全 文 ：　　文章编号:1004-8405(2001)04-0044-07
固体培养条件下外加营养碳源及微量元素
对贝壳状革耳菌酶系产生的影响
胡平平　付时雨＊　余惠生
(中国科学院广州化学研究所纤维素化学开放研究实验室 广州 510650)
文　摘:研究了固体培养条件下外加营养碳源葡萄糖及土豆汁 ,微量元素
Cu2+、Mn2+对贝壳状革耳菌产木素降解酶 、纤维素酶和半纤维素酶的影
响。结果表明 ,营养碳源和微量元素对贝壳状革耳菌漆酶的产生有显著
的促进作用 ,外加碳源土豆汁要比外加葡萄糖所产生的促进作用大。对
于依赖锰过氧化酶 、CMC 酶和半纤维素酶 , 外加营养碳源和微量元素对其
产生无明显影响 ,而微晶纤维素酶在各个固体培养过程中都未检测到。
关键词:白腐菌 , 漆酶 ,纤维素酶 , 半纤维素酶
中图分类号:Q55　　　文献标识码:A
0　前　言
近年来 ,由于人们发现漆酶在造纸工业 ,植物纤维的改性 ,废水处理 ,染发工艺 ,饮
料加工工艺 ,石油工业废物处理等方面具有广阔的应用前景 ,因此对漆酶的研究倍受国
际的关注 ,漆酶的产生特别是高活性漆酶的生产显得越来越重要 。漆酶的来源很多 ,包
括高等植物 ,昆虫 ,细菌和真菌 。最近有研究指出 ,不同来源的漆酶其氧化还原性质相
差很大 ,其中白腐菌漆酶具有最强的氧化还原的能力。
贝壳状革耳菌(Panus conchatus)是一株能迅速并具有选择性降解木素的优良白腐
菌[ 1] 。我们发现它所产生的木素降解酶为漆酶和依赖锰过氧化酶(MnP),其中主要是
漆酶 。研究还表明 Panus conchatus具有较高活性的漆酶产生的能力 ,同时也发现液体
培养条件下碳源和微量元素对该菌产漆酶有显著的影响[ 2 ,3] 。最近我们又发现固体培
养条件下该菌种产生的漆酶活性远大于它在液体培养条件下产生的漆酶活性[ 4 ,5] 。为
了进一步提高漆酶的产量 ,了解一些生理因素 ,特别是在固体培养条件下对产酶的影
响 ,本文着重考察了固体培养条件下增加碳源(葡萄糖和土豆汁),微量元素 Cu(Ⅱ)和
Mn(Ⅱ)对 Panus conchatus产漆酶的影响 ,同时也考察了这些因素对该菌产纤维素酶和
半纤维素酶的影响。
第 9卷第 4期
2001年　12月　　 　纤 维 素 科 学 与 技 术Journal of Cellulose Science and Technology 　　 　Vol.9　No.4Dec.　 2001
收稿日期:2001-04-06
国家自然科学基金和省自然科学基金资助课题　　　＊通讯联系人
DOI :10.16561/j.cnki.xws.2001.04.008
1　材料与方法
1.1　菌种与试剂
白腐菌 Panus conchatus(GH033-5a)由本实验室选育 。葡萄糖 ,硫酸铜 ,硫酸锰均
为分析纯 。
土豆汁的制备:土豆经削皮 ,切成片后 ,加入水(土豆∶水=1∶5质量比),80℃下保
温1 h ,过滤 ,加水至原来体积 。
1.2　固体培养
粉碎的稻草经洗净后分别加入外加营养碳源[0.01 g/g(葡萄糖/草)或10mL/g(土豆汁/草)]
以及微量元素 Mn(Ⅱ)或 Cu(Ⅱ)(50×10-6质量分数),在 1.03×105 Pa 的压力下灭菌
30 min ,接种 ,混匀后在 38℃的条件下静止培养 。
1.3　酶液的制备
稻草发酵 30天 ,每 3天取样一次(每个发酵样品进行三次平行试验),挤出发酵液。
离心后(3000 r/min ,10 min)取上清液用于测酶活。
1.4　酶活力的测定
漆酶酶活的测定:室温下取等体积的酶液和 0.5 mmol/L 的 2 , 2-连氮-二(3-乙
基并噻-6-磺酸)(简称 ABTS)反应 ,测定反应前 4 min 内反应液在 420 nm 处的吸光
度。每分钟使 1μmol的ABTS 氧化所需要的酶量为一个活力单位[ 6] 。
锰酶酶活的测定:室温下反应体系中含有 50 mmol/L , pH 4.5 的乳酸钠缓冲液
3.4 mL ,1.6 mmol/L 的 MnSO4 溶液 0.1 mL , 酶液 0.4 mL , 加入 1.6 mmol/L 的 H2O2
0.1 mL启动反应。测定反应最初 4 min 内在 240 nm 处的吸光度。每分钟使 1μmol的
Mn2+转化成Mn3+所需要的酶量为一个酶活单位(U)[ 7] 。
木素过氧化酶(LiP)酶活的测定:反应体系为 0.125 mol/L酒石酸钠-盐酸缓冲液
(pH 3.5),2.5 mmol/L 藜芦醇 , 0.5 mmol/L H2O2 和适量酶液 。测定反应前 3 min 内在
