全 文 ：中国农学通报 2012,28(28):163-168
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
植物内生菌是指能定殖在健康植物组织内，并与
寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物[1]。核桃是
一种很好的他感植物，大量的研究表明核桃叶的提取
基金项目：西南林业大学校面上项目“内生菌对核桃苗抗病性相关酶活性影响初探”(110952)。
第一作者简介：李晓红，女，1977年出生，黑龙江肇东人，农艺师，硕士，研究方向：农业微生物。通信地址：110164辽宁省沈阳辉山农业高新区明珠路
1号沈阳农业高新区国有资产经营有限公司，Tel：024-88085526，E-mail：lxhong6801@163.com。
通讯作者：刘丽，女，1976年出生，黑龙江萝北人，高级实验师，硕士，研究方向：农业微生物。通信地址：650224云南省昆明市白龙路西南林业大学，
Tel：0871-3863145，E-mail：cathly@126.com。
收稿日期：2012-04-13，修回日期：2012-06-14。
不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较
李晓红 1，傅本重 2，麻春花 2，刘 丽 2
（1沈阳农业高新区国有资产经营有限公司，沈阳 110164；2西南林业大学，昆明 650224）
摘 要：为了比较几种表面消毒方法对核桃叶内生菌分离种类及数量的影响，分别采用组织块法和稀释
梯度法对内生真菌及内生细菌进行分离计数。真菌通过形态学鉴定到属，细菌通过形态学及16S rDNA
序列分析鉴定到属、种。结果表明，无论是内生真菌还是内生细菌二氧化氯方法处理下获得的内生菌种
类最多。即二氧化氯法获真菌 6株，鉴定为 5个属，细菌 37株，鉴定为 11个属种（其中包括 1个放线菌
属）；次氯酸钠法获真菌8株，鉴定为3个属，细菌4株，鉴定为3个属种；升汞法获真菌3株，鉴定为3个
属，细菌1株，为未知种。从分离内生菌的数量上比较，二氧化氯方法分离获得的细菌数显著性的多于
其他2种方法，由多到少依次为二氧化氯法、次氯酸钠法、升汞法。分析本研究结果认为，二氧化氯表面
消毒更适合进行内生菌多样性研究，但不同的表面消毒方法会获得不同的机会菌株。
关键词：核桃；内生菌；分离；表面消毒
中图分类号：Q939 文献标志码：A 论文编号：2012-1412
Comparison of Different Surface Disinfection Methods for the Isolation of
the Endophytes in Walnut Leaves
Li Xiaohong1, Fu Benzhong2, Ma Chunhua2, Liu Li2
(1Shenyang Agricultural Hi-tech Zone of the State-owned Assets Management Company Limited, Shenyang 110164;
2Southwest Forestry University, Kunming 650224)
Abstract: The purpose of this article was to compare the effects of disinfection on the species and quantity of
the endophytes isolated from walnut leaves. The fungi were separated by the tissue isolation. The bacteria were
separated by the dilution method. Then the fungi were identified based on morphological characteristics. The
bacteria were identified based on the morphological characteristics and 16S rDNA sequence. The results
indicated that the immersing 30 s in 0.3% ClO2 was the best way for isolating endophytes from walnut leaves, 6
endofungi identified 5 genus and 37 endophytic bacteria identified 11 species (including one actinobacteria)
were isolated by this way. 8 endofugi identified 3 genus and 4 endophytic bacteria identified 3 species bacteria
were isolated by NaClO, 3 endofungi identified 3 genera and 1 endophytic bacteria identified 1 specie were
isolated by HgCl. The endophytic bacteria which were isolated based on the ClO2 were more than other two
ways significantly. So the ClO2 should be a best method to compare the diversity of endophytes in different
plants. This study also indicated that different disinfectants would isolate different endophytic groups.
