全 文 ：黄瓜霜霉菌毒性及分子多态性分析
收稿日期：2009-06-20
基金项目：国家科技部 863项目（2006AA100108-4）；“十一五”国家科技支撑计划项目（2006BA01D01A7）；东北农业大学创新团队
（CXT002-1-2）；黑龙江省自然科学基金（LBH-Z06158）
作者简介：张艳菊（1968－），女，副教授，博士，研究方向为植物病原生物学。E-mail: yanjuzhang@yahoo. com. cn
*通讯作者：秦智伟，教授，博士生导师，研究方向为蔬菜育种。E-mail: zwqin727@163. com
张艳菊1，张宏宇1，秦智伟2*，周秀艳2，刘艳玲1
（1. 东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2. 东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要：采用 7个具有不同抗病性、生态型及标记聚类的黄瓜品种（系）对来自哈尔滨、长春、沈阳、北京、
青岛、郑州、徐州、西安 8个城市的 18个黄瓜霜霉菌株进行了毒性及 RAPD标记多态性分析。结果表明，供试
菌株存在毒力分化，初步划分为 12 个毒性类型。利用 27 个 RAPD 随机引物对 18 个菌株进行全基因组 DNA
RAPD扩增共得到 230个 RAPD标记，其中多态性标记 212个，占 92.2％。当以欧氏距离 8.5为标准时可将供试
菌株分为 4个类群。菌株间相似系数介于 0.267～0.754，各菌株之间的相似性系数较低，在 DNA水平上存在差
异，具有丰富的遗传多样性。
关键词：黄瓜霜霉菌；毒性；RAPD标记；遗传多样性；相关性
中图分类号：S436.421.1+1 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2010）02－0025－06
Analysis of virulence and molecular polymorphism of Pseudoperono-
spora cubensis/ZHANG Yanju1, ZHANG Hongyu1, QIN Zhiwei2, ZHOU Xiuyan2, LIU Yanling1
(1. College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. College of
Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract: A total of 18 isolates of Pseudoperonospora cubensis from Harbin, Changchun, Shenyang,
Beijing, Qingdao, Zhengzhou, Xuzhou and Xi an were studied. The virulence test showed that there was
polymorphism on virulence, and 18 isolates could be devided into 12 pathotypes on seven differential
hosts. By using 27 RAPD random primers, 230 amplified fragments were obtained and 212 (92.2%) were
polymorphic. In 8.5 dissimilarity distance cluster analysis revealed the existence of four groups. The
difference among similarity coefficients of 18 isolates was larger (0.267-0.754), which showed that P.
cubensis was genetically complex.
Key words: Pseudoperonospora cubensis; virulence; RAPDmarker; genetic diversity; relativity
黄瓜霜霉病由卵菌门假霜霉属古巴假霜霉菌
（Pseudoperonospora cubensis（Berk. & M.A. Curtis）
Rostovzev）侵染引起，是黄瓜生产中的重要病害，
露地和保护地栽培均有普遍发生，以保护地温室、
大棚黄瓜受害损失最重。到目前为止，有关黄瓜
