全 文 ：黄瓜霜霉菌卵孢子形成及生活力影响因素研究
张艳菊1，苗 笛1，刘艳玲1，李永刚1，周秀艳2，刘 东2
（ 1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要：人工模拟条件下研究影响黄瓜霜霉菌卵孢子形成和生活力的因素。结果表明，对黄瓜霜霉菌卵孢子
形成的影响因素依程度大小依次为温度、接触物、叶片成熟度和湿度；其中温度为4 ℃，相对湿度为90％，与土
壤接触的底叶产生卵孢子的数量最多。通过噻唑兰（MTT）染色法对黄瓜霜霉菌卵孢子生活力（萌动率、休眠率和死
亡率）进行测定。结果表明，温度、KMnO4、H2O2、叶组织液及土壤浸渍液对卵孢子的萌动率均有影响，其中以
36 ℃高温、0.4% KMnO4、0.7% H2O2、叶组织液处理9 d和土壤浸渍液1􀏑2处理9 d卵孢子萌动率最高，-20 ℃低温
处理卵孢子的萌动率最低。
关键词：黄瓜霜霉菌；卵孢子形成；卵孢子生活力
中图分类号：S436.421.11 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2013）10-0050-06
张艳菊,苗笛,刘艳玲,等.黄瓜霜霉菌卵孢子形成及生活力影响因素研究[J].东北农业大学学报, 2013, 44(10): 50-55.
Zhang Yanju, Miao Di, Liu Yanling, et al. Study on affecting factors of formation and vitality of Pseudoperonospora cubensis
oospores[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2013, 44(10): 50-55. (in Chinese with English abstract)
Study on affecting factors of formation and vitality of Pseudopero-
nospora cubensis oospores/ZHANG Yanju1, MIAO Di1, LIU Yanling1, LI Yonggang1,
ZHOU Xiuyan2, LIU Dong2 (1. School of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin
150030, China; 2. School of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
收稿日期：2013-07-16
基金项目：国家自然科学基金项目（31171792）
作者简介：张艳菊（1968-），女，教授，博士，博士生导师，研究方向为植物病原生物学。E-mail: zhangyanju1968@163. com
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第44卷第10期 44(10): 50~55
2013年10月 Oct. 2013
[ 参 考 文 献 ]
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网络出版时间 2013-10-28 14:39:22 [URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20131028.1439.013.html
由藻界卵菌门古巴假霜霉菌[Pseudoperonospora
cubensis（Berk.&M.A.Curtis）Rostovzev]侵染引起的
霜霉病是黄瓜生产的毁灭性病害 [1]。该病传播速
度快、涉及范围广，在全世界 70多个国家均有发
生，对黄瓜生产威胁极大[2]。
黄瓜霜霉菌无性繁殖产生的孢子囊抗逆性
差、寿命短、自然条件下难以越冬。有性生殖是
通过藏卵器与雄器交配产生厚壁卵孢子，卵孢子
能够抵抗不良环境条件，在病残体及病田土壤中
越冬，成为第二年的初侵染源。但在自然条件
下，黄瓜霜霉菌的卵孢子较少见。Hiura等最初在
日本发现霜霉菌卵孢子存在[3]，其后印度Mahrshi、
奥地利Bedlan、伊朗Zaker和以色列Cohen发现黄瓜
霜霉菌卵孢子[4-7]。陈其本等是我国最早在储存于温
室内的黄瓜干枯叶片上发现卵孢子[8]；傅淑云等对铁
岭、沈阳地区的大棚、温室及露地黄瓜上分别采集
病叶，发现病组织内存在卵孢子[9]。Zhang等在哈尔
滨、长春、沈阳、北京、聊城、银川、西宁、杨凌
等地均发现卵孢子，并对卵孢子越冬期生活力进行
监测[10-11]。
上述研究虽然在一些国家及地区发现黄瓜霜
霉菌卵孢子的存在，但均未对黄瓜霜霉菌卵孢子
形成及生活力的影响因素进行研究，也未见卵孢
子萌发的相关报道，因此卵孢子在黄瓜霜霉病的
生活史和病害循环中的作用尚未达成共识。本文
在人工模拟条件下研究黄瓜霜霉菌卵孢子形成和
生活力的影响因素，以期为研究卵孢子萌发条
件、揭示黄瓜霜霉病初侵染源奠定基础。
1 材料与方法
1.1 影响黄瓜霜霉菌卵孢子形成因素的研究
黄瓜霜霉病叶片采自哈尔滨市幸福乡光明村
蔬菜大棚内，取镜检无卵孢子形成的病叶进行试
验，试验在实验室人工室内模拟条件下进行。采
