全 文 ：赶黄草对体外诱导的酒精性脂肪肝细胞的影响
袁叶飞, 胡祥宇, 欧贤红 1
（泸州医学院：药物化学教研室；1心肌电生理学研究室, 四川泸州 646000）
摘 要 目的：建立酒精性脂肪肝细胞模型，探讨赶黄草体外对酒精性脂肪肝细胞的影响。 方法：采用 0.5%乙醇和 0.01%的
硫酸亚铁（FeSO4)加入 L-02 正常人肝细胞培养液，建立酒精性脂肪肝细胞模型。采用 CCK-8 方法筛选赶黄草的最佳作用浓度，
利用酒精性脂肪肝细胞模型评价赶黄草体外对酒精性脂肪肝细胞的作用。 结果：用含 0.5%的乙醇和 0.01%的 FeSO4的 RPMI-
1640 培养液诱导 L-02 正常人肝细胞，诱导至第 3 代，即可使肝细胞产生明显甘油三酯堆积。 CCK-8 方法筛选赶黄草的最佳作
用浓度为 40μg·ml-1，40μg·ml-1的赶黄草可显著降低酒精性脂肪肝细胞的甘油三酯。结论：采用 0.5%乙醇和 0.01%硫酸亚铁混合
物体外诱导 L-02 正常人肝细胞，可短时间内建立酒精性脂肪肝细胞模型，赶黄草有减轻体外诱导的酒精性脂肪肝细胞脂肪变
的作用。
关键词 酒精性脂肪肝；细胞模型；赶黄草
中图分类号 R931;R575 文献标识码 A 文章编号 1000-2669（2013）1-0035-04
Effect of Chinense Pursh Penthorum on cells of alcoholic fatty liver
induced by ethanol in vitro
Yuan Yefei，Hu Xiangyu，Ou Xianhong1
Department of Medicinal Chemistry;1Laboratory of Myocardioelectrophysiology，Luzhou Medical College
Abstracts Objective:To establish alcoholic fatty liver cell model，and to explore the therapeutic effect of
Chinese Pursh Penthorum on alcoholic fatty liver in vitro. Methods:The alcoholic fatty liver cell model was estab-
lished by treating human liver cell L-02 with 0.5% ethanol and 0.01% FeSO4. CCK-8 assay was used to screen
the optimal concentration of Chinese Pursh Penthorum. The therapeutic effect of Chinese Pursh Penthorum was e-
valuated on alcoholic fatty liver cell model. Results:When L-02 cells were induced to the third generation with
0.5% ethanol and 0.01% FeSO4 in RPMI-1640 medium, triglyceride obviously accumulated in cells. The optimal
concentration of Chinese Pursh Penthorum screened by CCK-8 assay was 40μg·ml -1,under this concentrarion
triglyceride in alcoholic fatty liver cells was significantly reduced. Conclusion:The alcoholic fatty liver cell model
can be established by 0.5% ethanol and 0.01% FeSO4 in vitro in a short period of time.Chinese Pursh Penthorum.
is helpful to therelief of steatosis of alcoholic fatty liver induced in vitro.
Key words Alcoholic fatty liver; Cell model; Chinese Pursh Penthorum
作者简介：袁叶飞（1973-），男，教授，博士
酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）是由于
长期、过量饮酒导致的肝脏受损，肝细胞内脂质过度
堆积的病变过程 ， 其主要特征表现为甘油三酯
（triglyceride，TG）在肝细胞内的过度沉积 [1]。 酒精性
