全 文 ：收稿日期:2009-12-11
基金项目:贵州省教育厅自然科学类科研项目资助(黔教科 2007052)。
作者简介:卢文芸(1969-),女(彝族),贵州毕节人;副教授 , 主要从事
植物生理生化研究。
通讯作者:乙　引 , E-mail:yiyin@gz139.com.cn。
环草石斛愈伤组织和拟原球茎中生物碱和多糖含量的研究
卢文芸 1 , 　张宇斌 2 , 　罗迎春 1 , 　何可群1 , 　李洪庆 3 , 　乙　引 2
(1.贵州民族学院化学与环境科学学院 , 　贵阳 550025;　2.贵州师范大学生命科学学院 , 　贵阳 550001;
3.贵州大学生化工程中心 , 　贵阳 550025)
摘要:用苯酚-浓硫酸法和溴甲酚绿酸性染料比色法测定了不同培养条件下得到的环草石斛愈伤组织和拟原球茎中总生
物碱和多糖的含量。结果表明 ,愈伤组织和拟原球茎具备了代替原植物作为药用和提取原药成分的可能性;悬浮培养的
愈伤组织中总生物碱和多糖的含量最高。该研究结果为从环草石斛愈伤组织中直接提取原药成分的研究提供了参考。
关键词:　环草石斛愈伤组织;拟原球茎;总生物碱;多糖
中图分类号:　S567　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2010)03-0033-03
StudyonTotalAlkaloidsandPolysaccharidesintheCalusandthePLBsof
D.loddigesi.inDiferentCultureCondition
LUWen-yun1 , ZHANGYu-bin2 , LUOYing-chun1 , HEKe-qun1 , LIHong-qing3 , YIYin2
(1.ColegeofChemistryandEnvironmentscience, GuizhouUniversityforNationalities, Guiyang550025, China;
2.ColegeofLifeSciences, GuizhouNormalUniversity, Guiyang550001, China;
3.EngineeringCenterforBiochemistry, GuizhouUniversity, Guiyang550025, China)
Abstract:Thecolorimetrymethodofbromocresolgreenandphenol-vitriolwasusedtodeterminetotalalkaloids
andpolysaccharidesinthecalusandthePLBsofDendrobiumloddigesiwhichcultivatedindiferentcondi-
tions.TheresultsindicatedthatthecalusandthePLBshadtheposibilitywhichtheoriginalefectivecompo-
nentscouldbedirectlyextracted.Theaccumulationofsecondarymetaboliteinthecaluswhichculturedinsus-
pensionwerehigherthanthatofthePLBs.Theresultsprovidedbasicdatumfortheresearchofextractingthe
originalefectivecomponentsdirectlyfromthecalusofD.loddigesi..
Keywords:　ThecalusofDendrobiumloddigesi;PLBs;totalalkaloids:polysaccharides
　　环草石斛(DendrobiumloddigesiRolfe.)为兰科石
斛属多年生草本植物 ,被认为是一种优质的药用石斛
品种 ,是药用石斛重要的原植物之一 ,有养阴益胃 、生
津止渴 、清热等功效 [ 1] 。现代科学研究表明 , 石斛主
要成分为多糖和生物碱 ,其药理作用与二者有着密切
