全 文 ：Chinese Journal of New Drugs 2015，24(10)
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中国新药杂志 2015 年第 24 卷第 10 期
［基金项目］ 国家“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09103-
408);西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2014SZ103)
［作者简介］ 高洁，女，硕士研究生，主要研究方向:中药药理。联系
电话:15228862592，E-mail:382985188@ qq． com。
［通讯作者］ 张琦，女，教授，主要从事新药研发工作。联系电话:
13540831071，E-mail:zhangqi8_8@ aliyun． com。
·实验研究·
高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定
红毛走马胎中百两金皂苷 B的含量
高 洁1，伍 红1，张承平2，张 琦1
(1 西南民族大学，成都 610041;2 四川恩威中医药研究开发有限公司，成都 610207)
［摘要］ 目的:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定不同产地红毛走马胎药材中
百两金皂苷 B 的含量。方法:样品以 50%乙醇超声提取，采用 HPLC-ELSD 法测定，色谱柱为 Symmetry C18
(150 mm ×4． 5 mm，5 μm);柱温为 30 ℃;流动相为甲醇-水(65∶ 35);流速为 0． 8 mL·min －1;ELSD漂移管温度
为 95 ℃;气体流速为 2． 0 L·min －1。结果:百两金皂苷 B的线性范围为 0． 268 ～ 2． 144 μg(r = 0． 999 8)，平均
加样回收率为 101． 9%，ＲSD为 1． 7 %(n = 6)。结论:本法操作简便，结果准确可靠。不同产地红毛走马胎
药材中百两金皂苷 B的含量全草在 2． 6% ～4． 5%之间;根和茎在 3． 7% ～6． 2%之间。
［关键词］ 百两金皂苷 B;红毛走马胎;高效液相色谱法;蒸发光散射检测;定量分析
［中图分类号］ Ｒ284． 1;Ｒ286． 91 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734(2015)10 － 1187 － 04
Determination of ardisiacrispin B in Ardisia mamillata by HPLC-ELSD
GAO Jie1，WU Hong1，ZHANG Cheng-ping2，ZHANG Qi1
(1 Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China;2 Sichuan Enwei Corporation
of Traditional Chinese Medicine Ｒesearch and Development，Chengdu 610207，China)
［Abstract］ Objective:To determine the content of ardisiacrispin B in Ardisia mamillata by high perform-
ance liquid chromatography with evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD)． Methods:Ｒaw material
powder of Ardisia mamillata was extracted by a ultrasound method with 50% ethanol． The separation was performed
on a Symmetry C18(150 mm ×4． 5 mm，5 μm)with methanol-water (65∶ 35)as the mobile phase at a flow rate of
0． 8 mL·min －1 and a colume temperature of 30 ℃ ． The temperature of drift tube was set at 95 ℃，and the gas flow
(air)was set at 2． 0 L·min －1 ． Ｒesults:The linear range of ardisiacrispin B was 0． 268 ～ 2． 144 μg (r = 0． 999 8)．
The average recovery was 101． 9% with ＲSD of 1． 7% (n = 6)． Conclusion:The method is convenient，accurate
and reliable． The content of ardisiacrispin B in Ardisia mamillata from different origins and sources is 2． 6% ～
4. 5% in the whole plant and 3． 7% ～6． 2% in root and stem，respectively．