Key words: walnut leaves; endophytes; isolation; surface disinfection
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物具有杀虫作用、抑菌作用，甚至还有抗植物病毒的作
用[2]。植物内生菌往往具有与植物本身相同的生物学
特性，所以核桃内生菌具有很大的生物活性开发的潜
能。植物内生菌的分离是内生菌开发利用的前提，而
植物的表面消毒又是确保分离获得植物内生菌的关键
步骤。自1898年Vogl[3]从黑麦草的种子中分离获得第
1株植物内生菌以来，内生菌的研究热点就主要集中
在其生物功能上，而内生菌分离方法的研究则进展缓
慢。2011年姜国银等[4]分离核桃根、茎内生菌的同时
分析比较了 5种表面消毒方法，认为升汞表面消毒过
强，H2O2等表面消毒效果较好，主要是比较了表面消
毒效果的好坏，对分离内生菌的数量及种类的影响却
没有细致比较。植物内生菌在分离过程中存在着表面
消毒过重会大大减少分离的数量及种类的问题这对内
生菌多样性研究及最大限度的开发利用内生菌来说是
一个障碍。本研究旨在分析比较几种表面消毒方法对
核桃叶内生菌分离的种类及数量的影响，为进一步的
多样性研究及内生菌的开发利用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 不同表面消毒液消毒浓度及时间的确定
选取植物内生菌分离过程中常用的升汞、次氯酸
钠、二氧化氯 3种表面消毒剂分别设定不同的时间梯
度和浓度梯度，用印记法检验表面消毒效果，即取表面
消毒后的材料，将其正反面在牛肉膏蛋白胨(NA)培养
基和马铃薯葡萄糖(PDA)培养基上做印记，后分别在
37℃和 28℃的培养箱内培养 5~10天，观察平板，若没
有微生物长出，说明表面消毒效果较好。经预实验后，
确定能达到表面消毒效果的各消毒剂的浓度及消毒时
间。筛选的浓度及时间见表1。
1.2 核桃内生真菌
1.2.1 内生真菌的分离 内生真菌的分离采用组织块分
离的方法。用打孔器将核桃叶片打成大小一致的圆
片，表面消毒晾干后，将组织块铺于PDA培养基上（含
50 μg/mL的链霉素），每个平板放 5个组织块，每个样
品4个重复，在27℃恒温箱中倒置培养，同时用印迹法
在PDA培养基上作对照。对照长菌则此次结果弃之。
1.2.2 内生真菌的计数 可分离培养内生真菌的数量采
用各种方法下的分离率来进行比较。即待组织块长出
菌丝后，数每个培养皿里长出菌丝的组织块数，同时对
每种菌株做好记录，每个处理长出后求出长菌率。公
式：分离率=长菌的组织块数/总组织块。
1.2.3 内生真菌的鉴定 根据菌落形态特征及孢子、产
孢结构等显微形态特征，对照有关真菌鉴定资料确定
真菌的分类学地位[5-6]。未产孢菌株采用添加无菌宿主
原汁的多种贫营养培养基；近紫外光照射；长期培养等
多种方法进行诱孢培养。最后根据形态特征将其鉴定
到属。
1.3 核桃内生细菌
1.3.1 内生细菌的分离 用打孔器对核桃叶打成大小一
致的圆片，称取核桃叶片 2 g，表面消毒后加 18 mL无
菌水充分研匀，静置1 min，取其上清液0.1 mL涂布到
NA培养基上，做 3个重复。在 37℃恒温箱中倒置培
养，同时印记对照。
1.3.2 内生细菌的计数 待培养基里长出菌落，菌落数
平稳后，计算菌落数，同时记录每种菌落的特征，如颜
色、大小、表面特征等。每克叶片含菌量计算公式：每
克核桃叶中含有的细菌数=3个重复的菌落平均
数×10×10/2。
1.3.3 内生细菌的鉴定 核桃内生细菌的鉴定采取形态
学特征鉴定与分子生物学鉴定相结合的方法。
形态学鉴定：形态特征上主要观察记录分离菌株
的菌落形态，显微镜下观察菌体的显微形态，如革兰氏
染色，鞭毛染色，荚膜染色等。
16S rRNA鉴定：（1）DNA提取和 16S rDNA PCR
扩增。对各菌株进行提取细菌总基因组DNA后，PCR
扩增16S rDNA。基因组DNA的提取采用上海捷瑞公
司生产的细菌基因组提取试剂盒进行，16S rDNA扩增
引 物 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’及
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACG- ACTT-3’[7]。PCR
反应体系和反应条件参照文献[8]的方法进行。（2）16S
rDNA序列分析。扩增的PCR产物送上海生物工程技
术服务有限公司纯化并测序，测定序列长度为 1000~
1400 bp。测定的16S rDNA全长序列在GenBank上进
行同源性比对，16S rDNA序列相似性达到98%以上的
