全 文 ：文章编号:1009-220X(2001)04-0022-06
贝壳状革耳菌漆酶酶活测定方法分析
胡平平　付时雨＊　李光日
(中国科学院广州化学研究所 纤维素化学开放研究实验室 , 广州 510650)
摘　要:酶活测定方法中所用的反应底物 、反应条件以及酶活单位定义对
漆酶酶活的测定结果有很大的影响。在对贝壳状革耳菌(Panus conchatus)
漆酶酶活测定方法的研究中发现 ,该酶与2 , 2 -连氮-双(3-乙基并噻
-6 -磺酸)(ABTS)反应的最适 pH值为 3.0 , 而与紫丁香醛连氮 、2 , 6-二
甲氧基苯酚和邻甲联苯胺反应的最适 pH 值均为 4.0。上述底物与 Panus
conchatus 漆 酶反 应 的 Km (米氏 常 数)分 别 为 0.0116(mmol·L)-1 ,
14.1095(mmol·L)-1 , 0.1011(mmol·L)-1 , 0.1415(mmol·L)-1。该酶与 ABTS、
2 , 6-二甲氧基苯酚和邻甲联苯胺反应均表现为零级反应 , 而与紫丁香醛
连氮反应时只在一定范围的酶浓度以及反应时间内才表现为零级反应。
关键词:贝壳状革耳菌;漆酶;测定方法
中图分类号:Q554　　　文献标识码:A
　　漆酶是一种多铜过氧化酶 。近年来 ,人们发现它在造纸 、染料 、废水处理等工业上
有着广阔的应用前景 ,因而对它的研究越来越备受关注 。目前有关漆酶的研究论文很
多 ,但主要是围绕如何提高漆酶的酶活 、增强漆酶的稳定性而展开的 。而漆酶酶活是否
提高 ,漆酶稳定性是否增强都要通过对酶活的测定来确定。漆酶酶活的测定方法很多 ,
但到目前为止还没一种标准的 、统一的酶活测定方法 ,这也许是由于漆酶的来源很多
(植物 ,细菌 ,昆虫 ,真菌),而不同来源的漆酶与底物反应的亲和力是不一样的 ,即使是
同一来源的漆酶 ,反应的底物不同 ,反应的亲和力也不同 ,测得的酶活数值也不同。另
外 ,反应条件如温度 、酸度等对酶活的测定结果也有很大的影响 。如红栓菌漆酶与邻联
苯甲胺反应:当 pH 为 5.0时测得的酶活约为 pH 等于 5.8 时的 17%;当反应温度为
70℃时 ,反应速率仅为 30℃时的 48.2%[ 1] 。从文献上看 ,目前漆酶酶活的测定大多数
是在常温下进行(以紫丁香醛连氮为底物时 ,大多数在 30℃条件下测定),而酸度却变
化较大 ,基本上在 3.0 ～ 7.0的范围内变动 。
Panus conchatus是本课题组选育出的高产漆酶的菌株 。与大多数的漆酶一样 ,
Panus conchatus漆酶酶活的测定只用一种方法 ,与用其它方法测得的酶活结果并未作
过对照 ,因而就造成了不同漆酶酶活比较的巨大不便 。在我们的前期工作中 , Panus
conchatus漆酶酶活的测定都是采用ABTS 为反应底物 ,在 pH 为 4.0的条件下测定 ,酶活
单位定义为单位时间内生成 1μmol·L-1产物所需酶量[ 2] 。本文以 Panus conchatus为材
料 ,对其漆酶酶活的测定方法进行分析 。
第 26卷第 4期
　2001年 12月 　　 　 　　广　州　化　学Guangzhou Chemistry 　 　　　Vol.26 , No.4　Dec., 2001
收稿日期:2001-03-07
基金项目:广东省自然科学基金资助项目　　　＊通讯联系人
DOI :10.16560/j.cnki.gzhx.2001.04.006
1　材料与方法
1.1　菌种
Panus conchatus由本课题组自行分离纯化得到 。
1.2　试剂
2 ,2 -连氮-双(3-乙基并噻 -6 -磺酸)(ABTS)、紫丁香醛连氮为 Sigma 公司
产品 。2 ,6-二甲氧基苯酚和邻甲联苯胺为 Fluka公司产品。
1.3　漆酶活性的测定
(1)取1.6mL 用0.15mol·L-1 ,pH=4.0的NaAc-HAc缓冲溶液配制成的0.5mmol·L-1
ABTS溶液 ,室温下加入 1.6mL适当稀释的酶液启动反应 ,测反应最初 3min内λ=420nm
处吸光度的变化 ,计算酶活力(ε420nm=3.6×104cm-1·mol-1·L)[ 2] 。