关联[ 2 ～ 5] 。环草石斛与其它石斛一样 ,同样存在着生
长缓慢 ,自然繁殖率低 ,资源短缺等问题 [ 6] ,为解决环
草石斛对野生和栽培的依赖 ,利用植物组织及细胞培
养生产有用的次生代谢产物是行之有效的方法 [ 7] 。
但是 ,目前涉及到不同培养条件下得到的环草石斛愈
伤组织和拟原球茎(PLBs)中次生代谢物含量研究的
文献少见报道。因此 , 有必要在原来研究的基础
上 [ 6, 9 ～ 13] ,继续探索不同培养条件对环草石斛愈伤组
织和拟原球茎中主要的次生代谢产物 ———石斛碱和石
斛多糖积累的影响。为此 ,用溴甲酚绿酸性染料比色
法 [ 14, 15]和苯酚 -浓硫酸法 [ 15, 16]测定了不同培养条件下
得到的环草石斛愈伤组织和拟原球茎中多糖和总生物
碱的含量 ,并对其进行分析比较 ,为从环草石斛拟原球
茎和愈伤组织中直接提取原药成分的研究提供参考 。
1　材料与方法
1.1　材　料
环草石斛(D.loddigesiRolfe.)的愈伤组织和拟原
球茎(PLBs)已继代培养 1年。实验材料的鲜样先用
蒸馏水洗净 ,在滤纸上吸干水分 , 105 ℃杀青 15min,
再置于 80℃恒温烘箱中烘至恒重 ,用研钵研碎 ,过 60
目筛 ,分别用样品袋装好贴上标签置于干燥器皿中
保存。
1.2　仪器与试剂
SW-CJ-2FD型医用净化工作台;WSZ-100-A型振
荡器;高压蒸汽灭菌锅;7550型分光光度计。
pH4.5缓冲溶液:0.2M邻苯二甲酸氢钾(pH4),
用 0.2M氢氧化钠调至 pH4.5。
·33·
研究报告　　卢文芸 等:环草石斛愈伤组织和拟原球茎中生物碱和多糖含量的研究
0.04%溴甲酚绿溶液:称取溴甲酚绿 40.0mg,加
100mlpH4.5缓冲溶液溶解 ,滤过即得 。
0.01N氢氧化钠无水乙醇溶液。
石斛碱标准工作液(10μg/ml):精密称取石斛碱
1.00mg,置 100ml容量瓶中 ,加氯仿至刻度 ,摇匀 。
苯酚试液:称取 10 g苯酚 ,溶于 150 g重蒸水即
得 。置棕色瓶内 ,放冰箱中备用 。
葡萄糖标准工作液(100μg/ml):精密称取 105℃
干燥至恒重的标准葡萄糖 100 mg,置 100ml容量瓶
中 ,加水溶解 ,稀释至刻度 ,摇匀 。精密吸取 10ml置
100ml容量瓶中 ,加水稀释至刻度即得 。每 10μl含葡
萄糖 1μg。
浓氨水 、浓硫酸(比重 1.84)、氯仿 、无水乙醇等均
为分析纯试剂。
1.3　方　法
1.3.1　培养基及培养条件:各种固体培养基如无特别
说明均为含有 1%琼脂和 3%蔗糖的 MS1培养基(MS
1培养基的大量元素是 MS的一半 ,其余配方同 MS);
悬浮培养时液体培养基不含琼脂 。所用培养基均用
0.2mol的 HCl或 KOH调节 , pH值为 5.8 ～ 6.2,在
0.1 ～ 0.15MPa(120 ～ 125℃)下高压蒸汽灭菌 15 ～
20min。固体培养时 ,温度(25±2)℃,光周期 12h/12
h,光照强度 1 500 ～ 2 000lx, MS1+2, 4-D(0.1 ～ 2.0)
mg/L;悬浮培养时 ,摇床转速为 100r/min,其余培养条
件与固体培养时一致 [ 11] 。
1.3.2　愈伤组织和拟原球茎的继代培养:以种子做外
植体进行无菌播种产生原球茎 (protocorm), 通过茎
段 、茎尖 、芽 、节 、叶片 、幼根等适宜外植体可以诱导形
成拟原球茎(protocorm-likebodies, PLBs),原球茎或拟
原球茎继续分化 ,就可培养获得再生植株[ 6] 。实验发
现:以环草石斛的茎尖 、茎段上部的节(2个节以内)作
为外植体 ,均可诱导出白色颗粒状愈伤组织 [ 11] (图 1、
2),该实验中所得到的环草石斛拟原球茎均为固体培
养时或液体培养时 ,愈伤组织所分化形成(图 3、4)。
愈伤组织和拟原球茎固体培养时的继代培养基为 MS
1+2, 4-D(0.1 ～ 2.0)mg/L;悬浮培养时的继代培养基
为 MS1+2, 4-D(0.1 ～ 2.0)mg/L,摇床转速为 100r/