310 nm处吸光度值的增加 ,定义每分钟使 1μmol/L 藜芦醇氧化所需的酶量为一个酶活
单位(IU)[ 8] 。
半纤维素酶活的测定:主要检测木聚糖酶活力:取 0.1 mL 适当稀释的酶液 ,加入
1 mL 1%木聚糖 ,0.1 mol/L pH 4.8的醋酸缓冲溶液 ,50℃反应 30 min。用 DNS法测定
还原糖。定义每分钟释放 1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位(U)[ 9] 。
CMC酶(EG)活力的测定:取 0.5 mL酶液和 0.5 mL 0.05 mol/L , pH 4.8的柠檬酸
缓冲溶液配制的 1%的羧甲基纤维素钠及 0.5 mL的上述缓冲液 ,50℃下反应 30 min ,用
DNS法测定还原糖。定义每分钟释放 1μmol 还原糖所需的酶量为一个活力单位
(U)[ 10] 。
微晶纤维素酶(CBH)活力的测定:取 0.5 mL 的酶液和 0.5 mL 0.05 mol/L , pH 4.8
的柠檬酸缓冲液 ,以及1 mL上述缓冲液配制的1%的微晶纤维素悬浮液作底物 ,50℃下
反应 2 h ,用DNS法测定释放的还原糖。定义每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为一
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个活力单位(U)[ 11] 。
2　结果与讨论
2.1　添加碳源和微量元素对 Panus conchatus产木素降解酶的影响
碳源是微生物生长的必需物 ,通常最理想的碳源是糖类 ,其中葡萄糖最为常用 ,但
应用中常使用一些较复杂的碳源如土豆汁等 。本文考察了较复杂碳源土豆汁和较简单
碳源葡萄糖对 Panus conchatus产木素降解酶的影响 ,结果如图 1 ,图 2。
培养时间/d 培养时间/ d
图 1　外加营养碳源条件下 Panus conchatus
产漆酶的情况
图 2　外加营养碳源条件下 Panus conchatus
产 MnP酶的情况
结果表明固体培养条件下外加碳源土豆汁及葡萄糖对 Panus conchatus产生MnP 无
明显影响 ,在整个培养过程中产生的 MnP酶活都较低(见图 2)。对漆酶来说 ,以土豆汁
或葡萄糖为外加碳源时 , Panus conchatus漆酶在培养前期与不添加外加碳源时一样 ,其
酶活均较低 ,但培养至 21天后 ,漆酶的酶活有显著的提高 ,分别为对照条件下的 2.0
倍 ,1.7倍 ,这可能是由于漆酶是一种次生代谢酶 ,所产生的漆酶活性的高低与菌丝繁
殖的量有关 ,在培养早期 ,葡萄糖和土豆汁比稻草较易被利用而刺激菌丝的生长和繁
殖 ,虽然还不能从量上进行分析 ,但在培养过程中可以发现添加外加碳源时菌丝的繁殖
比较旺盛 。也许由于这个原因而导致培养后期所释放出来的漆酶酶活提高。此外 ,以
土豆汁为碳源时 Panus conchatus漆酶酶活大于以葡萄糖为碳源时的漆酶酶活 ,我们推
测这可能与土豆汁中含有多种不同的营养物 ,促使菌丝生长更旺盛有关。
微生物生长需要微量元素 ,通常包括 Fe ,Cu ,Mn ,Zn ,Co 等 ,但从文献上看 ,对白腐
菌产木素降解酶有重大影响的微量元素主要是 Cu ,Mn。图 3 ,图 4显示了外加微量元
素Cu(Ⅱ),Mn(Ⅱ)对 Panus conchatus产木素降解酶的影响。
从图 3 ,图 4可看出 ,Mn(Ⅱ),Cu(Ⅱ)对 Panus conchatus产依赖锰过氧化酶几乎无
影响 ,都在 7天左右达到最大值 ,其值相当 ,随后酶活逐渐下降(见图 4)。但对漆酶来
说 ,Cu(Ⅱ),Mn(Ⅱ)的加入 , Panus conchatus漆酶的产量都有显著的提高 ,分别为不加微
量元素条件下的 1.6倍和 1.7倍。但外加微量元素 Mn时 ,漆酶最高酶活力出现在 27
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天左右 ,而加Cu或不加微量元素时 ,其最高酶活力出现在 22天左右(图3)。
培养时间/d 培养时间/ d
图 3　添加 Cu(Ⅱ),Mn(Ⅱ)对 Panuss
conchatus固体培养中产漆酶的影响
图 4　添加 Cu(Ⅱ),Mn(Ⅱ)对 Panus
conchatu 固体培养中产 MnP的影响
漆酶是一种多铜过氧化酶 ,一般含有四个铜原子的含铜蛋白 。上述结果可能是由