(2)反应体系含 0.2 mL 0.5mmol·L-1紫丁香醛连氮醇液 , 1.5 mL 50mmol·L-1
pH=5.8的磷酸缓冲液 ,1.8mL的 酶液 ,反应 5min ,于 525nm处比色[ 1] 。
(3)1.6mL 0.2mmol·L-1的丁二酸钠缓冲液配置的 2 , 6-二甲氧基苯酚 ,1.6mL 酶
液 ,反应 4min ,于 469nm处比色[ 3] 。
(4)反应体系含 1.5mL 1mmol·L-1邻甲联苯胺溶液 , 1.5mL 0.5 mmol·L-1的
NaAc-HAc缓冲溶液 , 0.3mL 蒸馏水及 0.3mL酶液 ,反应 5min ,于 600nm处比色[ 1] 。
2　结果与讨论
2.1　缓冲液的 pH值对贝壳状革耳菌漆酶酶活测定的影响
本研究中我们考察了不同底物条件下缓冲液的 pH值对贝壳状革耳菌漆酶酶活测
定的影响。结果如图 1 、2 、3 、4。从图中可看出 ,贝壳状革耳菌漆酶与紫丁香醛连氮 、邻
甲联苯胺 、2 ,6-二甲氧基苯酚反应的最适 pH 值均为 4.0。当 pH 值为 5.0时 ,测得的
酶活分别为pH值为 4.0时的59.4%, 31.1%, 92.3%,可见缓冲液的 pH值对贝壳状革
耳菌漆酶酶活测定的结果有很大的影响 。与上述底物不同 ,贝壳状革耳菌漆酶与 ABTS
反应的最佳 pH值为 3.0。当 pH为 4.0时其酶活为 pH 3.0时的 73.8%, 当 pH 为 5.0
时其酶活仅为 pH 为 3.0时的 25.6%。在我们的前期研究中 , Panus conchatus漆酶酶活
的测定都是在 pH为 4.0的条件下进行 ,这说明以前所测的漆酶酶活结果都偏低。另
外 ,我们发现文献中以其它菌种作材料时 ,其漆酶与紫丁香醛连氮反应的最适 pH 值一
般都明显高于贝壳状革耳菌漆酶与紫丁香醛连氮反应的最适 pH值 ,红栓菌胞外漆酶
与紫丁香醛连氮反应的最适 pH 值为 5.8[ 1] ,变色菌与紫丁香醛连氮反应的最适 pH 值
为5.3[ 4] ,而 Chaetemium thermephilium 与紫丁香醛连氮反应的最适 pH值为6.0[ 5] 。由上
可知 ,不同来源的漆酶其最佳反应 pH 值不同 ,即使是同一种来源的漆酶 ,反应底物不
同 ,其最佳反应 pH值也有差别 ,这就意味着反应 pH 值对测定漆酶酶活的影响与漆酶
酶源 、反应底物都有关。
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图 1　2 , 6-二甲氧基苯酚为反应底物时 pH 值对
贝壳状革耳菌漆酶酶活测定结果的影响
图2　ABTS 为反应底物时 pH 值对贝壳状
革耳菌漆酶酶活测定结果的影响
图 3　邻联苯甲胺为反应底物时 pH 值对贝壳
状革耳菌漆酶酶活测定结果的影响
图 4　紫丁香醛连氮为反应底物时 pH 值对贝
壳状革耳菌漆酶酶活测定结果的影响
2.2　反应底物对测定贝壳状革耳菌漆酶酶活的影响
从表 1可看出 ,反应的底物不同 ,贝壳状革耳菌漆酶酶活也不一样 ,甚至相差很大。
如与ABTS反应时的酶活为 14428 U/L ,与紫丁香醛连氮反应时其酶活仅为 3028.9 U/L
(为ABTS时的 21%),而以 2 ,6-二甲氧基为反应底物时其酶活为 2423.3 U/L(为ABTS
时的 16.8%),这说明了反应底物对漆酶酶活的测定结果有巨大的影响。
表 1　贝壳状革耳菌漆酶用不同的测定方法时测得的酶活
反应底物 酶活单位定义 a
nmol/s/L
酶活单位定义 b
U/L
酶活单位定义 c
U/L
酶活单位定义 d
U/L
ABTS 240467 14428 1.6×108 1.0×108
2 , 6-二甲氧基苯酚 4039 2423 2.1×107 1.3×107
紫丁香醛连氮 50481 3029 5.5×107 3.0×107
邻甲联苯胺 — — 3.9×107 1.3×108
　注:a ,b , c ,d分别代表以上四种酶活单位定义方法 。
反应底物不同 ,漆酶对底物的亲和力也会不一样。Km(米氏常数)的大小可以反映
