全 文 ：皂苷作用与川芎嗪相似。
本实验发现 ,假手术组大鼠脑内仅有微弱的
BDNF表达 ,而缺血再灌注组的阳性细胞明显增多 ,
提示正常脑组织内 BDNF表达极少 ,但在缺血后 ,其
表达水平可发生很大变化 ,脑缺血后机体可通过促
进内源性 BDNF的表达 ,提高神经元抵抗缺血损伤
的能力 ,促进受损神经元的修复和再生 ,是机体的一
种自我保护机制;研究表明 ,脑损伤后 BDNF代偿性
分泌增加水平有限 ,且持续时间亦较短 ,提示机体的
自身代偿能力是有限的。因此如何有效地利用并促
进内源性 BDNF的表达 ,可能是治疗缺血性神经损
伤的有效途径之一 。本实验显示 ,应用三七总皂苷
后 ,内源性 BDNF显著上调 ,而且大鼠神经功能缺
损 、梗死体积和神经细胞凋亡相应减轻 ,提示三七总
皂苷能通过启动内源性神经营养因子的表达进而加
强脑缺血后的内源性修复过程 ,这可能是三七总皂
苷神经保护作用的一种机制。
脑缺血再灌注损伤时 ,被诱导表达升高的 BD-
NF与其特异性受体 TrkB相结合作用于脑缺血性损
伤的多个环节 ,从多个角度抑制缺血再灌注后的各
种级联反应 ,对缺血神经元起保护作用;三七总皂苷
治疗即通过促进脑内源性 BDNF的高水平表达 ,从
而发挥重要的脑保护作用 ,为临床上进一步应用三
七总皂苷治疗缺血性脑血管疾病奠定理论基础。
参考文献:
[ 1] 　BlanquetPR, MarianiJ, FournierB.Identificationofabiphasic
signalingpathwayinvolvedinischemicresistanceofthehippocam-
paldentategyrus[ J] .ExpNeurol, 2006, 202(2):357-372.
[ 2] 　王　琛.三七的药效与作用机制 [ J] .用药指南 , 2006, 1(5):
125-126.
[ 3] 　LongaEZ, WeinsteinRP, CarlsonS, etal.Reversiblemiddle
cerebralartery:occlusionwithoutcraniotomyinrats[ J] .Stroke,
1989, 20:84-91.
[ 4] 　BardeYA, EdgarD, ThoenenH.Purificationofanewneurotro-
phicfactorfrommammalianbrain[ J] .JEMBO, 1982, 1:549-
553.
[ 5] 　MariniAM, JiangX, WuX, etal.Preconditioningandneuroto-
phins:amodelforbrainadaptationtoseizures, ischemiaandother
stressfulstimuli[J] .AminoAcids.2007, 32:299-304.
红芪总多糖诱导 S180瘤细胞凋亡的实验研究
雷丰丰 1, 2 , 　赵健雄 1 , 　王学习 1 , 　姚宝泰1 , 　丁　侃 3
(1.兰州大学中西医结合研究所 ,甘肃兰州 730000;2.甘肃省人民医院呼吸科 ,甘肃兰州 730000;3.中国科
学院上海药物研究所 ,上海 201203)
收稿日期:2007-10-12
基金项目:甘肃省科技攻关项目(2GS064-A43-020-32);兰州大学医学科研基金(LZUYX200601)。
作者简介:雷丰丰(1973-),男 ,在读博士研究生, 主治医师 , 研究方向:中西医结合抗肿瘤, 联系电话 13619393315, E-mail:leifengfenglf@
163.com
关键词:红芪总多糖;S180瘤;钙离子;自由基;线粒体膜电位
摘要:目的:研究红芪总多糖(THPS)诱导小鼠 S180瘤细胞凋亡作用及其机制。方法:昆明小鼠 60只接种 S180瘤后随
机分为 5组。 (1)模型组(S):生理盐水腹腔注射 , (2)环磷酰胺组(CY):CY腹腔注射 , (3)THPS低剂量(H100), (4)
THPS中剂量(H200)和(5)THPS高剂量组(H400):分别给予 THPS低剂量 、中剂量和高剂量腹腔注射 , 14 d后处死小
鼠。电镜观察各组瘤细胞的形态 , 激光共聚焦(LSCM)测定每组瘤细胞 DNA、RNA含量 、细胞内钙离子浓度 、自由基含量
及线粒体膜电位。结果:中剂量的 THPS可明显升高细胞内钙离子浓度 、自由基含量及降低线粒体膜电位和瘤细胞 DNA
RNA含量的作用。结论:THPS中剂量通过升高细胞内钙离子浓度 、自由基含量及降低线粒体膜电位诱导小鼠 S180瘤
细胞凋亡。
中图分类号:R285.6　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)07-0961-03
ExperimentalstudyonapoptosisofS180 tumorinducedbytotalhedysaripoly-
saccharide
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LEIFeng-feng1, 2 , 　ZHAOJian-xiong1＊ , 　WANGXue-xi1 , 　YAOBao-tai1 , 　DINGKan3
(1.InstituteofIntegratedTraditionalChineseMedicineandWesternMedicine, LanzhouUniversity, Lanzhou, 730000 , China;2.DepartmentofRespiratory
Medicine, TheHospitalofGansuProvince, Lanzhou, 730000 , China;3.ShanghaiInstituteofMaterialMedica, ChineseAcademyofScience, Shanghai,
201203 , China)
KEYWORDS:totalhedysaripolysaccharide;S180 tumor;calciumion;freeradical;mitochondrialmembrane
potential
ABSTRACT:AIM:Tostudyefectsandmechanismsoftotalhedysaripolysaccharide(THPS)inducingapoptosis
ofS180tumor.METHODS:60 Kunmingmiceweredividedinto5groupsrandomlyafterinoculatingS180 tumor.