于漆酶基因转录合成漆酶时需要铜离子 ,因此在限铜或缺铜的情况下 ,漆酶的合成受影
响 ,导致漆酶酶活力低 ,对 MnP来说 ,可能因酶蛋白中不含 Cu(Ⅱ),所以 Cu(Ⅱ)对MnP
产生的影响不大[ 12] 。我们及国际上一些研究者曾对不同白腐菌在液体培养过程中 ,添
加铜离子对漆酶产生的影响进行了考察 ,研究也表明一定浓度范围内的铜离子对大多
数的白腐菌产漆酶都有显著的促进作用 ,而对 MnP的产生影响不大[ 5 ,13] 。
2.2　添加营养碳源和微量元素对 Panus conchatus 产纤维素酶的影响
培养时间/d 培养时间/ d
图 5　添加微量元素 Cu(Ⅱ),Mn(Ⅱ)对 Panus
conchatus固体培养中产 CMC 酶的影响
图6　添加营养碳源对 Panus conchatus
固体培养中产 CMC 酶的影响
Panus conchatus除了产生木素降解酶之外 ,还会产生纤维素酶及半纤维素酶。液
体培养中我们发现该菌产生的纤维素酶酶活很低 ,而木聚糖酶的酶活较高 ,这特别有利
于在造纸或纤维改性上的应用 。为了观察在固体培养情况下 ,纤维素酶及木聚糖酶的
产生情况 ,以及了解添加营养碳源及微量元素对酶产生的影响 ,我们测试了不同过程中
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不同酶的变化情况。由图 5 ,图 6可看出 ,添加营养碳源土豆汁 、葡萄糖及微量元素铜 、
锰均对 Panus conchatusCMC酶活的产生无明显影响 ,特别指出的是微晶纤维素酶在各
个培养过程都未检测到 ,这就进一步显示了 Panus conchatus在造纸制浆工业上所具有
的应用前景。
2.3　添加营养碳源及微量元素对 Panus conchatus 产半纤维素酶的影响
培养时间/d 培养时间/ d
图 7　添加营养碳源对 Panus conchatus
固体培养中产木聚糖酶的影响
图 8　添加微量元素 Cu(Ⅱ), Mn(Ⅱ)对 Panus
conchatus固体培养中产木聚糖酶的影响
稻草中半纤维素主要是木聚糖 ,因此检测半纤维素酶时主要检测了木聚糖酶。因
为稻草中的木素大部分是以木素碳水化合物复合体存在[ 14 ,15] ,相连的碳水化合物主要
是木聚糖酶 。对木聚糖的降解有利于木素的降解溶出[ 16 ,17] 。因此与纤维素酶相反 ,在
生物降解木素的过程中 ,人们希望真菌产生的木聚糖酶酶活越高越好 。但从图 7 ,图 8
来看 ,添加碳源(土豆汁或葡萄糖)和微量元素 Cu(Ⅱ)对 Panus conchatus木聚糖酶的产
生无明显影响 ,而Mn(Ⅱ)的加入反而使其酶活有所下降 ,但也并不十分明显 。
3　结　论
(1)外加营养碳源和微量元素基本上不影响 Panus conchatus 产木素降解酶的变化
规律:漆酶酶活在培养前期较低 ,在培养后期其酶活一直保持较高水平 ,而依赖锰过氧
化酶在培养前期酶活较高 ,培养8天左右酶活达到最大值 ,随着培养时间的延长酶活逐
渐下降并趋近于零。
(2)添加营养碳源对固体培养条件下 Panus conchatus产漆酶有显著的促进作用 ,且
较复杂碳源的促进作用大于较简单碳源的促进作用 ,但对依赖锰过氧化酶的促进作用
不大 。
(3)固体培养条件下 ,添加微量元素 Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)对 Panus conchatus产漆酶有显
著的促进作用 ,而对依赖锰过氧化酶的产生基本无影响 。
(4)固体培养条件下 ,添加碳源土豆汁 、葡萄糖及微量元素铜离子 、锰离子对 Panus
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conchatus产 CMC酶和木聚糖酶均无明显影响 ,微晶纤维素酶在各个培养过程中都未检
测到 。
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胡平平等:固体培养条件下外加营养碳源及微量元素　　　 　对贝壳状革耳菌酶系产生的影响 　　 　　　　　　　　
Effects of Supplement Carbon Sources and Trace Elements on
Production of Lignocellulolytic Enzyme Profiles by Panus conchatus
during the Solid State Fermentation Processes of Rice Straw
