全 文 ：螺旋藻别藻蓝蛋白的纯化 、 理化特性与结晶*
张少斌1　刘　慧1　刘国琴 2　商树田 2
(沈阳农业大学生物科学技术学院　沈阳　110161)1
(中国农业大学植物生理学与生物化学国家重点实验室　北京　100094)2
　*辽宁省教育厅项目 (No. 20040331)
沈阳农业大学青年教师基金 (No. 200401)
通讯作者　Tel: 13190048145, E-m ail: zsb20022001@yahoo. com. cn
收稿日期: 2005-12-12, 修回日期: 2006-02-23
摘要:硫酸铵分级沉淀结合多种层析技术 , 从螺旋藻 (SP-Dz) 中纯化到电泳纯别藻蓝蛋
白 (A llophycocyanin, APC), 纯度 (A650 /A280)达 4.83。 APC在 30 m in内的荧光扫描曲线
为直线;30 m in连续光照其相对荧光强度仍为原来的 98%以上 , 其抗荧光淬灭能力强于同
样条件下的藻蓝蛋白 (PC)及荧光素 TRITC。用悬滴气相扩散法培养获得了 APC晶体。
关键词:钝顶螺旋藻 , 别藻蓝蛋白 , 光谱 , 晶体
中图分类号:Q94　　文献标识码:A　　文章编号:0253-2654 (2006) 05-0031-04
Purification, Physio-chem icalProperty and Crystallization
ofAPC from Spirulina
*
ZHANG Shao-Bin1　LIU Hu i1　LIU Guo-Qin2　SHANG Shu-Tian2
(B io log ica lScience and Technology Co llege, Shenyang Agricultura lUn iversity , Shenyang 110161)1
(S ta teK ey Labora tory of P lan tPhysiology and B iochem istry, China Agricu ltu ra lUniversi ty, Beijing 100094)2
Ab stract:APC of electrophoresis-purity w as ob tained from Spiru lina using ammon ium su lfate grade p recipitation
fo llow ed w ith several ge l ch rom atography, and the pu rity(A650 /A280) ofwh ich attained to 4.83. The fluorescence
scan curve of APC was a direct line in 30 m in;A fter exposed in ligh t for 30 m in, th e re lative fluorescence
strength of APC preserved above 98 percen tof that as begin. APC has a stronger an ti-fluorescence quench ing than
PC or TR ITC under the sam e condi tion. APC crystals were grown by hanging d rop vapor d iffu sionm ethod.
K ey words:Sp irulina p la tensis, A llophycocyan in, Spectrum, C rystal
别藻蓝蛋白是藻类藻胆体捕光色素复合蛋白之一 , 在螺旋藻中达干重的 7%以上 。
APC主要含 α和 β两种亚基 , 天然 APC以 (αβ)6的形式存在[ 1] 。根据光谱特性差异 ,
APC可分为多种类型 , 它们在藻胆体光能传递途径中处于不同位置 , 在藻类光合作用
中发挥着不同作用[ 2] 。 APC突出的荧光特性使其在荧光显微检测 , 临床诊断等方面应
用广泛 [ 3] 。APC还具有抗衰老 、 增强免疫力 、 抗肿瘤等重要生理活性 , 在食品和保健
品等领域用途广泛[ 4] 。钝顶螺旋藻的一个直线型突变株 (SP-Dz)具有生长快 、藻胆蛋
白含量高等优点 [ 5] 。本研究以此为材料 , 先用超声波法破碎藻体 、 硫酸铵分级沉淀和
多种层析手段配合使用 , 获得了电泳纯 、 能结晶的 APC , 并详细分析了其荧光稳定性 ,
为深入研究 APC的结构与功能 , 对开发利用螺旋藻都具有重要意义 。
1　材料与方法
1.1　实验材料与主要试剂
　　钝顶螺旋藻 (Spirulina platensis)突变株 (SP-D z)为本实验室保存 。 DEAE Sepha-
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rose Fast F low (DEFF)、 Sephacry l-300 (S-300)购自 Pharmacia;羟基磷灰石 (HAP)
购自 Merk;TRITC (四甲基异硫氰酸罗丹明 )标记的鬼笔环肽购自 S igma公司;其他
试剂为国产分析纯。
1.2　螺旋藻培养与别藻蓝蛋白纯化
按彭为民等 [ 5]的方法培养和收获螺旋藻。使用磷酸钠缓冲液 (5 mmo l /L Na2HPO 4-
N aH 2PO4 , pH 7.0, 含有 0.02 mmol /L PM SF, 0.1 mmo l /L EDTA , 0.4 mmo l /L N aN3 ,
2 mmo l /L β-巯基乙醇 )悬浮藻体 、 超声破碎 , 离心 (10,000×g, 30 m in)后的上清液
进行 20%50%饱和度硫酸铵分级沉淀 , 沉淀复溶离心后的上清液上层析柱。在 FPLC系