用正交试验设计，采用4因素4水平正交设计，其
因素水平如表1所示。
表1 试验因素和水平
Table 1 Test factors and levels
水平Levels
1
2
3
4
A温度（℃）Temperature
-20
4
10
25
B湿度（％）Humidity
50
80
90
100
C叶片成熟度Leaf maturity
10 d叶片
20 d叶片
30 d叶片
底叶
D接触物Contactant
土壤
沙子
沙土
空白
由表1可知，每处理15片黄瓜叶片，每处理3
次重复。温湿度处理可在冰箱和恒温箱中进行，叶
片采用实验网棚内健康植株生长10、20、30 d的叶
片和底叶（第 1片真叶），接触物的种类分为土壤、
沙子、沙土和空白（密度􀏑沙子>沙土>土壤）。7 d
后观察叶片卵孢子形成个数（cm-2）。
张艳菊等：黄瓜霜霉菌卵孢子形成及生活力影响因素研究第10期 · 51 ·
Abstract: The factors that affect oospore formation and vitality of Pseudoperonospora cubensis were
studied under the artificial simulation conditions. The results showed that the significance of factors affecting
oospores formation, arranged from high to low in turn, were temperature, contactant, leaf maturity and
humidity. The number of oospores formation was the largest in the condition of 4 ℃, 90% relative humidity
and rhizosphere leaf contact with soil. MTT staining was carried out to evaluate the vitality of oospores. The
results showed that temperature, KMnO4, H2O2, leaf tissue fluid and soil maceration extract could
significantly affect the germination rate of oospores. The highest germination rate was found in the condition
of 36 ℃, 0.4% KMnO4, 0.7% H2O2, treated with leaf tissue fluid for 9 d and 1􀏑2 soil maceration extract for 9
d. The lowest germination rate was found when treated the oospores at -20℃.
Key words: cucumber downy mildew (Pseudoperonospora cubensis); oospore formation; oospore
vitality
1.2 影响黄瓜霜霉菌卵孢子生活力的因素
1.2.1 黄瓜霜霉病叶片采集
在黑龙江省哈尔滨市东北农业大学香坊实验实
习基地黄瓜生长末期采集发生霜霉病的叶片，取镜
检有卵孢子形成的病叶进行试验，在实验室人工室
内模拟条件下进行。
1.2.2 霜霉菌卵孢子悬浮液制备
将含有卵孢子的病叶剪碎后称重，加入2~3倍
（V/W）0.02 mol·L- 1 pH 7的磷酸缓冲液，仔细搅
拌使碎叶浸润，室温放置 15 min，待叶片全部浸
润后放入-20 ℃冰箱内速冻 2 h，然后用匀浆机
（5 000 r·min-1）匀浆 20~30 min，至大多数叶肉细
胞、维管束组织均已破碎，而卵孢子仍然完整，即
可进行过滤。将匀浆液经 200目、300目、600目
筛网过滤，用蒸馏水冲洗筛网，收集滤液，
3 000 r·min-1离心3 min，倾去上清液，检查沉淀中
卵孢子数量[10, 12-13]。
1.2.3 卵孢子生活力测定
采用噻唑兰（MTT）染色法[14-15]。将卵孢子悬浮
液用 0.05％ MTT染色液于 36 ℃下染色 48 h，在显
微镜下观察，被染上蓝色为休眠后可以萌动的卵孢
子，玫瑰红色为处于休眠中的卵孢子，黑色和未染
上颜色的表示已死亡的卵孢子[16-17]。测定卵孢子萌
动率、休眠率和死亡率，每次记录不少于 50个卵
孢子，3次重复。
1.2.4 温度对霜霉菌卵孢子生活力的影响
温度设置：共设置-20、4、10、15、20、30
和 36 ℃ 7个处理，在冰箱和恒温箱中做温度预处
理，以不做温度预处理的 24 ℃为对照。取含有卵
孢子的黄瓜叶片做温度处理，温度处理时间分别为
1、3、5和 7 d，然后分别制成卵孢子悬浮液，
0.05% MTT于 36 ℃下染色 48 h后，测定卵孢子生
活力，3次重复。
1.2.5 KMnO4对霜霉菌卵孢子生活力影响
制备卵孢子悬浮液，分别用浓度为 0.1%、