认为是一个种，达97%以上则认为是同一个属[9]，若序
列相似性小于96%~97%的可以认为不是同一个种，小
于93%~95%的可以认为不是同一个属[10]。
消毒液
升汞HgCl2
次氯酸钠NaClO
二氧化氯ClO2
浓度/%
0.1
3
4
5
0.1
0.2
0.3
消毒时间/min
2、3
5、10
5、10
5、10
1、2
1、2
0.5、1
表1 不同表面消毒液的筛选浓度及时间
·· 164
李晓红等：不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较
1.4 数据分析
测得 16S rDNA用 contig软件连接后，用在线
Eztaxon Server2.1进行序列比对，在GenBank上找到
同源序列。后用MEGA5软件采用Neighbor-Joining法
进行系统发育分析。分离内生菌数量差异性分析采用
SPSS软件进行。
2 结果与分析
2.1 不同表面消毒液的消毒浓度及时间
通过表面印记的方法，以可达到表面消毒效果为
界，确定不同消毒液的使用浓度及消毒时间分别为：升
汞 0.1%处理 3 min、次氯酸钠 5%处理 5 min、二氧化氯
0.3%处理30 s。
2.2 不同表面消毒方法对可培养内生真菌的影响
待组织块周围长出菌丝后进行计数，比较不同的
表面消毒方法对真菌出菌率的影响。由表 2可看出，
用次氯酸钠进行表面消毒真菌的出菌率相对较高，用
升汞消毒则出菌率较低。从核桃叶中共分离出真菌菌
株 17株，其中二氧化氯法 6株，鉴定为 5属；升汞法 3
处理方法
二氧化氯
ClO2
升汞
HgCl
次氯酸钠
NaClO
鉴定结果
半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科链格孢属(Alternaria)
半知菌亚门丝胞纲瘤座孢目瘤座孢科镰孢属(Fusarium)
半知菌亚门腔孢纲球壳孢目球壳孢科壳满孢属(Plenodomus)
半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛孢梗科葡萄孢属(Botrytideae)
半知菌亚门腔孢纲球壳孢目球壳孢科大茎点霉属(Phomopsis)
半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科链格孢属(Alternaria)
半知菌亚门丝胞纲瘤座孢目瘤座孢科镰孢属(Fusarium)
半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目黑盘孢科炭疽菌属(Colletotrichum)
半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科链格孢属(Alternaria)
半知菌亚门丝胞纲瘤座孢目瘤座孢科镰孢属(Fusarium)
半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目黑盘孢科炭疽菌属(Colletotrichum)
出菌率%
30
15
40
表2 不同表面消毒剂核桃叶内生真菌分离比较
株，鉴定为3属；次氯酸钠法8株，鉴定为3属。
2.3 不同表面消毒方法对可培养内生细菌的影响
2.3.1 对内生细菌数量的影响 对内生细菌的数量进行
单菌落计数，二氧化氯表面消毒后获得内生细菌总数
为(6.83×102±257) CFU/g；次氯酸钠表面消毒后获得内
生细菌总数为(1.25×102±35) CFU/g；升汞表面消毒后
获得内生细菌总数为(4.1×10±13) CFU/g（平均数±标
准差）。
进一步对内生细菌菌落数进行多重比较，分析表
面在著性水平0.05情况下，二氧化氯与升汞、次氯酸钠
2种表面消毒方法存在显著性差异。
2.3.2 对内生细菌种类的影响 利用上海捷瑞公司的细
菌基因组提取试剂盒对分离纯化的内生细菌进行总
DNA提取，电泳结果如图1。由图1可见，提取的细菌
总DNA具有较好的完整性，已经达到进一步进行PCR
分析的质量和浓度的要求。
采用通用引物进行PCR扩增后，产物的电泳图片
见图 2，可见PCR产物的纯度和浓度已达到测序的要
求，进而送往公司进行序列测定。测得的序列进行
contig后比对结果见表3，可见大部分菌株都可找到同
源性达 99%的同源序列。只有菌株O8-11、S2-11和
S2-12与数据库中已知菌株同源性低于90%。MEGA5
M 1 2 3 4 5 6 7 8
15000 bp
M：15 kb Marker；1：O15-1；2：O5-4；3：O9-1；4：O5-1；5：O3-5；6：O11-8；7：O7-2；8：O4-7