［Key words］ ardisiacrispin B;Ardisia mamillata;HPLC;ELSD;determination
红毛走马胎为紫金牛科紫金牛属植物虎舌红
Ardisia mamillata Hance的干燥全草，既是著名的观
赏植物，又是我国民间常用草药，具有清热利湿、平
肝解郁、活血化淤的功效，其药用价值早在《本草纲
目》中就有记载，对治疗肝炎、风湿、小儿疳积等有
奇效［1］。现代药理研究表明，本品具有良好的抗肿
瘤活性［2］，其主要有效成分是百两金皂苷 B［3］，该成
分存在于同属朱砂根、百两金等多种植物中，其化学
名称为西克拉敏 A 3-O -α-L-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-
D-葡萄吡喃糖-(1→ 4)-［β-D-葡萄吡喃糖-(1→
2)-］-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。目前对该属植物的研
究热点主要集中在化学成分和抗肿瘤等活性方
面［4 － 10］，作者尚未见百两金皂苷 B 的定量分析方
法，为深入探讨红毛走马胎的提取工艺、成药性及药
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理活性，本实验从该药材中提取分离得到百两金皂
苷 B 单体，并按照对照品研究技术指导原则进行了
纯化及结构鉴定。本实验采用高效液相色谱-蒸发
光散射检测法(HPLC-ELSD)建立起红毛走马胎中
百两金皂苷 B 的定量分析方法，并对不同产地来源
的药材样本进行了测定，为红毛走马胎及同属含百
两金皂苷 B 药材的深入研究和新药开发提供新的
分析手段和参考数据。
仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪(包括 G1322A 在
线真空脱气机、G1311A 四元梯度泵、G1313A 自动
进样器、G1316A 柱温箱、G1314A DAD 检测器和
Chemstation色谱工作站，美国 Agilent 公司) ;Alltech
ELSD 2000 型蒸发光散射检测器;制备型高效液相
色谱仪(美国贝克曼库尔特) ，包含 SYSTEM GOLD
125P Solvent Module和 166p Detector等;Milli Q超
纯水器(美国 Milipore公司) ;Microfuge 18 台式离心
机(美国贝克曼库尔特有限公司) ;KQ 500DE 超
声清洗机(昆山市超声仪器有限公司，功率 300 W，
频率 40 kHz) ;BP 210D型十万分之一电子分析天
平(德国赛多利斯) ;过滤装置(Autoscience)及微孔
滤膜(0． 45 μm)。色谱柱:Waters Symmetry C18
(150 mm × 4． 5 mm，5 μm) ;Phenomenex Gemini C18
(150 mm × 4． 5 mm，5 μm) ;Alltech Altimma C18
(250 mm ×4． 5 mm，5 μm)。
红毛走马胎采自四川省不同地区，经张文锦、黄
静教授鉴定为虎舌红 Ardisia mamillata Hance 的全
草;部分药材样品购买于中药材市场或饮片公司;百
两金皂苷 B(自制，熔点:263 ～ 265 ℃，薄层色谱多
个展开及显色系统均显示一个斑点，采用 HPLC-
ELSD峰面积归一化法计算其质量浓度大于 98%，
符合定量分析用对照品纯度的质量要求) ;甲醇和
乙腈为色谱纯，水为高纯水;其余试剂均为分析纯。
方法与结果
1 对照品制备
红毛走马胎药材 60 ℃干燥，粉碎为粗粉，80%
乙醇提取，大孔吸附树脂及硅胶层析柱分离纯化，甲
醇重结晶，制备型高效液相色谱进一步分离纯化，收
集目标峰流出液，浓缩、干燥即得。本品采用熔点测
定、TLC和 HPLC等多种手段考察其纯度，采用水解
样品初步了解糖的组成，并经紫外光谱(UV)、红外
光谱(IＲ)、质谱(MS)、氢核磁共振(1H-NMＲ)及碳
核磁共振(13C-NMＲ)谱等鉴定确证结构，所得数据
与文献报道百两金皂苷 B一致。
2 色谱条件与系统适用性
固定相为十八烷基硅烷健合硅胶(Symmetry C18
柱:150 mm ×4． 5 mm，5 μm) ;流动相为甲醇-水(65∶
35) ;柱温为 30 ℃;体积流量为 0． 8 mL·min －1;蒸发
光散射检测器的漂移管温度为 95 ℃;气体流速为
2． 0 L·min －1;进样体积为 10 μL;理论板数按百两金
皂苷 B计算≥5 000。对照品和红毛走马胎药材的
色谱图见图 1。
1:百两金皂苷 B
图 1 对照品(A)、红毛走马胎药材(B)的 HPLC色谱图
3 对照品溶液的制备
精密称取百两金皂苷 B 对照品 10． 72 mg 于
100 mL量瓶中，加 50%甲醇适量，超声(功率 300 W，
频率 40 kHz)使溶解，相同溶剂稀释至刻度，摇匀，
即得。
4 供试品溶液的制备
取红毛走马胎药材粉末(过 3 号筛)0． 15 g，精
密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入 50% 乙醇
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50 mL，超声(功率 300 W，频率 40 kHz)处理 60 min，
