100 mmol/L Tris-HCl
(pH8.0);2% (体积分数)β-巯基乙醇 (使用前加
入)] ;
CTAB沉淀缓冲液[ 1%(W/V)CTAB;50 mmol/L
EDTA(pH8.0);50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)] 。
1.2.2 琼脂糖包埋法所使用的缓冲液
外鞘洗脱液 [ 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.0),
1.5 mol/L NaCl]
高渗保护液 [ 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 0.2
mol/L EDTA , 1 mol/L NaCl]
细胞裂解液 [ 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 0.2
mol/L EDTA(pH8.0), 1 mol/L NaCl , 0.5%十二烷基
肌氨酸钠 , 1 g/L溶菌酶 , 1%β-巯基乙醇]
蛋白消化液 [ 0.5 mol/L EDTA(pH9.0), 0.5%十
二烷基肌氨酸钠 , 1 g/L蛋白酶 K , 1%β-巯基乙醇]
1.3 DNA的制备流程
1.3.1 常规方法制备节旋藻 DNA
取 1 g藻丝体液氮冷冻 15 min ,取出后液氮研磨 ,
过程中加入 0.1 g 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP), 磨碎的藻
粉转入已预热至 65℃的含 10 mL CTAB提取缓冲液的
离心管中 ,搅拌混合均匀 , 65℃水浴保温 60min;将水
浴温度降至 50℃, 加入 RNaseA至终浓度 50μg/mL ,
继续温育 30 min;加入蛋白酶K至终浓度 200μg/mL ,
继续温育 90 min。温育过程中隔 15 min混匀 1次 。待
溶液冷却至室温后 , 加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶
1),轻柔地颠倒混匀 20 min ,变性并抽提蛋白质;室温
下 10 000 r/min(12 000 g)离心 10 min ,上清液转入另
一离心管中;重复抽提 2 ～ 3次 ,至有机相和水相之间
无变性的蛋白质 。在上清液中加入等体积的 CTAB沉
淀缓冲液 ,轻缓颠倒混合 ,可见白色絮状物质 ,室温放
置 30min以上至过夜;用玻棒缠绕白色絮状物质将其
挑出后溶解于 5 mL 1mol/L NaCl溶液中;加入两倍体
积的无水乙醇 , 轻柔混匀后可见透明絮状的 DNA , 室
温静置 30 min以上;用玻棒缠绕挑出 DNA , 在 5 mL
75%乙醇中浸洗除盐 , 沥干乙醇 , 最后溶于 1 mL T10
E0 .1(10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 0.1 mmol/L EDTA
(pH 8.0))缓冲液 。
1.3.2 琼脂糖包埋法制备节旋藻大分子量
DNA
筛绢过滤约 10 mL节旋藻培养液收集藻丝 , 用外
鞘洗脱液冲洗藻丝体两次;将藻丝体重悬于 20 mL的
外鞘洗脱液中 , 30℃下 60 r/min振荡 60 min;再次过
滤收集藻丝 , 用高渗保护液洗涤两次;用 1 mL高渗保
护液重悬藻丝 , 使密度达到约 109细胞/mL , 45℃温
育;与等体积 1.6%的低熔点胶(用高渗保护液配制)
混匀后 ,注入 Bio-RAD CHEF MapperTM 的凝胶块型模(6
mm×1.5mm×10 mm)中 , 0 ～ 4℃固化 30 min;将固化
的琼脂糖块置于 20倍体积的裂解缓冲液中 , 于 37℃
轻柔振荡温育 24 h;将琼脂糖块转入 10倍体积的蛋
白消化液中 , 于 50℃温育 48 h消化蛋白质 ,中间更换
一次消化液;将含有大分子量 DNA的凝胶块放于 40
倍体积的含 1 mmol/L PMSF的 TE中 ,50℃温育 1 h以
灭活蛋白酶 K;然后于 40倍体积的 TE缓冲液中漂洗
两次 。凝胶块在 40倍体积的 0.05 mol/L的 EDTA
(pH8.0)溶液中于 4℃可储存半年以上 。
1.4 DNA纯度及含量测定
常规方法提取的 DNA可用紫外分光光度计测定
DNA溶液在波长为 260 nm处的光吸收值 , 从而计算
出 DNA量;同时测定 230 nm和 280 nm处的光吸收
值 , 并通过计算 OD260/OD280和 OD260/OD230的值来判