图1 部分内生菌DNA的提取
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M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3000 bp
1500 bp
1000 bp
M：15 kb Marker；1：S1-2；2：O3-2；3：S2-11；4：O2-4；5：O8-11；6：O13-2；7：C1-1；8：S1-1；9：O2-3；10：O4-1
图2 核桃叶可培养内生菌16S rDNA PCR电泳图
表3 对核桃叶可培养内生细菌及放线菌16S rRNA序列分析结果
二氧化氯
ClO2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
O1-1
O1-3
O1-4
O2-3
O2-4
O2-5
O3-1
O3-2
O3-5
O4-1
O4-5
O4-6
O4-7
O5-1
O5-3
O5-4
O6-4
O7-1
O7-2
O7-3
O8-11
O9-1
O9-2
O10-1
O10-3
O11-1
O11-3
O11-7
O11-8
O13-1
O13-2
O13-4
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Xanthomonas gardneri ATCC 19865(T)
Xanthomonas gardneri ATCC 19865(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Xanthomonas gardneri ATCC 19865(T)
Advenella kashmirensis WT001(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Xanthomonas vesicatoria ATCC 35937(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Nocardioides kribbensis KSL-2(T)
Pseudomonas geniculata ATCC 19374(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Nocardioides kribbensis KSL-2(T)
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28(T)
Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645(T)
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28(T)
Bacillus safensis FO-036b(T)
Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645(T)
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28(T)
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28(T)
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28(T)
99.444
99.028
99.485
99.479
99.242
99.449
99.295
99.098
99.590
99.241
99.850
99.600
99.283
99.236
99.306
99.304
99.600
99.596
99.097
99.505
89.907
99.167
99.375
99.225
99.886
99.578
99.914
99.232
99.228
99.914
99.914
99.914
处理方法 序号 菌株号 近源菌 相似性%
·· 166
李晓红等：不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较
软件系统发育分析见图 3，结果表明二氧化氯法获得
的内生细菌及放线菌共分为 7个类群，次氯酸钠获得
菌株划分在二氧化氯的最大类群中，升汞法获得菌株
分属2个类群。
3 结论与讨论
3.1 核桃叶内生真菌分离
核桃叶内生真菌的分离，从分离率上比较以次氯
酸钠法分离率最高达 40%，二氧化氯法次之达 30%。
二氧化氯
ClO2
升汞
HgCl
次氯酸钠NaClO