霜霉菌生理小种分化方面的研究尚无定论[1-2]。
Ellis等曾报道瓜类霜霉菌存在不同生理小种[2-4]，
但傅俊范等在 1982～1985年，采用 75个黄瓜品种
对全国 9个不同来源（哈尔滨、长春、沈阳、北京、
天津、济南、郑州、西安和海南岛）的 P. cubensis
菌株从致病力和形态特征上进行分析，认为中国
黄瓜霜霉病菌的变异较小，不存在生理小种分化[5]。
1985~1989年，天津市黄瓜研究所等农业科研单位
联合试验，分析了 4个省市霜霉病菌分化情况。结
果表明，在致病力上有些菌株间虽然存在差异，但
不存在小种分化现象。翁祖信等采用长春密刺、北
第 41卷 第 2期 东 北 农 业 大 学 学 报 41(2): 25~30
2010年 2月 Journal of Northeast Agricultural University Feb. 2010
京小刺、津研 2号和津研 7号 4个鉴别寄主对北
京 4个不同地区黄瓜霜霉病菌进行毒性测定，认
为北京地区黄瓜霜霉病菌无生理小种分化 [6]。可
见，黄瓜霜霉菌生理分化方面的研究由于各研究
者所使用的菌株和鉴别寄主不同，所得出的结论
也存在差异。而且国内外对于黄瓜霜霉菌生理小
种分化的研究还停留在形态、毒力方面。
近年来，随着分子生物学的发展，DNA水平
的分子标记在病原菌生理小种鉴定方面得到广泛
应用[7-13]。但利用核酸分子标记技术对黄瓜霜霉菌
亲缘关系及毒性分化方面的研究国内外均未见报
道。本文采用传统毒力分析方法和 RAPD 技术相
结合，对来自中国 8个省市的 18个黄瓜霜霉病菌
株毒性分化进行了初步研究，以明确黄瓜霜霉菌
毒性和遗传多样性，为抗病育种和病害综合防治
提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
采集来自哈尔滨市、沈阳市、长春市、北京
市、青岛市、郑州市、徐州市、西安市黄瓜霜霉
病菌，其编号、采集地点见表 1。
采集标样要求新鲜纯净无杂菌。冲去叶面上
的杂物和原有的孢子囊，20～25 ℃保湿 24 h，长出
大量浓密新鲜的孢子囊后，用消毒软毛刷将孢子
囊刷入无菌水中，配成孢子囊浓度为 2.0×103个孢
子囊·mL-1的菌悬液，在 18 ℃培养箱中黑暗保持
2～3 h，待有大量游动孢子出现时接种到感病品种
长春密刺上[1]。待各菌株在感病品种上发病并长出
孢子囊后，用于毒力测定。
1.1.2 供试黄瓜品种
黄瓜霜霉病菌生理小种分化的研究，至今尚无
一套标准、统一的鉴别寄主。本研究在丁国华黄瓜
品种抗霜霉病鉴定结果的基础上[14]，从中选择具有
不同抗病性、抗感性状稳定、以及具有不同生态型
及标记聚类的 7个黄瓜品种（系）用于毒力测定。选
择品种（系）为：602、651、631、649、D0120、龙
杂黄和长春密刺。
1.2 方法
1.2.1 黄瓜霜霉菌的毒性测定
营养土消毒后装钵，待幼苗长到子叶期时，在
子叶的中央进行点滴接种，接种量为 0.04 mL。接
种后立即喷雾扣棚，保湿 12 h，保持 RH 90％以
上，温度控制在 18~24 ℃，7 d后发病较充分时，
参照 1995年的病情分级标准进行发病程度调查[6]，
计算病情指数。每处理调查 10株，3次重复。
1.2.2 黄瓜霜霉菌基因组 DNA的提取
采用 CTAB法并稍加改进[15]。取保存于 95％乙
醇中的黄瓜霜霉菌，离心，去上清。称取菌丝与
孢子囊的混合物 100 mg，加液氮反复研磨。移入
1.5 mL离心管后，加入 700 μL 5 ℃预热的 2×CTAB
提取缓冲液，充分混匀，于 65 ℃水浴中保温 30
min；加入等体积氯仿：异戊醇（24： 1），4 ℃ 12 000
r·min-1离心 15 min。将上清液转入另一离心管中，
加入 60 μL 预热的 10％ CTAB 混匀，加入等体积
氯仿：异戊醇，颠倒混匀，室温 12 000 r·min-1离心
10 min。取上清夜，转入新的离心管中，加入等体
积约 700 μL异丙醇沉淀缓冲液，混匀，室温下放
置 30 min。12 000 r·min-1离心 10 min，去上清，用
70％乙醇洗 2 次，室温干燥，每管加 25 μL TE，
室温下溶解。-20 ℃保存备用。
1.2.3 黄瓜霜霉病菌基因组 DNA的 RAPD扩增
从赛百盛公司生产的 145个随机引物中筛选出
27 个扩增谱带清晰，重复性好，多态性高的引
物作为 RAPD反应的引物。反应体系为 25 μL，各
反应成分终浓度为：10×Buffer（with KCl）2.5 μL，
MgCl2 1.5 mmol·L－1，dNTP 120 μmol·L－1，引物 15