断纯度 。
对于包埋于凝胶块中的大分子量 DNA用下述方
法判断含量:一系列标准浓度的λDNA用琼脂糖包埋
制成浓度为 0.8%的凝胶块 , 将样品与λDNA标准同
时用 EB染色 , 紫外灯下通过比较样品和标准的荧光
强度估计 DNA含量 。
1.5 DNA的限制性内切酶消化与电泳
共选用 13种限制性内切酶(图 1)对常规方法制
备的 DNA进行酶切实验 ,限制酶的用量均为 10 U/μg
DNA;酶切温度除 Sma I为 30℃外 ,其余皆是 37℃;消
化时间为 1 h。酶切产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分
离 ,电泳缓冲液为 1×TAE ,电压为 4 V/cm。
包埋于琼脂糖凝胶中的大分子量 DNA进行限制
性酶切之前 , 要先将凝胶块放入 10倍体积 TE溶液中
研究报告 REPORTS
海洋科学/2003年/第 27卷/第 2期34
图 1 常规方法制备 DNA 及限制性酶切电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis of genom ic DNA treated by
res trict ion enzy mes
1.BamH I;2.Cla I;3.EcoR I;4.Hind III;5.Hpa II;
6.Mbo I;7.Nco I;8.Nde I;9.Pst I;10.Pvu I;11.Sau3A
I;12.Sst I;13.Xba I;14.High Weight M olecular DNA ;15.
λDNA/EcoR I + Hind III
室温洗涤 4次 , 每次 30 min;再用 10倍体积 T10E0 .1浸
泡 1 h;然后置于 2倍体积的 1×酶切反应缓冲液中 ,
4℃平衡 3 h ,重复 3次;然后每块凝胶加入 0.3mL冰
冷的含有限制性内切酶的酶切缓冲液 , 冰浴放置 1 h
后于适宜温度下消化 。对于进行完全酶切的 DNA样
品 , 限制酶的用量为 5U/μg DNA , 酶切 4 h以上至过
夜;而部分酶切的条件需预实验确定 , 消化时间均设
为 1 h ,限制酶的用量分别为 1U、2U、4U 、8U和 16U。最
后加入 1/10体积的 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)终止反
应 。本实验使用 Bio-Rad公司的 CHEF Mapper脉冲电
场凝胶电泳仪进行大分子量 DNA电泳分离 。电泳前
凝胶块在 50倍体积的 TE溶液中于 4℃浸泡 1 h ,取出
后塞入点样孔并用熔化的琼脂糖封住 。对未经酶切的
大分子量 DNA , 电泳条件为:0.6%Chromosomal Grade
琼脂糖凝胶 , 1×TAE , 14℃, Block 1:2 V/cm , 106°,脉
冲交变时间 20 ～ 40.4 min , 线形递增 , 脉冲时间为
19.3 h;Block 2:6V/cm , 120°, 脉冲交变时间 133.51
～ 136.25 s ,线形递增 ,脉冲时间为 9.4 h。经限制性内
切酶消化后的脉冲电泳条件为:0.8%PFC 琼脂糖凝
胶 , 1×TAE , 14℃ , 6 V/cm , 120°, 脉冲交变时间 0.33
～ 31.57 s ,线形递增 ,脉冲时间为 10.35 h 。
2 结果和讨论
2.1 提高节旋藻 DNA得率的措施
节旋藻藻丝表面结构的最外层是多糖成分的胶
质鞘(Sheath),其内侧是肽聚糖成分的细胞壁 ,再向内
是包被着原生质的细胞膜 ,其中胶质鞘在维持藻丝形
态 、保护内部细胞等方面发挥着重要作用。Robinson等
发现具胶质鞘的节旋藻细胞可耐受浓度达 2 mg/mL
溶菌酶的处理;另外 , 我们也曾尝试采用反复冻融或
煮沸裂解的方式来破碎节旋藻细胞 , 但发现即使在
SDS或 CTAB等表面活性剂存在的情况下 , 细胞裂解
程度也十分有限 。因此为提高 DNA得率 ,在本实验的
两种 DNA制备方案中分别采取了两种不同的细胞破
碎方法:常规法提取节旋藻 DNA 时采用液氮冷冻研
磨的物理破碎方法;而包埋法制备大分子量 DNA时 ,
根据 Robinson等用 KCl 和 EDTA 溶液洗鞘制备节旋
藻原生质体的方法 , 先用适当浓度的 NaCl溶液洗涤
藻丝除去胶鞘 , 包埋后再用溶菌酶和 CTAB破壁 、破
膜 。结果表明这两种方法均可较彻底地裂解节旋藻细
胞 ,从而有效地提高 DNA得率 。本实验中采用常规制
备方案进行了 3次提取实验 , 从每克鲜藻中提取的