出漆酶对底物亲和力的大小(见表 2)。Km 值越小 ,亲和力越大 ,漆酶对底物的氧化率
也就越高。贝壳状革耳菌漆酶与 ABTS 、紫丁香醛连氮 、邻甲联苯胺 、2 ,6-二甲氧基苯
酚反应的 Km 分别为 0.0116(mmol/L)-1 , 14.1095(mmol/L)-1 , 0.1415(mmol/L)-1 ,
0.1011(mmol/L)-1 ,这说明贝壳状革耳菌漆酶对 ABTS 的亲和力远大于其它三种反应底
24　　　　　　　　　　　　　　　　广 州化 学　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷　　
物尤其是紫丁香醛连氮 ,在一定的程度上暗示了测定 Panus conchatus 漆酶酶活时 ,以
ABTS为反应底物较其它三种底物好 。同时我们发现当该酶与 Km 常数最大的紫丁香
醛连氮反应时 ,只有当酶液稀释倍数及反应时间适当时 ,吸光度随反应时间变化才基本
上呈直线变化(如图 5)。而与 ABTS 、2 ,6-二甲氧基苯酚及邻甲联苯胺反应时 ,吸光度
随反应时间变化呈直线变化的趋势并不因酶液稀释倍数的不同或反应时间的变化而改
变(如图 6),这与文献报道一致。一般来说 ,酶催化反应属于零级反应 ,反应过程中吸
光度随反应时间的变化呈直线变化 。
表 2　贝壳状漆酶与不同底物反应时的动力学参数
反应底物 米氏常数 Km(mmol/L)-1
最大反应速率Vmax
OD/min 线性相关性 R
ABTS 0.0116 188.41 0.9987
紫丁香醛连氮 14.1095 3179.90 0.9852
邻甲联苯胺 0.1415 12.00 0.9883
2 , 6-二甲氧基苯酚 0.1011 54.24 0.9995
为了进一步了解这种差异对酶活测定结果的影响情况 ,取图 5中 a , b , c曲线中的
直线段计算酶活 ,其值分别为 3278U/L , 3210U/L , 3110U/L ,相对误差分别为 2.46%,
0.34%, -2.78%。若只考虑反应时间 ,取反应后前 5min(按一般方法)计算酶活 ,则其
相对误差分别为-26.5%, 21.1%, -5.0%,远远大于取直线段计算的误差。据报道 ,
Kadhim等[ 6]以紫丁香醛连氮为底物测 Coriolus versicolor 漆酶酶活时 ,取反应后前 10min
内吸光度的变化计算酶活 ,显然若以此法来测定 Panus conchatus漆酶酶活 ,其误差则会
更大 。因此若需以紫丁香醛连氮为反应底物测 Panus conchatus 漆酶酶活时 ,应考虑酶
液的稀释倍数及反应时间 ,这也说明了紫丁香醛连氮不适宜做测定 Panus conchatus 漆
酶酶活的反应底物。
图 5　不同的酶液稀释倍数条件下 , 紫丁香醛
连氮与贝壳状革耳菌漆酶反应时吸光度
与反应时间的变化关系图
a 为原酶液稀释 247.5 倍;b 为原酶液稀释330倍;
c为原酶液稀释 495 倍
图 6　不同的酶液稀释倍数条件下 , ABTS 与贝
壳状革耳菌漆酶反应时吸光度随反应时
间的变化关系图
d为原酶液稀释 792倍 , e为原酶液稀释 1600倍
　　
25　第 4期　　 　 　　　 　胡平平等:贝壳状革耳菌漆酶酶活测定方法分析　　 　　　　　　　　　 　　
2.3　酶活单位定义对 Panus conchatus漆酶酶活测定结果的影响
除反应底物和反应条件外 ,漆酶酶活单位定义的方法也是影响漆酶酶活大小的重
要因素 。从文献上看 ,酶活单位的定义大致可分为四类:a.每秒钟改变底物 1nanomol或
1nanocatal(nmol/ s或 nkat/s)[ 7] ;b.每分钟内生成 1μmol反应物所需的酶液[ 2] ;c.每分钟
内引起0.001吸光度的改变[ 1] ;d.每分钟每毫升的酶液引起 0.001 吸光度的改变[ 8] 。
根据四种酶活单位定义 ,漆酶酶活的计算公式分别为:
A=16.7×B 　　B =10
6×V总×ΔA
V酶×ε×Δt 　　C=10
3×ΔA
V酶×Δt 　　D =10
6×ΔA
