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〔2014-02-19 修回〕
(编辑 苑云杰)
赶黄草对大鼠酒精性脂肪肝的保护作用及机制
李国春 (泸州医学院附属中医医院静脉用药调配中心，四川 泸州 646000)
〔摘 要〕 目的 探讨赶黄草对大鼠酒精性脂肪肝的保护作用及机制。方法 随机选择 140 例大鼠，喂以 1. 5%的硫酸亚铁饲料进行饲养，并
进行灌胃乙醇制作酒精性脂肪肝大鼠模型。将所有大鼠随机分为正常对照组、模型组、赶黄草提取物高剂量、低剂量组、槲皮素高剂量、低剂量组、硫
普罗宁组共七组，用药大鼠均灌胃给药，1 次 /d，连用 6 w。计算肝脏系数，并行肝组织油红 O 染色，于光镜下观察肝脏脂肪浸润情况，对比肝细胞脂
滴面积，并检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)含量。结果 ①相比正常对照组，模型组大鼠反应迟钝，
体重明显减轻，肝脏指数明显增加(P＜0. 05) ;相比模型组，各用药组大鼠体重增加显著，肝脏指数明显下降(P＜0. 05)。②油红 O染色脂滴半定量分
析后显示，赶黄草提取物各剂量组同模型组比较均有明显差异(P＜0. 05)。③相比正常对照组，模型组血清 ALT、AST、TC、TG水平均增加(P＜0. 05) ;
相比模型组，各用药组血清 ALT、AST、TC、TG水平均降低(P＜0. 05) ;相比槲皮素各组，赶黄草各提取物组 ALT、AST、TC、TG 水平均降低(P＜0. 05)。
结论 赶黄草对大鼠酒精性脂肪肝有明显保护作用，与其中含有的槲皮素及其他化学成分有关。
〔关键词〕 赶黄草;酒精性脂肪肝;槲皮素
〔中图分类号〕 Ｒ57 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2015)14-3845-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2015. 14. 022
第一作者:李国春(1975-) ，女，硕士，主管药师，主要从事医院药学及临
床药学方面的研究。
酒精性脂肪肝是因酒精及其代谢产物导致的肝损害，已经
成为造成我国慢性脂肪肝发病的首要原因。赶黄草性平，味
苦、略辛，是经典苗族草药，有清热利湿、平肝健脾之功效，被普
遍用于各类肝炎、肝病的治疗〔1，2〕。本文研究赶黄草对大鼠酒
精性脂肪肝的干预作用和作用机制，旨在筛选治疗酒精性脂肪
肝的有效药物。
1 材料与方法
1. 1 材料 全自动生化分析仪和光学显微镜购自日本 Olym-
pus公司，药材赶黄草取自四川省广元市，并经本医学院两名教
授鉴定为正品;槲皮素购自本地生物技术有限公司，总胆固醇
(TC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸氨
基转移酶(AST)及无水乙醇均购自成都某生物技术有限公司。
选择 Wistar大鼠 140 只，均为母鼠，体重(205±18)g，由本医学
院动物实验中心提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 制备赶黄草提取物 用 8 倍的浓度为 95%的乙醇将赶
黄草提取 3 次，将提取液混合后减压并回收，干燥后获得提取
物，测得赶黄草提取物中的槲皮素含量约 1. 25%。
1. 2. 2 模型的复制、分组及给药 将 140 只大鼠随机分为七
组，每组 20 只。正常对照组、模型组，均予等容量生理盐水;硫
·5483·李国春 赶黄草对大鼠酒精性脂肪肝的保护作用及机制 第 14 期
普罗宁组予硫普罗宁 50 mg /kg;提取物低剂量组予赶黄草提取
物 2 000 mg /kg;提取物高剂量组予赶黄草提取物 4 000 mg /kg;
槲皮素低剂量组予槲皮素 25 mg /kg;槲皮素高剂量组予槲皮素
50 mg /kg。所有组别均给予含 1. 5%硫酸亚铁的颗粒饲料喂
养，并自由饮水及进食，于 24℃温度、75%湿度室内分笼饲养，
除正常对照组外，各组在适应性喂养结束后于每日上午 9 时肌
注 50%乙醇 8 g /kg，容量为 10 ml /kg;正常对照组予等量生理
盐水肌注。4 w后随机处死模型组 6 只，病理证实无肝脏脂肪
变，6 w后随机处死模型组 6 只，病理证实有肝脏脂肪变，此时