Samplegroup(S)andcyclophosphamidegroup(CY)wereinjectedintraperitonealywithnormalsodiumandcy-
clophosphamiderespectively.LowdoseTHPSgroup(H100), moderatedoseTHPSgroup(H200), andhighdose
THPSgroup(H400)wereinjectedintraperitonealywithlow, moderate, andhighdoseTHPSrespectively.The
micewerekiledafterbeingtreatedfor14 days.Appearanceoftumorwasobservedbyelectronmicroscope, and
DNA, RNA, intracelularCa2+ , freeradicals, mitochondrialmembranepotentialoftumorweredeterminedbylaser
scanningconfocalmicroscope.RESULTS:ModeratedoseTHPSraisedintracelularCa2+, freeradicalsandre-
ducedmitochondrialmembranepotentialandDNA, RNAoftumor.CONCLUSION:ModeratedoseTHPSinduces
apoptosisofS180 tumorthroughraisingintracelularCa2+ , freeradicalsandreducingmitochondrialmembranepo-
tential.
　　植物多糖由于抑制肿瘤的生物活性近年受到重
视 ,多糖抑瘤机制主要与上调机体的免疫功能 、诱导
凋亡和影响癌基因等有关[ 1] 。我们研究所提取了
结构较明确的红芪总多糖并对其诱导 S180瘤细胞
凋亡做了研究。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　药材与试剂　红芪总多糖由我研究所提取
后送中国科学院上海药物研究所测定其纯度为
94.3%,分子量为 19kd,糖含量为 39.0%,糖醛酸含
量为 26.5%,由阿拉伯糖 、甘露糖 、半乳糖及葡萄糖
组成 ,它们的摩尔比为:0.42:0.53:0.34:1.00。环
磷酰胺(CY),由江苏恒瑞医药股份有限公司生产 ,
批号:06101021, 规格 200mg/支。碘化丙啶 (美国
Beckman2Coulter公司产品),罗丹明 123(美国 Eu-
gene公司产品),吖啶橙 (AO)为 sigma公司产品 ,
D-399为美国 MolecularProbes公司产品 ,二甲基亚
砜(DMSO)、Triton-X100、RNaseA均为 Sigma公司产
品 。其它试剂均为国产分析纯 。
1.1.2　动物与瘤株　清洁级昆明种小鼠 60只♀♂
各半 ,体重(20±2)g,由兰州大学实验动物中心提
供 ,合格证号:14-005, S180瘤株由北京中国医学科
学院药物研究所提供 。
1.1.3　仪器与设备　普通光学显微镜(日本 Olym-
pus公司产品), TCSSP2激光扫描共聚焦显微镜系
统(Leica, TCSSP2型 ,德国),电子显微镜(日本 JE-
OL1.LT生产), BL3100型(精确度 0.1g)和 BP221S
型(精确度 0.1 mg)电子天平 。
1.2　方法
1.2.1　动物造模 、分组及药物治疗　昆明种小鼠
60只 ,置于室温 、通风的清洁级动物室中 ,自由摄食
饮水 ,适应 2d。常规消毒后从 S180瘤种小鼠抽取
腹水液 ,用台盼兰染色并在显微镜下检测活细胞数
达 95%后 ,再抽取瘤液用生理盐水稀释至肿瘤细胞
数为 25×106 /mL的瘤液 ,给每只小鼠右腋前皮下
注射 0.16mL后随机分为 5组 ,每组 12只:(1)模型
组(S):生理盐水每天 10 mL/kg腹腔注射;(2)环磷
酰胺组(CY):CY20mg/kg隔天腹腔注射;(3)THPS
低剂量 (H100)、(4)THPS中剂量 (H200)和 (5)
THPS高剂量组(H400):接种后分别每天给予 THPS