33
34
35
36
37
1
2
3
4
1
O14-1
O14-2
O15-1
O15-3
O15-4
S1-1
S1-2
S2-11
S2-12
C1-1
Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645(T)
Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
Bacillus stratosphericus 41KF2a(T)
Bacillus altitudinis 41KF2b(T)
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28(T)
Bacillus altitudinis 41KF2b(T)
Bacillus badius ATCC 14574(T)
Solibacillus silvestris HR3-23(T)
Pseudomonas cissicola ATCC 33616(T)
99.018
98.878
99.375
99.381
99.449
99.914
99.375
68.089
65.440
99.097
处理方法 序号 菌株号 近源菌 相似性%
续表3
O：二氧化氯；C：次氯酸钠；S：升汞
图3 核桃叶内生细菌及放线菌系统发育分析
06-4
07-1
99
05-4
04-7
04-6
03-5
03-1
02-3
01-4
O9-2
O9-1
O7-2
O5-3
O5-1
O4-1
O3-2
O2-5
O2-4
O1-3
O1-1
C1-1Xanthomonas pisi(LMG 847(t))
O15-1
Pseudomonas geniculata (ATCC19374T)
08-11Advenella kashmirensis (WT001(t))
O4-5
O7-3
O10-1Nocardioides kribbensis (KSL-2(T))
O14-1
O14-2Cutrobacterium flaccumfaciens (LMG 3645(t))
O11-1
O11-8
O13-4
S1-1
Bacllus mojavensis
O11-3
O13-1
O13-2
010-3
O15-3
O11-7
S1-2Bacillus stratosphericus (41KF2a(T))
Bacillus badius Atcc (14574(T))
O15-4
S2-2
S2-11
S2-12
99
99
92
94
99
73
99
96
99
99
98
·· 167
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进一步比较分离所获内生真菌的种类，发现次氯酸钠
法的出菌率较高，但多样性却不高，即二氧化氯法分离
获得6个菌株被鉴定为5个属，而次氯酸钠法分离获得
了8个菌株被鉴定为3个属。
3种方法下所获得的共有属为链格孢属及镰孢
属，这 2个属是很多植物内生真菌分离过程中的常见
菌属 [11-12]，而二氧化氯处理下的特有菌属壳满孢属
(Plenodomus)、葡萄孢族 (Botrytideae)、大茎点霉属
(Phomopsis)在一些植物的内生真菌分离过程中属于
机会菌属。对于内生真菌的分离来说二氧化氯法分离
获得的内生真菌种类范围最大，但此处理下却没能获
得机会菌属炭疽菌。由此可看出，在核桃叶内生真菌
的分离上二氧化氯法更占优势，但并不是说二氧化氯
法所获得的内生菌的种类能涵盖所有其他方法所获得
的内生菌。
3.2 核桃叶内生细菌分离
核桃叶内生细菌的分离，在数量上二氧化氯法显
著性的多于其他2种方法。在种类上二氧化氯法也比
其他方法获得的内生细菌种类更加丰富，图3可看出，
次氯酸钠法获得的唯一1种内生菌归属于二氧化氯法
的优势菌群即黄单孢杆菌属，而升汞法除二氧化氯法
共用的芽孢杆菌外，还分离获得了 1个未知的新种。
故如果想更大范围的获得内生菌还需同时采取不同表
面消毒法，才能获得更多的机会种。
目前，多数研究者采用低浓度酒精、次氯酸钠、升汞
等对材料进行表面灭菌。但仍存在灭菌过轻会掺入植
物表生微生物，从而使内生细菌的多样性扩大，灭菌过
重又会导致部分可分离培养的内生细菌丢失的情况[13]。
通过实验结果分析认为，二氧化氯的消毒方法更适合
用于研究内生菌多样性，能更大范围的分离内生菌。
但植物内生菌的种类及数量受到多种因素的影响，如
分离的时间、部位、植物的种类等。因此对于不同的植
物和植物的不同部分是否结果相同需要做进一步的实
验来验证。
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