取出，放冷，称重，用 50%乙醇补足减失的重量，摇
匀，5 000 r·min －1离心 10 min，取上清液，即得。
5 测定方法
分别精密吸取百两金皂苷 B 对照品溶液 5 和
20 μL;红毛走马胎供试品溶液 10 μL;注入液相色谱
仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
6 线性范围
分别精密吸取“3”项下的百两金皂苷 B 对照品
溶液 2． 5，5，7． 5，10，12． 5，15，17． 5，20 μL 注入液相
色谱仪，测定峰面积值，以进样量的对数(X)为横坐
标，峰面积对数(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归
方程:Y = 1． 782X + 6． 912，r = 0． 999 8。结果显示，
百两金皂苷 B的进样量在 0． 268 ～ 2． 144 μg 范围内
呈良好的线性关系。
7 仪器精密度
取百两金皂苷 B 对照品溶液，在上述色谱条件
下进样 10 μL测定峰面积，重复进样 6 次，测得平均
峰面积分别为 1 169 mAU·s，ＲSD 为 0． 9%，表明仪
器精密度良好。
8 稳定性
取同一红毛走马胎供试品溶液，分别在 0，1，2，
4，6，8 h进样 10 μL，测定百两金皂苷 B 的峰面积，
测得平均峰面积分别为 1 227 mAU·s，ＲSD 为
0. 8%，表明供试品溶液在 8 h内稳定。
9 重复性
取同一批红毛走马胎药材粉末，平行操作 6 份，
按照“4”项下方法制备样品溶液，按照“2”和“5”项
下的色谱条件与方法测定，用外标两点法对数方程
计算含量，结果平均含量为 37． 9 mg·g －1，ＲSD 为
1. 1%，表明重复性良好。
10 加样回收率
减半量称取已知含量的红毛走马胎药材粉末
0． 075 g，置 50 mL 具塞锥型瓶中精密称定，平行操
作 6 份，分别以样品百两金皂苷 B 质量的 1∶ 1比例
精密加入对照品溶液(570． 6 μg·mL －1)5． 0 mL，蒸
干溶剂，按“4”项下方法制备，按“2”和“5”项下的色
谱条件测定并计算回收率，结果见表 1。
表 1 加样回收试验结果 n = 6
样品称量 / g 样品中含量 /mg 加入量 /mg 测定值 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% ＲSD /%
0． 074 8 2． 835 2． 853 5． 772 102． 9 101． 9 1． 7
0． 075 3 2． 854 2． 853 5． 72 100． 5
0． 074 5 2． 824 2． 853 5． 782 103． 7
0． 075 4 2． 858 2． 853 5． 691 99． 3
0． 075 1 2． 846 2． 853 5． 797 103． 4
0． 075 2 2． 850 2． 853 5． 754 101． 8
11 供试品测定
取各批红毛走马胎药材粉末 0． 15 g，平行操作
3 份，按照“4”项下的方法制备供试品溶液，按照
“2”和“5”项下的色谱条件测定并计算百两金皂苷
B的质量分数，不同产地红毛走马胎药材中百两金
皂苷 B的测定结果见表 2。
表 2 不同产地红毛走马胎药材中百两金皂苷 B的测定结果 n = 3
编号 药材部位 来源 采 /收集时间 含量 /mg·g － 1 ＲSD /%
1 全草 四川乐山 购买于 2006 年 8 月 34． 8 0． 79
2 全草 四川犍为 购买于 2006 年 11 月 25． 8 0． 83
3 全草 四川乐至 购买于 2007 年 3 月 30． 1 0． 79
4 全草 四川长宁县万玲乡 采集于 2007 年 5 月 27． 4 0． 68
5 全草 四川江安县万里乡 采集于 2007 年 5 月 33． 0 0． 66
6 全草 四川高县罗场镇 采集于 2007 年 5 月 35． 2 0． 59
7 全草 四川宜宾泥南乡 采集于 2007 年 5 月 29． 9 0． 61
8 全草 四川省砚山中药饮片有限公司 购买于 2007 年 8 月 45． 2 0． 94
9 全草 四川省乐山健康药业有限公司 购买于 2007 年 9 月 36． 2(n = 2) 0． 48
10 全草 四川乐至 购买于 2008 年 5 月 45． 1(n = 2) 0． 72
11 根、茎 同 1# 购买于 2006 年 8 月 50． 5 0． 62
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续表 2
编号 药材部位 来源 采 /收集时间 含量 /mg·g － 1 ＲSD /%
12 根、茎 四川雅安 收集于 2006 年 11 月 57． 2 0． 60
13 根、茎 四川乐至 购买于 2006 年 8 月 54． 1 0． 50
14 根、茎 云南丽江 收集于 2006 年 8 月 36． 9 0． 57
15 根、茎 同 3# 购买于 2007 年 3 月 43． 7 0． 71
16 根、茎 四川乐山 购买于 2007 年 9 月 55． 1 0． 34
17 根、茎 云南瑞丽 收集于 2007 年 5 月 47． 9(n = 2) 0． 77
18 根、茎 成都荷花池中药材市场 收集于 2007 年 7 月 61． 7(n = 2) 0． 51
讨 论
百两金皂苷 B为五环三萜皂苷化合物，在紫外