停止乙醇肌注。每日上午 9 时肌注相应药物，持续 6 w，对大鼠
食欲、行为、状态、毛发与死亡情况进行观察。实验结束前大鼠
禁食 12 h后处死，分离血清，取出肝脏称重并冰冻切片。
1. 2. 3 观察指标 计算肝脏系数，肝脏系数 =肝湿度 /体重×
100%，肝组织油红 O染色，光镜下观察肝脏脂肪浸润情况并对
肝细胞脂滴面积。采用全自动生化分析仪检测 ALT、AST、TC
及 TG含量。
1. 3 统计学方法 应用 SPSS13. 0 软件，计量资料比较采用 t
检验，计数资料比较采用 χ2 检验。
2 结 果
2. 1 赶黄草提取物对模型大鼠肝脏系数及体重的影响 正常
对照组大鼠毛色光滑，行动活跃，体重增长明显，其余各组大鼠
均出现食欲减退，行动减少，体重增长缓慢表现。相比正常对
照组，模型组大鼠反应迟钝，体重明显减轻，肝脏指数明显增加
(P＜0. 05) ，相比模型组，各用药组大鼠体重增加显著，肝脏指
数明显下降(P＜0. 05)。见表 1。
表 1 赶黄草提取物对模型大鼠肝脏系数、体重及
染色面积的影响(x±s，n=20)
组别 体重(g) 肝脏系数 染色面积(%)
正常对照组 313±14. 8 2. 41±0. 21 0
模型组 278±8. 61) 3. 03±0. 411) 18. 3±1. 42
提取物高剂量组 306±13. 92) 2. 43±0. 462) 5. 82±0. 861)
提取物低剂量组 299±20. 12) 2. 67±0. 522) 10. 3±1. 041)
槲皮素高剂量组 293±14. 72) 2. 51±0. 532) 6. 31±1. 171)
槲皮素低剂量组 289±15. 62) 2. 72±0. 662) 11. 2±1. 811)
硫普罗宁组 313±21. 82) 2. 53±0. 512) 8. 22±0. 971)
与正常对照组相比:1)P＜0. 05;与模型组相比:2)P＜0. 05;下表同
2. 2 赶黄草提取物对大鼠肝脏组织病理学的影响 光镜下正
常对照组肝小叶结构清晰，可见肝细胞内有极少数红色脂滴存
在，模型组有明显较多的红色脂滴，赶黄草提取物各组存在不
同程度红色脂滴减少，进行油红 O 染色脂滴半定量分析后显
示，赶黄草提取物各剂量组同模型组比较均有明显差异(P＜
0. 05)。见表 1。
2. 3 赶黄草提取物对 ALT、AST、TC、TG 水平的影响 相比正
常对照组，模型组血清 ALT、AST、TC、TG 水平均增加(P ＜
0. 05) ;相比模型组，各用药组血清 ALT、AST、TC、TG 水平均降
低(P＜0. 05) ;相比槲皮素各组，赶黄草各提取物组 ALT、AST、
TC、TG水平均降低(P＜0. 05)。见表 2。
表 2 大鼠血清 ALT、AST、TC、TG水平比较(x±s，n=20)
组别
ALT
(U /L)
AST
(U /L)
TC
(mmol /L)
TG
(mmol /L)
正常对照组 78. 3±4. 2 159±9. 3 3. 8±0. 24 1. 9±0. 39
模型组 110. 4±7. 61) 223±10. 28 7. 6±0. 411) 4. 2±0. 441)
提取物高剂量组 80. 4±2. 22) 173±14. 22) 4. 3±0. 672) 2. 3±0. 232)
提取物低剂量组 91. 2±5. 52) 186±12. 22) 5. 2±0. 542) 2. 5±0. 292)
槲皮素高剂量组 92. 8±6. 22) 196±11. 62) 5. 1±0. 832) 3. 2±0. 472)
槲皮素低剂量组 101. 4±8. 72) 204±8. 32) 6. 2±1. 02 3. 6±0. 282)
硫普罗宁组 93. 6±6. 92) 199±10. 62) 5. 2±0. 402) 3. 3±0. 622)
3 讨 论
酒精性脂肪肝是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，临床
症状为非特异性，可无症状，或有右上腹胀痛、食欲不振、乏力、
体重减轻等。导致酒精性脂肪肝在我国慢性脂肪肝发病中占
有较大比例，约占慢性脂肪肝患者 40%，已经成为影响人们健
康的重要的消化系统疾病。酒精性肝损害的发生，主要由于酒
精与其代谢产物对肝细胞的毒性作用，乙醇毒性的早期靶器官
首先为线粒体，其次为微粒体。由于肝脏是储存铁的的重要器