pmol·L－1，DNA 50 ng，Taq酶（5 U·μL-1）0.4 μL。
反应程序为：94 ℃预变性 5 min；进入循环，94 ℃
变性 30 s，35 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，2个
表 1 黄瓜霜霉菌供试菌株及来源
Table 1 Strains and origin of P. cubensis
Pc-sy1 沈阳 Pc-xa 西安
Pc-hrb2 哈尔滨 Pc-bj 北京
Pc-cc1 长春 Pc-xz1 徐州
Pc-hrb6 哈尔滨 Pc-zz2 郑州
Pc-hrb5 哈尔滨 Pc-zz1 郑州
Pc-hrb4 哈尔滨 Pc-shd2 青岛
Pc-hrb3 哈尔滨 Pc-shd1 青岛
菌株
Strains
来源
Origin
菌株
Strains
来源
Origin
Pc-hrb1 哈尔滨 Pc-sy2 沈阳
Pc-cc2 长春 Pc-xz2 徐州
·26· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 41卷
循环；94℃变性 20 s，36℃ 15 s，45℃ 15 s，72℃
2 min，38个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
PCR结束后，取 8 μL扩增产物与少量上样缓
冲液混合，加入含 0.25 μL·mL－1溴化乙锭的 1.2％
琼脂糖中，用 1×TAE电泳缓冲液 80 V下电泳。电
泳结束后用凝胶成像系统扫描记录。
1.2.4 数据分析
对电泳谱带进行记录，在相同位置出现条带的
记为 1，无条带的记为 0。利用 MVSP软件包对所
得数据用离差平方和法计算供试菌株间欧氏距离，
建立聚类分析树状图。
2 结果与分析
2.1 黄瓜霜霉菌毒性测定
根据供试黄瓜品种对 18个黄瓜霜霉病菌株的
反应型差异，可将供试菌株划分为 12个毒性类型
（见表 2）。Ⅰ组只含一个来自郑州的菌株 Pc-zz2，
其毒性最弱，不感染任何供试品种；Ⅻ组来自西安
的菌株毒性最强，可侵染所有品种。Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组
的毒性较弱，可侵染长春密刺、龙杂黄和 631，不
能侵染其余 4个品种。Ⅺ组来自哈尔滨的菌株毒性
较强，可侵染除 649外的所有品种。
2.2 黄瓜霜霉菌基因组 DNA的 RAPD扩增
27个引物对 18个供试菌株的扩增谱带清晰明
亮，条带分布合理，扩增 DNA片段的分子质量大
小变化范围在 300～2 000 bp之间（见图 1）。每条引
物对所有供试菌株的扩增条带数为 4～17条，利用
27个引物共得到 230个 RAPD标记，其中多态性
标记 212个，占 92.2％（见表 3）。
2.3 黄瓜霜霉菌分子多态性分析
根据扩增结果，统计稳定清晰的谱带，供试
18个黄瓜霜霉菌株基于 RAPD的聚类分析树状图
见图 2。当以欧氏距离 8.5 为标准时可将供试菌
株分为 4 个类群（RAPD Groups，RG），分别命名
为 RG1、RG2和 RG3和 RG4。RG1和 RG2都只包含
一个菌株，分别是来自西安的 Pc-xa 和来自徐州
表 2 7个黄瓜品种（系）对 18个黄瓜霜霉病菌株的反应
Table 2 Reactions of seven cucumber cultivars to 18 strains of P. cubensis
Ⅱ Pc-hrb3 S R
Pc-hrb4 R S
Ⅳ Pc-sy2 R S
Ⅲ Pc-hrb1 R R
Pc-bj S R
Pc-xz2 S R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
Ⅰ Pc-zz2 R R R R R R R
Ⅴ Pc-hrb2 S S R RRRR
Ⅻ Pc-xa S S S S S S S
Ⅶ Pc-xz1 S S S R R R R
Ⅵ Pc-cc1 R S S R R R R
Pc-shd2 S S R R R R R
Pc-hrb5 S S R R R R R
组别
Groups
菌源
Isolates
品种（系）Cultivars
长春密刺 631 D0120 龙杂黄 651 602 649
Pc-cc2 S S S R R R R
Ⅺ Pc-hrb6 S S S S S S R
Ⅹ Pc-sy1 S S S R S R R
Ⅸ Pc-zz1 S S R S R R R
Ⅷ Pc-shd1 S R S S R R R