Hu Pingping　Fu Shiyu　Yu Huisheng
(Laboratory of Cellulose and lignocellulosics Chemistry , Guangzhou Institute of Chemistry ,
Chinese Academy of Sciences , Guangzhou 510650 , China)
Abstract:The effects of supplement of nutrient carbon sources and trace elements on production
of lignin-degrading enzymes , cellulolytic enzymes and xylanase were investigated in the present
paper.It was found that supplement of nutrient carbon sources , either glucose or potato
extractives and trace elements , either Cu2+or Mn2+ could remarkably stimulate production of
laccase during the solid state fermentation (SSF)by Panus conchatus.Production of laccase
during SSF processes was more when potato extractives was supplemented than glucose was done.
However , the effects on production of MnP were limited when either nutrient carbon sources or
trace elements were supplemented.It was also found that avicelase activities were not detected
during the solid-state fermentation with and without supplement of nutrient carbon sources and
trace elements.The effects on production of CMCase and xylanse were also limited with and
without supplement of nutrient carbon sources and trace elements.
Key words:white-rot fungus , ligninolytic enzyme , cellulase , xylanase
(上接第 37页)
Effect of UV+TiO2 on Cleaning of Pulping
Black Liquor and Bleaching Medium
Li Binghuan　Liu Feiyue　Xu Yingsong
(Laboratory of Cellulose and Lignocellulosics Chemistry ,Guangzhou Institute of Chemistry ,
Chinese Academy of Sciences , Guangzhou 510650 , China)
Abstract:The study on cleaning of pulping black liquor and bleaching medium by UV+TiO2was
discussed.The results suggested that TiO2 after heat treating at high temperature has more
activity.By action of UV+TiO2 , the contents of organic chlorine and colourity of pulping black
liquor and bleaching medium can decreased.
Key words:titanium , photocatalysis , pulping , waste water , organic chlorine
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