官，亦为铁诱发损伤的主要靶器官，由于乙醇毒性先后作用于
线粒体及微粒体，影响了脂肪酸的 β 氧化，使蓄积脂肪酸的清
除受阻，进而导致了脂肪肝。此时肝铁含量进一步增加，促进
肝组织脂质过氧化损伤，导致脂肪肝继续加重〔3，4〕。酒精性脂
肪肝可经脂肪性肝炎、肝纤维化最终转化为肝硬化，迄今尚无
防治该病的特效药物。本文通过复制大鼠酒精性脂肪肝模型，
对赶黄草对大鼠酒精性脂肪肝的干预作用和作用机制进行了
研究，旨在筛选治疗酒精性脂肪肝的有效药物。
本研究提示长期摄入酒精可致大鼠脂质代谢紊乱，进而形
成酒精性脂肪肝。赶黄草提取物各剂量组则显著改善了酒精
性脂肪肝的病理改变，显著治疗酒精所致大鼠肝脏脂肪性
变〔5〕。本研究发现槲皮素在赶黄草提取物中平均含量约
1. 25%，在赶黄草中平均含量约 0. 2%，而已有研究证实槲皮素
对大鼠酒精性脂肪肝有明显效果〔6〕，本组研究表明赶黄草提取
物相比单纯槲皮素治疗酒精性脂肪肝效果更好，可能与其中含
有协同治疗酒精性脂肪肝的化学成分有关，同既往研究结果有
相似之处〔7〕。
综上所述，赶黄草对大鼠酒精性脂肪肝有明显保护作用，
与其中含有的槲皮素有显著相关性，但相比单纯槲皮素治疗效
果更好，或许与其中可能存在其他具有预防酒精性脂肪肝化学
成分有关，亦可能与其中存在与槲皮素有协同作用的预防酒精
性脂肪肝的化学成分有关。
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〔2014-09-30 修回〕
(编辑 袁左鸣)
抑制自噬可以增加 mTOＲ抑制剂 AZD8055 引起的喉癌细胞株 Hep-2 的凋亡
金香顺 王东旭 尤 涛 (吉化集团公司总医院，吉林 吉林 132022)
〔摘 要〕 目的 探讨抑制自噬是否可以增加哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOＲ)抑制剂(AZD8055)引起的喉癌细胞株 Hep-2 的凋亡。方法
选用人喉癌细胞株 Hep-2 细胞系，应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测 mTOＲ抑制剂 AZD8055 和(或)自噬抑制剂 3-甲基嘌呤(3-MA)对 Hep-2 细
胞活性的影响。Western印迹检测 AZD8055 和(或)3-MA 对 Hep-2 细胞凋亡通路相关蛋白〔Cleaved 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PAＲP)、Cleaved
Caspase-3、细胞色素 C〕的作用。结果 AZD8055 作用 Hep-2 细胞 24 h后，细胞生存率显著下降，具有浓度依赖性。AZD8055 浓度依赖性地增加 Hep-
2 细胞凋亡相关蛋白 Cleaved PAＲP、Cleaved Caspase-3 及细胞色素 C表达。当 3-MA与 AZD8055 联用时，二者联用与单用 AZD8055 组相比，细胞活性
显著降低，显著下调凋亡通路相关蛋白 Cleaved PAＲP、Cleaved Caspase-3、细胞色素 C表达。结论 抑制自噬可以增加 mTOＲ抑制剂 AZD8055 引起的
喉癌细胞株 Hep-2 的凋亡。
〔关键词〕 mTOＲ抑制剂 AZD8055;自噬抑制剂 3-MA;人喉癌 Hep-2 细胞
〔中图分类号〕 Ｒ739. 6 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2015)14-3847-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2015. 14. 023
第一作者:金香顺(1968-) ，女，硕士，主要从事头颈部肿瘤研究。
喉癌早期易于诊断，其死亡率相对较低〔1〕。资料表明吸烟
和饮酒均可以增加发生喉癌的风险〔2〕。哺乳动物雷帕霉素靶
蛋白(mTOＲ)是一种丝 /苏氨酸蛋白激酶，属于 PI3K 相关激酶
(PIKKs)家族成员，它有两种存在形式，即 mTOＲ 复合体
(mTOＲC)1 和 mTOＲC2，其中 mTOＲC1 对雷帕霉素敏感〔3〕。
mTOＲ参与蛋白质、核糖体生物合成和细胞凋亡等多项生理功
能，而且研究表明 mTOＲ 过度表达可以诱导多数肿瘤的发
生〔4〕。体外实验证实 mTOＲ 抑制剂在少数肿瘤细胞类型中具
有诱导肿瘤细胞凋亡的作用〔5〕，但是 mTOＲ抑制剂对喉癌细胞