脂肪肝可经脂肪性肝炎、 肝纤维化最终转化为肝硬
化，迄今尚无防治该病的特效药物。
赶黄草为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜
Penthorum Chinense Pursh 的干燥地上部分。 史载于
明《救荒本草》，现收载于《中华人民共和国卫生部部
颁标准中药成方制剂十三册》附录。其性平，味苦、微
辛，为苗族民间草药，具有清热、利湿、解毒、活血、平
肝、健脾等作用，广泛用于治疗各型肝炎、胆囊炎、脂
肪肝等 [2]。 前期我们建立了酒精性脂肪肝大鼠模
型， 并研究了赶黄草的体内防治酒精性脂肪肝的作
用[3,4]。 本试验采用 0.5%乙醇和 0.01%硫酸亚铁体外
诱导 L-02 正常人肝细胞,建立酒精性脂肪肝细胞模
型，研究赶黄草是否具有减轻体外 AFL 细胞脂肪变
论著
泸州医学院学报 2013 年 第 36 卷 第 1 期
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泸州医学院学报 2013 年 第 36 卷 第 1 期
Journal of Luzhou Medical College Vol.36 No.1 2013
的作用， 为筛选赶黄草治疗酒精性脂肪肝的有效成
分奠定基础。
1 材 料
1.1 药品与试剂
L-02 人正常肝细胞购自中国科学院细胞库，
RPMI-1640 培养液和胎牛血清 (FBS) 为美国 Gibco
BRL 公司产品， 油红 O 购自上海博光试剂公司，丙
氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、
甘油三酯 (TG) 试剂盒购自南京建成公司。 CCK-8
(Cell Counting Kit-8)试剂盒购自碧云天生物技术研
究所。 乙醇为无水乙醇，临用时以 RPMI-1640 培养
液稀释成合适浓度。
赶黄草药材，采自四川古蔺县，经泸州医学院庄
元春副教授鉴定为虎耳草科植物扯根菜 (Chinese
Pursh Penthorum) 的干燥全草。 赶黄草提取物，由 8
倍量体积分数 50%乙醇提取 3次，合并提取液，减压
回收溶剂，干燥而得。 临用时以 RPMI-1640 培养液
稀释成合适浓度。
1.2 细胞培养
细胞采用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 pH
7.4 的完全培养基， 在 37℃，5% CO2条件下常规培
养。 传代时用 0.1%胰蛋白酶溶液消化细胞，RPMI-
1640（含 10% FBS）培养液终止消化 ，低速离心机
1500r·min-1离心 5min， 弃上清液，RPMI-1640 （含
10% FBS）培养。
1.3 仪器
CO2 培养箱 (Thermo Forma)，美国产，型号 381；
倒置显微镜 (Olympus)，日本产，型号 CK40；酶标仪
(Biocel1)，澳地利产，型号 Sunrise；全自动生化分析
仪(OLYMPUSAU-600 ），日本产。
2 方 法
2.1 CCK-8法筛选最佳乙醇浓度
取对数生长期细胞 L-02 细胞， 以 0.1%胰蛋白
酶溶液消化细胞，离心，制成单细胞悬液，计数，调整
细胞浓度为 5×104个/ml，接种于 96 孔培养板中，每
孔 90μl， 置 37℃, 10%CO2 培养箱中培养 24h 后，试
验设乙醇组、硫酸亚铁（FeSO4）组和空白对照组。 乙
醇组每孔加 10μl 不同浓度的乙醇，乙醇终浓度分别
为 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%； FeSO4 组每孔加
10μl 0.1%的 FeSO4，FeSO4终浓度为 0.01%。 对照组
加等体积的含 FBS10%的 RPMI-1640，培养 48h 后，
每孔加入 10μl CCK-8，继续培养 1h，采用酶标仪在
波长 450nm处检测各孔吸光度值 (OD值)（每组设 4
个复孔，独立重复三次）。 按下式计算各种药物浓度
下 L-02细胞的活性。并在光学显微镜下进行细胞的
形态学观察。
细胞活性=(试验组 OD 值/对照组 OD 值)×100%
2.2 酒精性脂肪肝细胞模型的建立
取对数生长期 L-02 细胞， 以 0.1%胰蛋白酶溶
液消化细胞，离心，制成单细胞悬液，计数，调整细胞
浓度为 5×104个/ml。 接种 L-02细胞于 20ml 培养瓶
内，设空白对照组、阴性对照组和模型组。 空白对照
组：用 RPMI-1640(含 10%FBS 液)培养基培养；阴性
对照组：用含 0.01%FeSO4的 RPMI-1640(含 10%FBS
液)培养基培养；模型组：用最佳浓度乙醇及 0.01%
FeSO4的 RPMI-1640(含 10% FBS 液培养基培养，培