DNA量分别为 161μg 、188μg和 143μg , DNA平均得
率为 164μg/g鲜藻 。在包埋法制备 DNA 实验中 ,凝胶
块最初为深墨绿色 , 经过一系列提取步骤后胶块基本
透明 , 色素完全溶出 , 表明胶质鞘洗脱后细胞裂解彻
底 ,凝胶块中的 DNA已基本游离 。本实验中 , 我们用
10 mL藻液制备了 10块凝胶块 , 每一凝胶块中含有
1.5 ～ 2μg DNA 。
2.2 DNA降解的防护与 DNA纯化
节旋藻不存在核膜 , 细胞壁和细胞膜破裂即意味
着胞内的核酸物质将直接受到外界环境的影响 。由于
节旋藻具有很高的胞内和胞外核酸酶活性 ,因此破膜
后 DNA的有效保护 , 是成功获得大分子 DNA的关键
之一 。同时 ,节旋藻成分较为复杂:富含蛋白质 ,可达
干质量的 70%;含有多种多糖成分;节旋藻的色素是
由藻胆蛋白和叶绿素等组成 ,成分多样 。这些成分是
否能得到有效去除 , 将直接影响到后续的 DNA 操
作 。
针对节旋藻胞内 、胞外核酸酶活性高这一特性 ,
我们采用了洗涤藻丝或洗脱胶质鞘来降低胞外核酸
酶活性 , 在抑制核酸酶活性的温度下(如液氮下研磨
及 65℃温育裂解)进行操作 , 以及适当提高溶液中
EDTA浓度(50 ～ 500 mmol/L)以螯合核酸酶发挥活性
必需的二价金属离子等措施 。鉴于 EDTA浓度的提高
以及节旋藻自身蛋白质含量丰富 ,在实验方案中我们
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图 2 琼脂糖包埋方法制备 DNA 及限制性酶切电泳图谱
Fi g.2 Hi gh molecular weight(HMW)DNAs and its pa rti al
dig estion.
1. Lambda DNA ladder;2.HMW DNA;3.2.0 uni t;4.
4.0 uni t;5.8.0 unit.
使用了较高浓度的 Proteinase K ,这有利于较彻底地消
化蛋白质 。节旋藻细胞内色素含量高且成分多样 , β-
巯基乙醇被用做还原剂以防止这些多酚类物质被氧
化为醌类 , 其用量也较高;同时还使用了聚乙烯吡咯
烷酮来去除多酚类物质 。作为表面活性剂的 CTAB在
本实验中一方面被用做裂解细胞膜 ,另一方面在适当
的离子强度下 CATB可与 DNA形成沉淀复合物 ,从而
将 DNA 与节旋藻中大量的多糖成分分离 。
2.3 常规方法制备的 DNA分子量与纯度
常规方案制备 DNA 的电泳结果表明其分子量约
50 kb(图 1)。纯度检测分别采用比色法和酶切验证 。
测定了三次提取实验得到的 DNA 样品的在 OD 230 、
OD260和 OD280值 , OD 260/OD280的均值为 1.83 , 而
OD260/OD230 3次平均值为 1.96 ,说明所制备 DNA纯度
较高;限制性酶切验证 DNA纯度实验选用了 13种限
制性内切酶 , 其中 3种酶识别位点为 4个碱基 , 其余
为 6个碱基 。完全酶切结果表明所制备的 DNA对所
选用的 13种限制性内切酶均十分敏感(图 1)。
2.4 包埋法制备 DNA的部分酶切
不论是构建 BAC或 YAC文库还是脉冲电场凝胶
电泳进行基因分型研究 ,重复性良好的酶切可用于验
证所制备 DNA的质量 。图 2是包埋于琼脂糖凝胶中
的节旋藻高分子量 DNA 用不同量的限制性内切酶
BamH I消化 1 h电泳结果示意图 。其中未经过酶切
DNA(泳道 2)的分子量可达数百 kb ,而随着限制性酶
量的增加 , DNA降解程度上升 , 显示采用本方法制备
的包埋于琼脂糖凝胶中的 DNA具备良好的可酶切
性 。
另外 ,我们还将上述两种方法分别用于极大节旋
藻(A.maxima)、颤藻(Oscillatoria sp.)和盐泽螺旋藻
(Spirulina subsulsa)高分子量 DNA的制备 , 均取得了
较好的效果(实验数据未显示),表明本文所描述的两
种 DNA 制备方法对其它丝状蓝藻也有一定的适用
性 。
参考文献
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海洋科学/2003年/第 27卷/第 2期36
TWO PROCOTOLS FOR PREPARATION OF HIGH MOLE-
CULAR WEIGHT DNA FROM Arthrospira
(Spirulina)
MAO Yun-Xiang ZHANG Bao-Hong YANG Guan-Pin ZHANG Xue-Cheng