的作用鲜有报道。增加癌症细胞对凋亡的敏感性是癌症研究
的重要的策略〔6〕。然而，某些癌症细胞对化疗药物产生抵抗一
方面是由于不能启动凋亡通路，还有另一方面是细胞自噬在凋
亡中发挥的保护作用〔7〕。自噬抑制剂本身表现出抗肿瘤活性，
而且它还能增加其他抗肿瘤药物杀伤癌症细胞的效应〔8〕。本
研究拟考察 mTOＲ 抑制剂(AZD8055)是否能引起喉癌细胞株
Hep-2 凋亡以及抑制自噬是否能增 AZD8055 的作用。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂与仪器 自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤(3-MA) ，
AZD8055，四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自美国 Sigma 公司，ＲP-
MI 1640，胎牛血清购自美国 Gibco公司。
1. 2 细胞株与细胞培养 人喉癌细胞株(Hep-2)细胞购自中
国科学院细胞库，培养于含 10%胎牛血清、100 U /ml青霉素和
40 U /ml庆大霉素的 ＲPMI1640 培养基中，在 5% CO2，37℃培
养箱中培养，当细胞生长至对数生长期时进行实验。
1. 3 MTT法检测细胞活性 将 Hep-2 细胞以 5×103 /ml 密度
接种于 96 孔板(每孔加 200 μl) ，培养至对数生长期(24 h) ，加
入不同浓度药物处理 24 h 后，小心吸去上清，加入 90 μl 新鲜
培养液，再加入 10 μl MTT溶液，继续培养 4 h，弃上清，每孔加
入 100 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充
分溶解。用酶标仪于 490 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞
存活率(%)= 〔A实验孔－A空白孔 /(A对照孔－A空白孔)〕×
100%，实验重复 3 次。
1. 4 Western检测蛋白表达 将经药物处理后的 Hep-2 细胞，
加入细胞裂解液 ＲIPA裂解，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶
(SDS-PAGE)电泳。分离胶浓度 12%，浓缩胶浓度 5%，电转至
聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭 2 h，Cleaved 多聚
二磷酸腺苷核糖聚合酶(PAＲP)、Cleaved Caspase-3、细胞色素 C
抗体(Cell Signaling公司，1 ∶800)4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液
(TBST)洗 3 次膜，15 min /次，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二
抗(Cell Signaling公司 1 ∶5 000)室温孵育 2 h，TBST 洗 3 次膜，
15 min /次，增强化学发光法(ECL)显影。
1. 5 统计学方法 应用 SPSS16. 0 软件进行单因素方差分析、
最小显著差数(LSD)法检验。
2 结 果
2. 1 AZD对 Hep-2 细胞生存率的影响 Hep-2 细胞经过 20、
40、80 μmol /L AZD处理 24 h后，细胞生存率均显著下降，并呈
浓度依赖性。
2. 2 AZD对 Hep-2 细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响
线粒体功能障碍在凋亡中起着突出的作用，线粒体功能障碍导
致细胞色素 C，从线粒体膜间隙释放则是多种细胞凋亡的普遍
现象。PAＲP是细胞凋亡核心成员胱天蛋白酶(Caspase)的切
割底物。Western印迹检测凋亡通路执行蛋白 caspase-3 及其底
物 PAＲP，结果如图 1 所示，经不同浓度 AZD处理 24 h后，与对
照组相比 Cleaved Caspase-3 和 Cleaved PAＲP 呈剂量依赖性的
·7483·金香顺等 抑制自噬可以增加 mTOＲ抑制剂 AZD8055 引起的喉癌细胞株 Hep-2 的凋亡 第 14 期