养 3d 后，分别更换新的上述培养液再培养 3d，之后
便以 6d为周期进行诱导，传代。 在倒置显微镜下观
察细胞浆内变化。以最佳乙醇浓度诱导至第 3代，并
命名为 H3。试验重复 3次，每组 4个培养瓶。随后分
成两部分， 一部分油红 O 染色观察脂滴数量, 收集
培养液用 OLYMPUSAU-600 全自动生化分析仪测
定 ALT和 AST的变化，确定有无肝细胞损伤。第二部
分各组细胞冻融, 收集细胞冻溶液用 OLYMPUSAU-
600 全自动生化分析仪测定其中 TG的含量[5]。
2.3 CCK-8法筛选赶黄草提取物最佳浓度
取对数生长期细胞 H3 细胞， 以 0.1%胰蛋白酶
溶液消化细胞，离心，制成单细胞悬液，计数，调整细
胞浓度为 5×104个/ml，接种于 96 孔培养板中，每孔
90μl，置 37℃, 10%CO2培养箱中培养 24h 后，试验
设空白对照组和用药组。 空白对照组： 仅以含 10%
PBS 的 RPMI-1640 培养液培养；用药组：不同浓度
的赶黄草提取物加入含 10%PBS 的 RPMI-1640 培
养液培养， 赶黄草提取物终浓度分别为 10、20、40、
80、160μg·ml-1。 各组置 37 ℃, 10%CO2 培养箱中培
养 48h 后，每孔加入 10μl CCK-8，继续培养 1h，采
用酶标仪在波长 450nm 处检测各孔吸光度值 (OD
值)（每组设 4 个复孔，独立重复三次）。 按下式计算
各种药物浓度下 H3 细胞的活性。 并在光学显微镜
下进行细胞的形态学观察。
细胞活性=(试验组 OD 值/对照组 OD 值)×100%
2.4 赶黄草提取物对酒精性脂肪肝细胞的影响
取对数生长期细胞 H3细胞， 以 0.1%胰蛋白酶
溶液消化细胞，离心，制成单细胞悬液，计数，调整细
胞浓度为 5×104个/ml，接种于 96孔培养板中。 试验
设空白对照组和用药组。 空白对照组： 仅以含 10%
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PBS的 RPMI-1640培养液培养；用药组:最佳浓度的
赶黄草提取物加入含 10%PBS 的 RPMI-1640 培养
液培养。各组置 37 ℃, 10%CO2培养箱中培养，每 3d
更换一次培养液和药物， 观察 12d （每组设 4 个复
孔，独立重复三次）。各组细胞冻融, 收集细胞冻溶液
用 OLYMPUSAU-600 全自动生化分析仪测定其中
TG的含量[5]。
2.5 统计学方法
计量资料数据以 x±s 表示，应用 SPSS13.0 统计
软件进行统计分析， 多组间比较采用单因素方差分
析，两组间比较采用 t检验。
3 结 果
3.1 不同浓度的乙醇作用于 L-02 人正常肝细胞株
48h后的 CCK-8检测结果
试验结果表明，0.01%硫酸亚铁对细胞活性无影
响。 0.1%和 0.3%的低浓度乙醇不影响肝细胞分裂生
长， 而且还表现出微弱的促进作用。 0.7%乙醇组和
0.9%乙醇组的活细胞数减少较多， 细胞活性分别降
低 14.9%和 26.4%， 且在显微镜下观察发现细胞边
缘不清晰，细胞内颗粒较多，细胞大量浮起和坏死；
0.5%组与对照组相比，活细胞数仅减少 5.6%，浮起
和坏死细胞较少，因此本试验选择 0.5%为最佳乙醇
诱导浓度（表 1）。
表 1 不同浓度的乙醇对 L-02 肝细胞生长的影响（x±s,n=12）
组别 吸光度 细胞活性
对照组 0.72±0.028 -
0.01％硫酸亚铁 0.72±0.019 100%
0.1%乙醇 0.75±0.022 104.2%
0.3%乙醇 0.73±0.025 102.7%
0.5%乙醇 0.68±0.019 94.4%
0.7%乙醇 0.62±0.023 85.1%
0.9%乙醇 0.53±0.021 73.6%
3.2 细胞模型的鉴定
3.2.1 细胞 TG水平及其 ALT和 AST泄漏量测定
试验结果表明，细胞经酒精诱导至第 3 代后，与
空白对照组比较， 阴性对照组细胞 TG 水平及其
ALT和 AST泄漏量，差异均无统计学意义（P>0.05），
表明 0.01%FeSO4 对人正常肝细胞株 L-02 无影响。
与空白对照组比较， 模型组 TG 显著升高， 升高了
107%，两者比较，有统计学意义 （P<0.01），表明经
0.5%乙醇及 0.01%FeSO4 诱导后的 H3 细胞脂质过
氧化，TG比正常肝细胞 L-02 细胞显著增多；但 ALT
及 AST 泄漏量与空白对照组比较， 无统计学意义
（P>0.05）。 TG增加，转氨酶无显著变化，这些现象与
人类及实验动物酒精性脂肪肝的表型特征很相符
（见表 2）。
表 2 细胞 TG 水平及其 ALT 和 AST 泄漏量（x±s,n=12）
组别 TG/mmol·L-1 ALT/U·L-1 AST/U·L-1