100 mg/kg、200mg/kg和 400 mg/kg腹腔注射。 CY
和 THPS溶剂均为与模型组等剂量的生理盐水 , CY
在间隔期腹腔注射与模型组等量的生理盐水 。用药
14d后处死小鼠 ,取 S180瘤匀浆过 200目细胞筛制
成瘤细胞悬液备用 。
1.2.2　电镜观察瘤组织凋亡程度　具体过程按照
电镜操作规范进行 ,主要观察各组有无凋亡及凋亡
程度的差异。
1.2.3　吖啶橙(AO)、乙酰乙酸盐-2, 7-二氯氢化荧
光素(D-399)负载和 DNA、RNA及自由基含量的测
定　AO负载后荧光信号代表肿瘤细胞内 DNA和
RNA的含量 , D-399负载后荧光信号代表瘤细胞自
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由基含量 ,激光共聚焦显微镜下分别计算荧光信号
区面积 ,每个样本随机选取 3个视野进行测定 ,取其
均值进行统计[ 2, 3] 。
1.2.4　Fluo23 /AM负载及细胞内钙离子浓度测定
　Fluo23 /AM负载后荧光信号代表肿瘤细胞内钙离
子含量 ,激光共聚焦显微镜下分别计算荧光信号区
面积 ,每样本随机选取 3个视野进行测定 ,取其均值
进行统计[ 3, 4] 。
1.2.5　罗丹明 123负载及线粒体膜电位测定　罗
丹明 123是一种亲脂性阳离子荧光染料 ,对膜具有
通透性 ,其荧光信号主要集中于线粒体 ,其荧光强度
代表细胞线粒体膜电位的大小 。激光共聚焦显微镜
下分别计算荧光信号区面积 ,每个样本随机选取 3
个视野 ,取其均数进行统计学分析[ 5] 。
1.2.6　图像分析与数据处理　用 LSCM图像处理
系统进行数据处理 ,得出平均荧光强度。数据资料
用均值 ±标准差(x±s)表示 ,用 SPSS10.0软件统
计分析 ,样本均数比较用 t检验 。
2　结果
2.1　细胞形态学变化
电子显微镜下可见各治疗小组均有不同程度的
凋亡 , H200组最为明显 , CY组以瘤细胞坏死为主 ,
伴有少量凋亡 , H100和 H400组以少量凋亡为其特
征(图 1 ～ 5)。
2.2　细胞 AO平均荧光强度(DNA、RNA含量)比
较
CY组细胞内 AO平均荧光强度比 S组明显减
少 ,差异有显著性(P<0.01), H200中剂量组与 S
组比较也有显著差异但程度不及 CY组 , (P<
0.05)。H200中剂量治疗组 D-399平均荧光强度
(自由基含量)比 S组明显增加 ,差异有显著性(P<
0.01), CY组与 S组比较也有差异但程度不及 H200
组 , (P<0.05)。 H100低剂量和 H400高剂量组与
S组比较无显著差异(见表 1)。
2.3　细胞内钙离子浓度的荧光强度的比较
S组细胞内游离钙平均荧光强度较弱 ,而 H200
中剂量组钙离子平均荧光强度明显增强 ,与模型组
比较 ,有显著差异(P<0.01)。 CY组与 S组比较虽
有差异 , 但程度不及 H200中剂量组 (P<0.05)。
H100低剂量和 H400高剂量组与 S组比较无显著
差异(见表 1)。
2.4　各组荷瘤小鼠 S180细胞内罗丹明 123荧光强
度(线粒体膜电位)比较
S组细胞内罗丹明 123荧光强度较强 , H200中
剂量细胞内罗丹明 123荧光强度较模型组明显减
弱 ,与S组比较差异有显著性(P<0.01), CY组与
表 1　 THPS对小鼠 S180瘤细胞 DNA、RNA、自由基 、钙离子和线粒体膜电位平均荧光强度的影响(n=12, x±s)
组别 DNA、RNA平均荧光强度 自由基平均荧光强度 钙离子平均荧光强度 线粒体膜电位平均荧光强度
S 220.05±81.47 103.75±33.92 19.23±13.29 210.13±67.45
CY 140.59±56.43＊＊ 150.18±42.28＊ 35.50±15.82＊ 176.20±37.61＊
H100 205.76±44.22 116.33±57.28 23.80±31.11 198.44±58.34
H200 181.12±41.38＊ 205.65±51.21＊＊ 56.99±13.62＊＊ 156.97±34.71＊＊
H400 202.32±42.25 114.75±31.41 24.09±12.69 201.97±54.31
　　注:与模型组(S)相比较 ＊P<0.05,与模型组(S)相比较＊＊P<0.01。