统下 , 依次上 S-300 ( 1.6 cm ×80 cm , 1.0 mL /m in)、 DEFF ( 1.6 cm ×10 cm ,
1.0mL /m in, 00.5mol /L NaC l)、 HAP (Υ1.6 cm ×5 cm , 0.5m l /m in, 5200mmo l /L磷
酸钠)和第 2次 S-300纯化 APC。
1.3　别藻蓝蛋白纯度测定与含量计算
以经验公式 APC (mg /mL) = [ A650-0.208 (A620)] /5.09计算 APC 含量 , 以
A650 /A280的值表示 APC的纯度 [ 6] , A650和 A280的值用 752紫外可见分光光度计测定。
1.4　别藻蓝蛋白光谱分析与晶体培养
用 UV640蛋白核酸分析仪扫描吸收光谱 , F-4500荧光分光光度计扫描荧光光谱 ,
荧光显微镜观察荧光淬灭 。室温避光条件下 , 用悬滴气相扩散法 [ 1]培养 APC晶体。
2　结果与讨论
2.1　别藻蓝蛋白的纯化
螺旋藻经超声波破碎 、 硫酸铵分级沉淀 , 将蛋白沉淀溶解后上 S-300层析柱 , 用
1 mmo l /L磷酸缓冲液洗脱 , 结果如图 1A所示 。取洗脱峰 2的溶液上 DEFF层析柱 , 取
蓝色洗脱峰溶液上 HAP层析柱 , 结果如图 1B所示 , 收集洗脱峰 2的溶液进行电泳鉴
定 、纯度测定和光谱分析 。传统 APC的纯化主要利用 HAP吸附层析法 , 或利用葡聚糖
凝胶过滤和 DEAE-纤维素柱层析法[ 3] 。用 S-300替代 G-200, 洗脱速度由 0.2 mL /m in
提高到 1.0mL /m in, 缩短了纯化周期。用 DEFF替代 DE-52, 使介质的再生简单易行 ,
适于连续大规模纯化 。本技术路线把纯化周期从传统的几天缩短在一天 , 降低了蛋白
降解变性的可能 , 提高了纯化效率 , 为开发利用 APC创造了良好条件。
2.2　别藻蓝蛋白的纯度及产量测定
蛋白的纯度及产量见表 1。 SP-Dz粗蛋白提取液中 APC含量高达干重的 9.8%, 随
着纯化步骤的进行 , 纯度逐渐提高 , 最高纯度可达 8以上。从 1克鲜螺旋藻 (干重 0.2
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克 )中可得到纯度值在 4.8以上的 APC 1.8mg, 这个纯度及产量远高于已有的报道 [ 5] 。
表 1　纯化过程中别藻蓝蛋白的纯度变化
纯化步骤 纯度 产率 (%) (干重)
上清液 0. 46 9. 80
硫酸铵分级沉淀 (20%50%饱和度) 0. 52 7. 80
S-300凝胶过滤 1. 44 1. 50
离子交换层析 2. 16 1. 30
羟基磷灰石层析 4. 83 0. 90
二次 S-300凝胶过滤 >8. 00 <0. 04
2.3　别藻蓝蛋白的电泳分析及等电聚焦
蛋白电泳结果见图 2, 纯化的 APC达到电泳纯。变性电泳 (图 2A)显示 , APC亚
基分子量 (α及 β )分别在 15 kD和 17 kD;活性电泳 (图 2B)分析表明 , APC天然分
子量在 220 kD左右;等电聚焦分析表明 , APC的等电点为 pH 4.9, 上述结果与已有报
道相似 [ 6] 。
2.4　别藻蓝蛋白的吸收光谱和荧光光谱
由图 3可见 , APC吸收光谱 (图 3, A)范围很宽 , 在 500 nm700 nm都有很强的
吸收 , 最大吸收峰在 616 nm , 它与 PC的区别在于它在 650 nm还有一个特征吸收峰 ,
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其较宽的吸收光谱范围有利于其在藻类光合作用中发挥作用 。由图 3B可见 , 荧光激发
光谱的范围也很宽 , 在 490 nm650 nm都能受到激发而产生荧光 , 最大激发波长在 650
nm , 此外在 622 nm还有一个激发峰 , 最大荧光发射波长在 658 nm , 为红色荧光 。激发
与发射光谱之间的距离可以达到 30 nm以上 , 这一特点有利于降低利用其荧光特性时
的背景 。
2.5　别藻蓝蛋白的荧光稳定性分析
在荧光分光光度计下 , 在 30 m in的扫描时间内 , 无论是绿光激发 (曲线 a)还是
蓝光激发 (曲线 b), APC的荧光扫描曲线均为一条直线 , 相对荧光强度在扫描过程中
变化很小 , 由此可见 , 纯化的 APC具有很好的荧光稳定性 (图 4)。在荧光显微镜下的
观察结果也证明了这一点 。设定起始相对荧光强度为 100%, 在蓝光或绿光连续激发
30 m in后 , APC的相对荧光强度变为原来的 99%和 98%, 其抗荧光淬灭能力不仅远高
于常用的荧光素 TRITC (相对荧光强度变为原来的 86%和 66%), 而且也高于 PC (相
对荧光强度变为原来的 92%和 81%)。上述特点使其不仅可以在荧光分光光度计下进
行定量荧光分析 , 也可用于荧光显微镜下长时间的动态荧光观察。 APC作为一种新兴
的荧光分子将具有广阔的应用前景 [ 7] 。
2.6　别藻蓝蛋白晶体培养
收集纯度值大于 8的 APC用于晶体培养 。获得的 APC晶体如图 5所示 , 这一结果
充分说明纯化的 APC不仅纯度高 , 而且保持着良好的天然结构状态 。钝顶螺旋藻 APC
的晶体结构虽已得到解析[ 1] , 但直线型钝顶螺旋藻突变株 (SP-Dz)的 APC结构是否
发生变化还不清楚 , 晶体培养的成功为其结构解析奠定了基础。
参 考 文 献
[ 1] Brejc K , Ficner R, H uber R, et a l. JM ol B io l, 1995, 249: 424440.
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