0.2%、0.3%、0.4%和 0.5%的 KMnO4，50 r·min- 1
振荡处理 15 min，溶液过 500目筛网去除KMnO4，
用蒸馏水冲筛网收集卵孢子，再用蒸馏水反复
冲洗 3次，收集卵孢子制成悬浮液，0.05% MTT
于 36 ℃下染色 48 h，测定各处理卵孢子生活力，
以不用化学物质处理的卵孢子悬浮液为对照，3次
重复。
1.2.6 H2O2对霜霉菌卵孢子生活力的影响
用浓度分别为0.1%、0.3%、0.5%和0.7% H2O2
溶液， 50 r · min- 1振荡处理 3 min，其他步骤
同上。
1.2.7 叶组织提取液对霜霉菌卵孢子生活力的影响
叶组织提取液的配置：取 10 g新鲜黄瓜叶片，
叶片为第3~5片真叶，用蒸馏水冲去表面泥土，加
100 mL蒸馏水在组织捣碎机内捣碎 l min，取液
体，放在 4 ℃冰箱过夜，6 000 r·min-1离心 3 min，
取上清液用蒸馏水以 1􀏑9（V/V）比例稀释，稀释液
121 ℃高压灭菌30 min。
叶组织提取液室温下处理卵孢子悬浮液（1􀏑
10， V/V），处理时间分别为 3、 5、 7 和 9 d，
0.05% MTT于36 ℃下染色48 h，测定各处理卵孢子
生活力，以灭菌蒸馏水处理的卵孢子悬浮液为对
照，3次重复。
1.2.8 土壤浸渍液对霜霉菌卵孢子生活力的影响
在大棚黄瓜感病植株根附近取 100 g土壤，加
60 mL蒸馏水，100 r·min-1振荡 2 h，过夜，3 000
r·min-1离心 5 min，取上清液过滤灭菌，制成土壤
浸渍原液。用灭菌蒸馏水以 1􀏑1、1􀏑2、1􀏑3、1􀏑4
（V/V）比例稀释土壤浸渍原液，不同比例稀释液及
原液室温下分别处理卵孢子悬浮液（1􀏑10，V/V），
放置时间分别为5和10 d，0.05% MTT于36 ℃下染
色48 h，测定各处理生活力，以灭菌蒸馏水处理的
卵孢子悬浮液为对照，3次重复。
2 结果与分析
2.1 影响黄瓜霜霉菌卵孢子形成的因素
对不同温度、湿度、叶片成熟度和接触物条件
下黄瓜霜霉菌卵孢子形成测定结果显示（见表 2），
4 ℃产生卵孢子最多为20个·cm-2，其次是与土壤接
触产生19个·cm-2，最后是叶片成熟度为底叶和湿度
为90%。从极差大小可知，温度＞接触物＞叶片成
熟度>湿度，由此可以推测对黄瓜霜霉菌卵孢子形
成的影响因素依程度大小依次为温度、接触物、叶
片成熟度和湿度，其中以温度为 4 ℃，湿度为
90％，与土壤接触的底叶产生卵孢子的数量最多。
2.2 影响黄瓜霜霉菌卵孢子生活力的因素
2.2.1 温度对黄瓜霜霉菌卵孢子生活力的影响
结果见图1。
图 1表明，36 ℃卵孢子萌动率和死亡率最高，
东 北 农 业 大 学 学 报· 52 · 第44卷
但休眠率最低。36 ℃处理3 d，卵孢子萌动率最高
达 20.4%；36 ℃处理 7 d，卵孢子死亡率最高达
32.4%，休眠率最低为 54.0%。在-20~24 ℃范围
内，温度越低，萌动率越低，说明在此范围内低
温条件对卵孢子的存活有不良影响，此时大部分
卵孢子处于休眠状态。
A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z a b c d e f
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百
分
率（
%）
Perc
enta
ge
100
80
60
40
20
0
死亡率（%）Death rate
休眠率（%）Dormancy rate
萌动率（%）Germination rate一一一一一一一一一一一一
图1 不同温度处理对卵孢子生活力的影响
Fig. 1 Influence of different temperature treatments on oospores vitality
A: -20 ℃ 1 d; B: -20 ℃ 3 d; C: -20 ℃ 5 d; D: -20 ℃ 7 d; E: 4 ℃ 1 d; F: 4 ℃ 3 d; G: 4 ℃ 5 d; H: 4 ℃ 7 d; I: 10 ℃ 1 d; J: 10 ℃ 3 d;
K: 10 ℃ 5 d; L: 10 ℃ 7 d; M: 15 ℃ 1 d; N: 15 ℃ 3 d; O: 15 ℃ 5 d; P: 15 ℃ 7 d; Q:20 ℃ 1 d; R: 20 ℃ 3 d; S: 20 ℃ 5 d; T: 20 ℃ 7 d;
U: 30 ℃ 1 d; V: 30 ℃ 3 d; W: 30 ℃ 5 d; X: 30 ℃ 7 d; Y;36 ℃ 1 d; Z: 36 ℃ 3 d; a: 36 ℃ 5 d; b: 36 ℃ 7 d; c: 24 ℃ 1 d; d: 24 ℃ 3 d;
e: 24 ℃ 5 d; f: 24 ℃ 7 d
温度（℃）Temperature
2.2.2 KMnO4对黄瓜霜霉菌卵孢子生活力的影响
结果见图2。表明，不同浓度KMnO4处理卵孢
子后，卵孢子萌动率和死亡率均有不同程度提高，
以 0.4% KMnO4效果最好，其萌动率最高达 21.2%。
张艳菊等：黄瓜霜霉菌卵孢子形成及生活力影响因素研究第10期 · 53 ·
组合Combination
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