图 1　S组电镜下可见大量的 S180瘤细胞 图 2　CY组电镜下以坏死为主伴少量凋亡
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图 3　H100组电镜下可见少量凋亡 图 4　H200组电镜下以大量凋亡为主
图 5　H400组电镜下可见少量凋亡
模型组比较也有差异但程度不及 H200组 (P<
0.05)。 H100低剂量和 H400高剂量组与 S组比较
无显著差异(见表 1)。
3　讨论
　　诱导肿瘤细胞凋亡是当前抗肿瘤药物研究的热
点 ,目前已知可以通过 3个主要的信号传导通路诱
导 [ 6] ,它们是:1)线粒体通路;2)死亡受体通路;3)
内质网通路 。所有这些信号传导通路都能激活凋亡
执行者 caspase3,它会水解各种各样的细胞成分而
使其凋亡。以上通路的激活与细胞内钙离子浓度 、
自由基含量及线粒体膜电位有密切的关系 。细胞胞
浆钙离子浓度的升高作为细胞凋亡的启动信号 ,几
乎参与了所有的凋亡通路[ 7] 。自由基可以通过损
伤 DNA、影响信号传导通路以及参与基因表达调控
等途径介导细胞凋亡[ 8] 。在死亡信号的诱导下 ,线
粒体跨膜电位下降 ,膜通透转变孔道开放是细胞凋
亡的早期特征 ,而且研究表明跨膜电位下降的细胞
不可避免地发生凋亡 [ 9] 。本实验研究表明 H200中
剂量组中 S180瘤细胞 DNA、RNA含量明显降低(P
<0.05),表明其有较好的抑瘤作用 ,而且该组对瘤
细胞内钙离子浓度 、自由基含量有显著升高作用 ,对
瘤细胞线粒体膜电位有显著下降作用(P<0.01)。
结合电子显微镜下该组瘤细胞大量凋亡的实验结
果 ,可认为中剂量的 THPS通过诱导 S180瘤细胞凋
亡而抑制肿瘤的生长 ,其诱导凋亡机制与升高瘤细
胞胞浆内钙离子浓度和自由基含量 ,降低瘤细胞线
粒体膜电位有关。
参考文献:
[ 1] 　张延坤 ,张东详.生物活性多糖的抗肿瘤作用及其机制研究进
展 [ J] .解放军预防医学杂志 , 2006;24(5):382-385.
[ 2] 　季宇彬 ,高世勇 ,孔　琪 ,等.海嘧啶对人胃癌 BGC2823细胞形
态 、细胞核 DNA及细胞间通讯的影响 [ J] .哈尔滨商业大学学
报(自然科学版), 2001;17(3):1 ～ 3.
[ 3] 　黄晓峰.荧光探针技术 [ M].北京:人民军医出版社 , 2004:410-
417.
[ 4] 　段重高 ,李宏伟 ,修瑞娟 ,等.应用激光共聚焦扫描显微镜测定
缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞 Ca2+含量的影响 [ J].微循环
学杂志 , 1996;6(3):8-10.
[ 5] 　陈扬超 ,周茂华 ,周克元 ,等.顺铂诱导鼻咽癌 CNE22Z细胞凋
亡并降低其线粒体膜电位 [ J].癌症 , 2001;20(8):887-888.
[ 6] 　ChenQM, TuVC.Apoptosisandheanfailure:mechanismsand
therapeuticimplications[ J].Am JCardiovascDrugs, 2002, 2
(1):43-5.
[ 7] 　FernandezMe, CkRJ.Apoptosissuppressionbybcl-2iscorrela-
tedwiththeregulationofnuclearandcytosclicCa2+[ J] .Onco-
gene, 1996, 12(11):2259-2266.
[ 8] 　谢　萍.自由基与细胞凋亡 [ J] .生物学教学 , 2004;29(1):3-
4.
[ 9] 　Lueken-ArdjomandeS, MartinouJC.Newcomersintheprocessof
mitochondrialpermeabilization[ J] .CelSci, 2005, 118(3):473-
83.
964
2008年 7月
第 30卷　第 7期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
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