张艳菊等：黄瓜霜霉菌毒性及分子多态性分析第 2期 ·27·
的 Pc-xz2，占供试菌株的 5.6%；RG3包含来自青
岛的 2 个菌株，以及分别来自北京、沈阳、徐州
和长春的各一个菌株，即 Pc-shd1、Pc-bj、Pc-
sy1、Pc-xz1、Pc-shd2和 Pc-cc1共计 6个菌株，占
供试菌株的 33.3%；RG4包含菌株较多，主要包
括来自哈尔滨的所有菌株 Pc-hrb1、Pc-hrb2、Pc-
hrb3、Pc-hrb4、Pc-hrb5、Pc-hrb6和来自郑州的 2
个菌株 Pc-zz1和 Pc-zz2，来自长春的 Pc-cc2和来
自沈阳的 Pc-sy2共计 10 个菌株，占供试菌株的
55.6%。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
图 1 随机引物 CBSH7对 18个黄瓜霜霉病菌株扩增结果
Fig. 1 Amplification result of 18 isolates of P. cubensis obtained by using the random primer CBSH7
M-DL2000 marker; 1-Pc-hrb1; 2-Pc-hrb2; 3-Pc-hrb3; 4-Pc-hrb4; 5-Pc-hrb5; 6-Pc-hrb6; 7-Pc-cc1; 8-Pc-cc2;
9-sy1; 10-sy2; 11-Pc-bj; 12-Pc-shd1; 13-Pc-shd2; 14-Pc-zz1; 15-Pc-zz2; 16-Pc-xz2; 17-Pc-xz1; 18-Pc-xa
表 3 供试引物序列及其对黄瓜霜霉病菌的扩增结果
Table 3 Primer sequence and polymorphic RAPD bands produced by P. cubensis
CBSC5
CBSH7
CBSH3
CBSC19
CBSC15
CBSC8
CBSC4
CBSH12
总计/平均 Total/Mean
CBSH19
CBSH15
CBSH14
CBSH13
CBSP2
CBSN6
CBSS13
CBSP5
引物
Primer
GATGACCGCC
CTGCATCGTG
AGACGTCCAC
GTTGCCAGCC
GACGGATCAG
TGGACCGGTG
CCGCATCTAC
ACGCGCATGT
CTGACCAGCC
CTGCATCGTG
ACCAGGTTGG
GACGCCACAC
TCGGCACGCA
GAGACGCACA
GTCGTTCGTG
CCCCGGTAAC
核苷酸序列
Nucleotide sequence
多态性标记百分率（％）
Percentage of polymorphism
71.4
81.8
100.0
90.9
100.0
88.9
85.7
71.4
100.0
100.0
100.0
100.0
85.7
100.0
100.0
100.0
92.2
多态性 RAPD标记数
Polymorphic bands
5
9
9
10
7
8
12
5
7
10
9
4
6
15
5
13
212
RAPD标记数
Scored bands
7
11
9
11
7
9
14
7
7
10
9
4
7
15
5
13
230
CBSP6 GTGGGCTGAC 100.055
CBSS11 AGTCGGGTGG 3 3 100.0
CBSS10 ACCGTTCCAG 14 13 92.9
CBSS7 TCCGATGCTG 7 5 71.4
CBSQ20 TCGCCCAGTC 4 4 100.0
CBSQ18 AGGCTGGGTG 5 5 100.0
CBSQ16 AGTGCAGCCA 9 8 88.9
CBSQ15 GGGTAACGTG 10 8 80.0
CBSQ7 CCCCGATGGT 5 5 100.0
CBSP11 AACGCGTCGG 6 5 83.3
CBSP10 TCCCGCCTAC 17 17 100.0
·28· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 41卷
利用 MVSP软件计算 18个菌株相似系数，结
果表明，18 个菌株之间的相似系数介于 0.267～
0.754。各菌株的相似性系数较低，即菌株间在遗
传上存在较大的差异。来源于西安的 Pc-xa与其他
17个菌株的相似系数最低，其中与 Pc-xz1的相似
系数仅为0.267。
由图 2可知，来自西安的菌株与其他菌株间亲
缘关系较远。所有哈尔滨的菌株均在 RG4中。同
时来自郑州的 2个菌株也在 RG4中。来自青岛的 2