(College of Marine Life Sciences , Ocean University of Qingdao , Qingdao , 266003)
Received:Mar., 23, 2001
KeyWords:Arthrospira, Highmolecular weightDNA , Pulse fieldgelelectrophoresis
Abstract
Simple and high efficiency methods for DNA preparation are thebase for the moleculargenetics research.Here , for the first
time , two protocols were designed forpreparing the high weight molecular DNAfrom Arthrospira based on its structural and bio-
chemical characters.The first protocol can beused for routine and large-scale DNApreparation , by which themolecularweight of
DNA ismore than 50 kb.TheDNAof Arthrospira prepared by this protocol can beused for constructing plasmid library , Southern
blottingandPCRexperimenting.Bythesecondprotocol , largeDNAfragmentsoverseveral hundredofkilobasepairs canbeobtained
by thepulse field gel electrophoresis , which can be used for constructing (phage library , cosmid library and bacte rial arti-
ficial chromosome(BAC)library , and thereby for constructing physical map and positional clone gene of Arthrospira.
(本文编辑:张培新)
采用鲜活的饵料 ,如沙蚕 、牡蛎 、花蛤 、缢蛏 、鱿鱼或蟹
肉 。据报道 , 从亲虾池中氧气的消耗和氨氮的增加情
况来看 , 以沙蚕 、虾肉和蟹肉作比较 ,沙蚕产生的氨
氮最少 , 耗氧最低 , 蟹肉则产生的氨氮最多 , 耗氧最
高 [ 3 ] , 因此选择亲虾饵料以活的沙蚕最佳 。投喂性腺
饱满的饵料(如牡蛎)时 , 应去除生殖腺后投喂 , 以防
水质的污染 。投喂时应掌握好饵料的数量 , 既要足够
又不应投过量 , 以防增加亲虾池中有机质的含量 。同
时 , 也应讲究投饵的时间和方式 , 对亲虾比较不喜欢
吃的饵料 , 如贝肉 、鱿鱼等 , 应在清除喜欢吃的饵料
(如沙蚕)一段时间后再投 ,效果会更好 。定时清除亲虾池
中的残饵和粪便也是改善水质一个有力的措施。
此外 , 潮汐和气候的突然变化与亲虾蜕壳也有一
定关系 。据多年培育日本对虾亲虾的经验 , 亲虾的蜕
壳高峰常常出现在大潮后 ,这可能与大潮时水环境变
化激烈而刺激亲虾有关 ,还有 ,气候的突然变化 ,如大
风或暴雨 ,常引起亲虾摄食的下降 , 性腺发育受影响 ,
无性腺亲虾比例增加 ,也会增大亲虾的蜕壳率 。
3 小结
总之 , 影响日本对虾亲虾蜕壳的因素除了外在因
子———温度 、盐度 、水质 、饵料 、换水 、潮汐和气候外 ,
还应考虑到内在因子的影响 ,如亲虾培育时间所引起
的生理变化 , 性腺发育程度以及蜕壳激素分泌水平
等 , 因此要降低日本对虾亲虾的蜕壳率 , 延长亲虾蜕
壳的间隔时间 , 促进亲虾的性腺发育 , 应对亲虾进行
催熟手术 , 以降低性腺抑制激素的分泌水平 , 同时应
该改善培育亲虾的水质 , 保证亲虾优质的饵料 , 防止
培育亲虾水环境温 、盐等环境因子的激烈变化 , 换水
时应注意保持温度和盐度与原池水一致 ,并掌握好换
水方式和换水量 , 减少对亲虾的刺激 , 以达到降低日
本对虾亲虾蜕壳率 ,提高其亲虾利用率的目的 。
参考文献
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(上接第 31页)
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