V
2酶×Δt
式中:A , B , C , D 依次代表上述四种酶活单位定义方法所测得的酶活;V总 、V酶分别代
表反应体系的总体积及反应酶液的体积;ε为吸光系数 。
从以上公式可看出:无论酶液体积及反应总体积如何变化 ,对于同一种底物来说 ,
A总是 B的 16.7倍 ,但 B与 C或 D之间关系并非如此简单 ,它与反应酶的体积及反应
的总体积有关 ,这也说明了当酶活单位定义为 b时测得漆酶与某种底物反应具有最大
的酶活数值 ,一定意味着酶活单位定义为 a时也具有同样的结果 ,但并不意味着当酶活
单位定义为 d或 c时该漆酶与此种底物反应也具有最大的酶活数值 ,这一点在表 1中
已得到充分的体现:当酶活单位定义方法为 b时 ,在四种反应底物中 ,ABTS为底物时测
得 panus conchatus漆酶酶活最大 ,与酶活单位定义为 a 时所得结果一致 ,但以 d方法定
义酶活单位时 ,以紫丁香醛连氮为底物时测得的 panus conchatus漆酶酶活值最大。酶
活单位定义不同 ,漆酶酶活的数值也不同 ,甚至相差很大 ,如测 panus conchatus漆酶酶
活时 ,d方法所得酶活值与 b方法所得酶活值相差约 104。
3　结论
反应体系的酸度对 panus conchatus 漆酶酶活的测定结果有很大的影响。
panus conchatus漆酶与 ABTS反应的最适 pH 值为 3.0 ,而与紫丁香醛连氮 、2 ,6-二甲氧
基苯酚和邻甲联苯胺反应的最适 pH值均为 4.0。该酶与 ABTS的亲和力最大 ,而与紫
丁香醛连氮的亲和力最小 ,同时从反应时间与吸光度的变化关系上看 ,紫丁香醛连氮不
适宜作测定 panus conchatus 漆酶酶活的反应底物 , 若以紫丁香醛连氮为底物测
panus conchatus漆酶酶活时 ,则需考虑酶液的稀释程度及反应时间。另外 ,酶活单位定
义对 panus conchatus漆酶酶活的数值有很大的影响 ,其值可相差 104。
参　考　文　献
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Methods of Assaying Laccase Activity by Panus Conchatus
HU Ping-ping , 　FU Shi-yu＊ , 　LI Guang-ri
(Laboratory of Cellulose and Lignocellulosic Chemistry ,Guangzhou Institute of Chemistry ,
Chinese Academy of Sciences ,Guangzhou 510650 ,China)
Abstract:The data of laccase activity was greatly different according to the definition of laccase
activity unit pH and substrates in reaction.The optimum pH for Panus conchatus laccase reacting
with 2 ,6-dimethoxyphenol , o-tolidine , syringaldazine and ABTS were 4.0 , 4.0 , 4.0 , 3.0
respectively , and the Km were 0.0116 (mmol · L)-1 , 0.1011 (mmol · L)-1 ,
0.1415(mmol·L)-1 , 14.1095(mmol·L)-1 separately.It was also found that syringaldzine was
unfit for Panus conchatus laccase activity assay.
Key words:Panus conchatus;laccase;assaying method
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