区末端有吸收，建立分析方法时首先考虑了紫外检
测(205 nm) ，但目标峰响应值小，灵敏度差。蒸发
光散射检测器是一种质量型通用检测器，吸收峰可
反映中药成分含量高低，且基线平稳。其主要参数
有漂移管温度和气体流速，本实验以 5 ℃为递增值，
考察漂移管温度在 70 ～ 120 ℃条件下同一供试品溶
液百两金皂苷 B 的峰高和噪声情况。结果显示，漂
移管温度为 95 ℃时，其信噪比较佳。另一方面，以步
长 0． 2 L·min －1考察了气体流速在 1． 2 ～ 2． 4 L·min －1
时对响应值和噪声的影响。结果发现，气体流速降
低，其响应值增高，但噪声也随之增加，其信噪比在
2． 0 L·min －1时较佳。
样品提取方式比较了回流与超声的提取效果，
结果差异不大，故确定为更简便的超声提取法。提
取溶剂考察了水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲
醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇等对红毛走
马胎中百两金皂苷 B的提取效果，结果以 50%乙醇
最佳，70%乙醇和 50%甲醇较佳;提取时间考察了
30，45，60，75，90 min 的提取效果，结果 15 个测定结
果的 ＲSD为 1． 8%，总的趋势是随超声时间的延长，
含量逐渐增加，但60 min后差异很小。最终确定的前
处理方法是以 50%乙醇为溶剂，超声提取 60 min。
耐用性试验考察了 3 根不同品牌和长度的 C18
柱对样品的测定，均获得满意的效果。其柱温在
25 ～ 35 ℃范围变化，测定结果均良好，流动相中甲
醇-水的比例变化在 70∶ 30 ～ 60∶ 40 范围内调整，除
保留时间变化外，其余不影响测定结果。说明本方
法耐用性良好。
本实验建立的分析方法操作简便，结果准确可
靠。方法学验证符合定量分析要求，耐用性良好。样
品测定结果显示:受土壤、气候、生态环境等地域因素
的影响，不同产地红毛走马胎药材中百两金皂苷 B的
含量存在较大差异，其全草质量分数在 2． 6% ～4． 5%
之间;根和茎的质量分数在 3． 7% ～6． 2%之间。
志谢:感谢四川大学黄静教授在百两金皂苷 B对照品结
构鉴定中的帮助。
［ 参 考 文 献 ］
［1］ 王国强． 全国中草药汇编［M］． 第 3 版． 北京:人民卫生出版
社，2014:265．
［2］ 黄秀华，张丹，邓国兵． 红毛走马胎提取物体外抗肿瘤的实验
研究［J］． 四川生理科学杂志，2009，31(4) :149 － 150．
［3］ HUANG J，OGIHAＲA Y，ZHANG H，et al． Triterpenoid Sapo-
nins From Ardisia Mamillata［J］． Phytochemistry，2000，54(8) :
817 － 822．
［4］ TANG HF，LIN HW，CHEN XL，et al． Cytotoxic triterpenoid sap-
onins from Ardisia Pusilla［J］． Chin Chem Lett，2009，20(2) :
193 － 196．
［5］ TANG HF，YUN J，LIN HW，et al． Two new triterpenoid saponins
cytotoxic to human glioblastoma U251MG cells from Ardisia pusil-
la［J］． Chem Biodivers，2009，6(9) :1443 － 1452．
［6］ TIAN Y，TANG HF，QIU F，et al． Triterpenoid Saponins from
Ardisia pusilla and their Cytotoxic Activity［J］． Planta Med，
2009，75(1) :70 － 75．
［7］ LI M，WEI S Y，XU BG，et al． Pro-apoptotic and microtubule-dis-
assembly effects of ardisiacrispin(A + B) ，triterpenoid saponins
from Ardisia crenata on human hepatoma Bel-7402 cells［J］． J
Asian Nat Prod Ｒes，2008，10(8) :729 － 736．
［8］ ZHENG ZF，XU JF，FENG ZM，et al． Cytotoxic triterpenoid sap-
onins from the roots of Ardisia crenata［J］． J Asian Nat Prod
Ｒes，2008，10(9) :833 － 839．
［9］ CHANG X，LI W，JIA Z，et al． Biologically active triterpenoid
saponins from Ardisia japonica［J］． J Nat Prod，2007，70(2) :
179 － 187．
［10］ BLOOＲ SJ，QI L． Cytotoxic saponins from New Zealand Myrsine
species［J］． J Nat Prod，1994，57(10) :1354 － 1360．
编辑:周卓 /接受日期:2015 － 04 － 14