极差Range
A温度（℃）Temperature
-20（1）
-20（1）
-20（1）
-20（1）
4（2）
4（2）
4（2）
4（2）
10（3）
10（3）
10（3）
10（3）
25（4）
25（4）
25（4）
25（4）
0.25a
1.25ab
3.50ab
5.00ab
4.75
B湿度（%）Humidity
50（1）
80（2）
90（3）
100（4）
50（1）
80（2）
90（3）
100（4）
50（1）
80（2）
90（3）
100（4）
50（1）
80（2）
90（3）
100（4）
2.00a
2.25a
2.75a
3.00ab
1.00
C叶片成熟度Leaf maturity
10 d叶片（1）
20 d叶片（2）
30 d叶片（3）
底叶（4）
20 d叶片（2）
10 d叶片（1）
底叶（4）
30 d叶片（3）
30 d叶片（3）
底叶（4）
10 d叶片（1）
20 d叶片（2）
底叶（4）
30 d叶片（3）
20 d叶片（2）
10 d叶片（1）
3.50a
3.25a
2.50a
0.75b
2.75
D接触物Contactant
土壤（1）
沙子（2）
沙土（3）
空白（4）
沙土（3）
空白（4）
土壤（1）
沙子（2）
空白（4）
沙土（3）
沙子（2）
土壤（1）
沙子（2）
土壤（1）
空白（4）
沙土（3）
4.75a
2.50a
1.50a
1.25a
3.50
卵孢子数（个·cm-2）Oospore number
0
0
1
0
5
2
9
4
2
4
1
7
1
3
1
0
总平均值Total mean
2.5
表2 温度、湿度、叶片成熟度、接触物对黄瓜霜霉菌卵孢子形成的影响
Table 2 Effect of temperature, humidity, leaf maturity and contactant on oospore formation of cucumber downy mildew
与此同时，KMnO4处理后休眠率显著低于对照，且
随 KMnO4浓度的增大休眠率逐渐降低。由此可
知，强氧化性的KMnO4可以促进卵孢子萌动，并
且可以明显打破黄瓜霜霉菌卵孢子的休眠。
2.2.3 H2O2对黄瓜霜霉菌卵孢子生活力的影响
结果见图3。表明，不同浓度H2O2处理卵孢子
均能提高其萌动率和死亡率，随H2O2浓度增大，
卵孢子萌动率和死亡率也随之提高，以 0.7% H2O2
萌动率和死亡率最高。与此同时，卵孢子休眠率
随H2O2浓度增大而降低。由此可知，强氧化性的
H2O2可促进卵孢子萌动，且可以明显打破黄瓜霜
霉菌卵孢子的休眠。
2.2.4 黄瓜叶组织液对黄瓜霜霉菌卵孢子生活力
的影响
结果见图4。表明，黄瓜叶组织液可提高卵孢
子萌动率，但差异不显著，处理9 d卵孢子萌动率
最高为 10.2%。休眠率和死亡率之间无明显差异。
以上说明黄瓜叶组织液对黄瓜霜霉菌卵孢子生活
力有影响，但差异不显著。
2.2.5 土壤浸渍液对黄瓜霜霉菌卵孢子生活力的
影响
结果见图5。表明，土壤浸渍液对卵孢子生活
力有影响，但差异不显著，以1􀏑2处理9 d卵孢子萌
动率最高，为12.8%，此时卵孢子死亡率也最高。
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 CK
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百
分
率（
%）
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100
80
60
40
20
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KMnO4浓度（%）KMnO4 Concentration
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图2 KMnO4对卵孢子生活力的影响
Fig. 2 Influence of KMnO4 on oospores vitality
死亡率（%）Death rate
休眠率（%）Dormancyrate
萌动率（%）Germinationrate
一一一一
一一一一
一一一一
0.1 0.3 0.5 0.7 CK
一一一一一
一一一一一
一一一一一
一一一一一
一一一一一
百
分
率（
%）
Perc
enta
ge
100
80
60
40
20
0
H2O2浓度（%）H2O2 Concentration
一一一一一
一一一一一
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图3 H2O2对卵孢子生活力的影响
Fig. 3 Influence of H2O2 on oospores vitality
死亡率（%）Death rate
休眠率（%）Dormancyrate
萌动率（%）Germinationrate
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A B C D E F G H
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百
分
率（
%）
Perc