min,培养基中不加琼脂 ,其余培养条件与固体培养时
一致[ 11] 。
1.3.3　总生物碱的测定:用碱性氯仿提取生物碱 ,用
溴甲酚绿酸性染料比色法 [ 14]测定其含量。
1.3.4　多糖含量的测定:用 80%乙醇提取分离干扰
组分后 ,再用水提取多糖 ,以浓硫酸-苯酚比色法 [ 16]测
定其含量。
图 1　固体培养的愈伤组织
图 2　悬浮培养的愈伤组织
图 3　愈伤组织在固体培养基上增殖分化形成拟原球茎
图 4　悬浮培养中愈伤组织分化形成的拟原球茎
·34·
第 29卷　第 3期　2010年 3月　　　 　　 　 　　　　　种　子　(Seed)　　　 　　　　 　 　　Vol.29　No.3　Mar.　2010
2　结果与分析
2.1　不同培养方式下得到的环草石斛拟原球茎和愈
伤组织中总生物碱和多糖含量的比较
　　结果表明 , MS1固体培养基比 MS固体培养基更
有利于环草石斛的愈伤组织的增殖。在 MS1+2, 4-D
(0.1 ～ 0.2)mg/L+3%蔗糖的固体培养基上 ,愈伤组
织表现出旺盛的增殖能力 [ 11] ;比较适宜诱导愈伤组织
的固体培养基是 MS1+2, 4-D(0.1 ～ 2.0)mg/L+3%
蔗糖 ,新形成的愈伤组织继续培养一段时间后 ,如不及
时继代培养极易分化成拟原球茎 (PLBs)[ 11] ;环草石
斛悬浮培养的愈伤组织 ,如果在 70 d后仍未转接 ,那
么愈伤组织分化形成拟原球茎(PLBs),并继续分化形
成玻璃化的无根小苗 ,最后褐化死亡 [ 11] 。当把悬浮培
养的愈伤组织接种到固体培养基上后 ,增殖不明显 ,分
化现象突出 , 30d后愈伤组织就开始分化形成 PLBs;
在同等条件下 ,愈伤组织在液体培养中增殖的速度比
固体培养上快很多 ,而且愈伤组织分散性及同步性好 ,
如果及时转接 ,愈伤组织几乎不出现分化 [ 11] 。为了研
究不同培养方式对环草石斛愈伤组织和 PLBs中次生
代谢物含量的影响 ,用苯酚 -浓硫酸法和溴甲酚绿酸性
染料比色法测定了不同培养条件下得到的环草石斛愈
伤组织和拟原球茎中多糖和总生物碱的含量 [ 14 ～ 16] ,并
对它们进行分析比较 。
表 1　不同培养方式下得到的环草石斛愈伤组织和拟
原球茎中总生物碱和多糖含量的比较
材　　料 总生物碱(%) 多糖(%)
固体培养的拟原球茎 0.035 6 6.09
悬浮培养的拟原球茎 0.041 6 12.49
固体培养的愈伤组织 0.049 6 10.36
悬浮培养的愈伤组织 0.054 5 13.08
　　从表 1可看出:悬浮培养时 ,环草石斛愈伤组织和
拟原球茎中总生物碱和多糖的含量都分别比固体培养
时高;无论是固体培养 ,还是悬浮培养 ,愈伤组织中总
生物碱和多糖的含量都比拟原球茎中的高;悬浮培养
的愈伤组织中总生物碱和多糖含量都比固体培养时
高 。说明当大规模培养时 ,液体培养比固体培养更为
方便实际 [ 7, 8] 。环草石斛悬浮培养的愈伤组织增长
快 ,总生物碱和多糖含量比拟原球茎高 ,其多糖含量与
野生环草石斛当年生和一年生植株相当 ,总生物碱含
量也与野生植株相当 [ 12] 。
3　讨　论
实验结果表明 ,愈伤组织和拟原球茎具备了代替
原植物作为药用和提取原药成分的可能性 。虽然环草
石斛野生鲜植株中多糖的含量高于愈伤组织 [ 12] ,且组
培苗中总生物碱的含量高于悬浮培养的愈伤组织[ 12] ,
但由于愈伤组织的悬浮培养不仅可以改变靠大面积栽
培或野生资源来获得原料的传统习惯 [ 7] ,而且由于愈
伤组织的悬浮培养具有生物合成的全能性 ,又不受地
理 、气候等条件的限制 ,污染小 ,方便实行工业化生产 ,
可节省土地 ,降低成本 ,缩短生产周期 ,并且产率是相
对于生长和含量两因素而言 。综合考虑认为 ,可以完
全把愈伤组织作为器官层面上的生物反应器 ,用于直
接组织生产 。这样 ,不仅可以缩短生产流程 ,降低生产
成本;更重要的是 ,可以不受环境的限制 ,摆脱自然的
束缚 ,用工厂化的理念来规模生产环草石斛的原药 。
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