个菌株都在 RG3中。来自沈阳的 2 个菌株以及来
自长春的 2个菌株、徐州的 2个菌株没有在一组，
但当以欧氏距离 8.5为标准时沈阳和长春的 4个菌
株也都在一组，只有来自徐州的 2个菌株之间的同
源性较低，遗传距离较远。由此可知，菌株 RAPD
多态性与地理来源之间存在一定的相关性，多数来
自同一城市的菌株间的亲缘关系较近，来自西安的
菌株与所有菌株遗传距离较远。
3 讨论与结论
18个黄瓜霜霉菌株在 7个鉴别品种（系）上的
毒力特征和 RAPD标记结果均表明黄瓜霜霉病菌存
在毒性多态性，但二者相关性不甚密切。只有采自
西安的菌株 Pc-xa与其他菌株遗传距离较远，且致
病力最强，采用两种方法均可独立划分为一组，而
其余菌株两种标记的相关性不强。如按毒性标记，
Pc-hrb3，Pc-xz2，Pc-bj 3 个菌株毒性相同，划分
为同一致病性类型，但按 RAPD标记 3个菌株则分
别在 3个不同的类群中。又如按毒性标记，采自哈
尔滨的 6个菌株差异明显，但按 RAPD标记，6个
菌株关系甚近，划分在同一类群中。
本研究结果表明，病菌基因组 DNA多态性与
毒力多态性之间关系并不密切。原因为：① RAPD
分析的基础是基因组 DNA随机位点上的差异，而
菌株的毒性分析则是基因组上毒性基因与寄主抗病
基因在一定条件下互作的表现型；② 选用的引物
所扩增的 DNA区域并不包括病菌毒性基因，因此
两种标记相关性不强。虽然本研究没有寻找到能够
完全准确区分不同毒性菌株的 RAPD 标记，而且
仅对来自全国 8个省市的 18个菌株进行研究，但
通过两种方法均明确了黄瓜霜霉菌不同菌株间具
有多态性。今后应在此研究的基础上，进一步对
各地黄瓜霜霉菌生理小种分化进行研究，明确黄
瓜霜霉菌生理小种组成及优势小种，为黄瓜抗霜
霉病育种及抗病品种的合理利用及病害防治提供
理论依据。
[ 参 考 文 献 ]
[ 1 ] 冯东昕,李宝栋.主要瓜类作物抗霜霉病育种研究进展[J].中国
蔬菜, 1997(2): 45-48.
图 2 18个黄瓜霜霉菌株基于 RAPD标记的聚类分析
Fig. 2 Clustering analysis of 18 strains of P. cubensis based on RAPD
Pc-xa
Pc-xz2
Pc-shd1
Pc-bj
Pc-sy1
Pc-xz1
Pc-shd2
Pc-cc1
Pc-zz2
Pc-cc2
Pc-zz1
Pc-sy2
Pc-hrb6
Pc-hrb5
Pc-hrb4
Pc-hrb2
Pc-hrb3
Pc-hrb1
18 15 12 9 6 3 0
欧氏 Euclidean
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科技动态
犊牛“幼畜超数排卵技术”研发成功
奶牛为单胎动物，自然繁殖情况下，母牛 2.5岁左右才可能有后代犊牛 1头，5.5岁可有后代犊牛 4头。如何
提高奶牛繁殖率一直是我国奶牛业发展的难题。近日，犊牛“幼畜超数排卵技术”（JIVET技术）在河北廊坊研发成
功。采用该技术后，当供体犊牛 1岁时便拥有自己的后代犊牛 4~5头，将牛的世代间隔缩短至 1年，大大提高了
奶牛的繁殖效率。
近年来，我国奶牛遗传改良工作虽然取得了一定的成绩，但奶牛单产水平总体仍然偏低，并缺乏自主培育种
公牛能力。如何从根本上改变我国良种奶牛比例低，单产增长速度慢的局面成为目前亟待解决的问题。
据介绍，JIVET技术最早由澳大利亚南澳研究与开发研究院研发。2005年，廊坊香河绿色东方农牧科技发展
有限公司与该研究院签订了独家合作协议。JIVET技术引进后首先应用于绵羊肉羊技术繁殖；2006年，绿色东方
农牧科技发展有限公司把该技术应用于奶牛优良品种繁育上，用于解决我国奶牛长期引进国外优良品种的问题。
随着 JIVET技术研发成功，绿色东方农牧科技发展有限公司项目组还成功研发出具有自主知识产权的 JIVET技术
流动工作站，技术终端通过互联网与 SARDI、中国农业大学动物科技学院、中国农业科学院畜牧研究所等权威科
研机构建立 JIVET技术网络，加速了技术成果的推广。
专家表示，JIVET技术的应用可迅速提高我国奶牛的良种数量，促进我国奶业的快速发展，提高我国畜牧业技
术水平和国际科技竞争力。另外，运用该技术还可以应用于肉牛优良品种的快速繁育，对推动我国肉牛养殖业的
发展具有重要意义。
摘自：科技日报
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·30· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 41卷