enta
ge
100
80
60
40
20
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死亡率（%）Death rate
休眠率（%）Dormancyrate
萌动率（%）Germinationrate
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处理天数（d）Treatment days
A-叶组织液处理 3 d；B-叶组织液处理 5 d；C-叶组织液处理
7 d；D-叶组织液处理 9 d；E-对照处理 3 d；F-对照处理 5 d；
G-对照处理7 d；H-对照处理9 d
A-Leaf tissue fluid treated for 3 d; B-Leaf tissue fluid treated for
5 d; C-Leaf tissue fluid treated for 7 d; D-Leaf tissue fluid treated
for 9 d; E-Contrast treated for 3 d; F-Contrast treated for 5 d;
G-Contrast treated for 7 d; H-Contrast treated for 9 d
图4 叶组织液处理对卵孢子生活力的影响
Fig. 4 Influence of leaf tissue fluid treatments on
oospores vitality
A B C D E F G H I J K L
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百
分
率（
%）
Perc
enta
ge
100
80
60
40
20
0
处理天数（d）Treatment days
图5 土壤浸渍液处理对卵孢子生活力的影响
Fig. 5 Influence of soil maceration extract on the
vitality of oospores
A-对照处理5 d；B-对照处理7 d；C-对照处理9 d；D-浸渍液
1􀏑1处理 5 d；E-浸渍液 1􀏑1处理 7 d；F-浸渍液 1􀏑1处理 9 d；
G-浸渍液1􀏑2处理5 d；H-浸渍液1‥2处理7 d；I-浸渍液1􀏑2
处理9 d；J-浸渍液1􀏑3处理5 d；K-浸渍液1􀏑3处理7 d；L-浸
渍液1􀏑3处理9 d
A-Contrast treated for 5 d; B-Contrast treated for 7 d; C-Contrast
treated for 9 d; D-Maceration extract 1:1 treated for 5 d; E-Macera⁃
tion extract 1:1 treated for 7 d; F-Maceration extract 1􀏑1 treated for
9 d; G-Maceration extract 1:2 treated for 5 d; H-Maceration extract
1􀏑2 treated for 7 d; I-Maceration extract 1:2 treated for 9 d; J-Mac⁃
eration extract 1􀏑3 treated for 5 d; K-Maceration extract 1􀏑3 treated
for 7 d; L-Maceration extract 1􀏑3 treated for 9 d
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死亡率（%）Death rate
休眠率（%）Dormancyrate
萌动率（%）Germinationrate
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东 北 农 业 大 学 学 报· 54 · 第44卷
3 讨论与结论
国内外对黄瓜霜霉病的研究，主要集中在霜
霉病发生危害、寄主植物的抗性、病原物生物学
特性和综合防治等方面[18-19]，而对卵孢子生活力研
究报道较少，影响卵孢子存活能力因素的具体研
究还未见报道，所以卵孢子在生活史和病害循环
中的作用尚不完全清楚。
本文对卵孢子形成影响因素的研究表明，对
卵孢子形成的影响因素依影响程度为温度>接触
物>叶片成熟度>湿度。温度为 4 ℃，相对湿度为
90％，与土壤接触的底叶产生卵孢子的数量最多。
本研究表明，36 ℃高温刺激有促进卵孢子萌
发的趋势，-20 ℃低温处理可抑制卵孢子萌发。在-
20~24 ℃范围内，温度越低，萌动率越低。黄瓜叶
组织液和土壤浸渍液处理对黄瓜霜霉菌卵孢子的生
活力有影响，但差异不显著。强氧化性KMnO4和
H2O2可明显提高黄瓜霜霉菌卵孢子萌动率，因此可
在黄瓜霜霉菌卵孢子打破休眠后，应用此方法促进
卵孢子萌发，为今后卵孢子萌发和侵染试验及其生
理和生化特性研究奠定基础，为进一步明确黄瓜霜
霉病初侵染源和流行规律提供理论依据。
[ 参 考 文 献 ]
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张艳菊等：黄瓜霜霉菌卵孢子形成及生活力影响因素研究第10期 · 55 ·