空白对照组 0.28±0.018 5.3±0.24 3.1±0.26
阴性对照组 0.27±0.018 5.2±0.30 3.2±0.25
模型组 0.58±0.062a 5.5±0.42 2.9±0.31
注：a 与空白对照组比较， P<0.01
3.2.2 油红 O染色光学显微镜观察结果
油红 O 染色后在光镜下观察，空白对照组和阴
性对照组 L-02 细胞核仁清楚可见，胞浆无明显红染
或淡染；0.5%乙醇和 0.01%FeSO4诱导后的 H3 细胞
胞浆中大量被染成橘红色的颗粒， 分布在靠近细胞
膜的区域，使整个细胞形态类似“印戒”，提示有脂滴
潴留在细胞内， 说明 0.5%乙醇和 0.01%FeSO4诱导
后的 H3细胞发生了脂肪变（附图）。
3.3 CCK-8法筛选赶黄草提取物的最佳作用浓度
不同浓度的赶黄草对 H3 细胞都有一定的抑制
作用，使 H3 细胞活性降低，比较各组浓度对 H3 细
胞活性的影响，发现随着浓度的增加，细胞活性先出
现降低，到 40μg·ml-1时，细胞活性有所升高，随后细
胞活性又随着浓度的增加而降低。 因此本试验选择
40μg·ml-1时作为赶黄草对体外诱导的酒精性脂肪
肝细胞的作用浓度（表 3）。
A.空白对照组 L-02 细胞 B.阴性对照组 L-02 细胞 C.模型组 H3 细胞
附图 光镜下油红 O 染色结果（×200）
A B C
第 1 期 袁叶飞等：赶黄草对体外诱导的酒精性脂肪肝细胞的影响 37
泸州医学院学报 2013 年 第 36 卷 第 1 期
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表 3 不同浓度的赶黄草提取物对 H3 细胞生长
的影响（x±s，n=12）
组别 吸光度 细胞活性
对照组 0.68±0.031 -
10μg·ml-1 0.63±0.022 92.6%
20μg·ml-1 0.60±0.018 88.2%
40μg·ml-1 0.65±0.029 95.6%
80μg·ml-1 0.59±0.039 86.8%
160μg·ml-1 0.52±0.029 76.5%
3.4 赶黄草提取物对酒精性脂肪肝细胞的影响
经 40μg·ml-1的赶黄草提取物处理后，与处理前
H3组比较，细胞内 TG 极显著减少（P<0.01），降低了
31.0%,表明赶黄草可以显著减轻体外诱导的酒精性
脂肪肝细胞脂肪变的作用， 为赶黄草临床治疗酒精
性脂肪肝提供了依据（表 4）。
表 4 赶黄草提取物作用前后细胞内 TG 水平（x±s,n=12）
组别 处理前 H3 组 空白对照组 赶黄草处理组
TG/mmol·L-1 0.58±0.062 0.54±0.051 0.40±0.025a
注：a 与处理前 H3 组比较， P<0.01
4 讨 论
本研究在建立酒精性脂肪肝的细胞模型过程
中，结合细胞形态观察，采用了 CCK-8 法来筛选对
肝细胞活性有一定程度影响， 但又没有明显肝细胞
损伤的浓度作为诱导细胞形成脂肪肝的最佳浓度。
发现 0.1%和 0.3%的低浓度乙醇不影响肝细胞分裂
生长， 而且还表现出微弱的促进作用；0.7%和 0.9%
的乙醇会导致细胞大量浮起和坏死， 活细胞数显著
减少；0.5%乙醇只导致活细胞数稍有减少，没有明显
的浮起和坏死细胞，所以本试验选择 0.5%为最佳乙
醇诱导浓度。
肝脏是储存铁的主要部位， 也是铁诱导损伤的
靶器官。 酒精性脂肪肝时，肝铁含量增加，肝铁可进
一步增强肝组织和肝细胞的脂质过氧化损伤， 从而
加重脂肪肝[6]。廖于等[7]采用 0.28%乙醇诱导 L-02正
常人肝细胞，诱导至第 30 代，建立了酒精性脂肪肝
细胞模型。 本试验采用 0.5%乙醇和 0.01%的硫酸亚
铁诱导 L-02 正常人肝细胞，诱导至第 3 代，细胞内
累积了大量 TG，形成酒精性脂肪肝细胞，大大缩短
了复制细胞模型周期。 0.5%乙醇和 0.01%的硫酸亚
铁诱导的细胞水平的实验性酒精性脂肪肝与酒精性
脂肪肝患者和动物酒精性脂肪肝具有基本一致的病
理现象，如细胞内出现大量脂滴，形成印戒样细胞而
无转氨酶升高等炎症性损伤变化[8]。 因此我们认为，
通过本试验方法， 能够建立有效的酒精性脂肪肝细
胞模型，作为与动物模型的相互补充手段，共同应用
于该疾病的发病机制、治疗方法、药物筛选以及药效
学研究。
前期我们已建立了酒精性脂肪肝大鼠模型，并
研究了赶黄草的体内防治酒精性脂肪肝的作用 [3,4]。
本试验采用 CCK-8 方法筛选赶黄草作用于酒精性
脂肪肝细胞的最佳作用浓度为 40μg·ml-1，40μg·ml-1
的赶黄草可显著降低酒精性脂肪肝细胞的甘油三
酯， 说明赶黄草可以减轻体外酒精性脂肪肝细胞模
型的脂肪变性， 为赶黄草临床治疗酒精性脂肪肝提
供了理论依据。
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