全 文 ：不同培养条件对环草石斛愈伤组织中次生代谢产物的影响
卢文芸 1 ,张宇斌2 ,罗迎春 1 ,何可群 1 ,李洪庆 3 ,乙引 2＊　(1.贵州民族学院化学与环境科学学院 ,贵州贵阳 550025;2.贵州
师范大学生命科学学院 ,贵州贵阳 550001;3.贵州大学生化工程中心 ,贵州贵阳 550025)
摘要　[目的 ]探索环草石斛生长与其主要的次生代谢产物———石斛碱和石斛多糖积累之间的关系。 [方法 ]用苯酚-浓硫酸法和溴甲
酚绿酸性染料比色法测定了不同培养条件对环草石斛愈伤组织中的多糖和总生物碱含量的影响。 [结果]环草石斛悬浮培养的愈伤组
织生长曲线呈“S”型。在光照条件下 ,环草石斛悬浮培养的愈伤组织中总生物碱和多糖含量的积累与其生长基本同步 ,光照有利于悬浮
培养愈伤组织的生长和多糖的积累;在暗培养条件下 ,愈伤组织生长缓慢 ,多糖的积累不与其生长同步 ,但暗培养却可以提高愈伤组织
中总生物碱的含量。 [结论]环草石斛生长与其主要的次生代谢产物———总生物碱和石斛多糖积累之间有着密切的关系 ,不同培养条件
对环草石斛中次生代谢产物具有一定的影响。
关键词　光照;通气量;环草石斛愈伤组织;总生物碱;多糖
中图分类号　S682.31　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)33-16365-04
InfluencesofDifferentCultureConditionsontheSecondaryMetabolitesinDendrobiumloddigesiCali
LUWen-yunetal　(ColegeofChemistryandEnvironmentalScience, GuizhouUniversityforNationalities, Guiyang, Guizhou550025)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtoexploretherelationshipbetweenthegrowthofDendrobiumloddigesiianditsmainsecondaryme-
tabolites-thedendrobineandtheaccumulationofdendrobiumpolysaccharides.[ Method] Thephenol-concentratedsulphuricacidcolorimetry
andbromocresolgreenaciddyecolorimetrywereusedtodeterminetheefectsofdiferentcultureconditionsonpolysaccharidesandtotalalka-
loidsinthecalusofD.loddigesi.[ Result] ThegrowthcurveofcalusofD.loddigesiinsuspensionculturewas“S” type.Underthecultu-
ringconditionoflight, theaccumulationofpolysaccharidesandtotalalkaloidsinthecalusofD.loddigesiinsuspensionculturewasbasicaly
synchronizedwithitsgrowth.Thelightwasbeneficialforthegrowthofcallusinsuspensioncultureandtheaccumulationofpolysaccharides.
Butundertheconditionofdark, thecalusgrewslowlyandtheaccumulationofpolysaccharideswasnotsynchronizedwithitsgrowth.Butthe
darkculturecouldenhancetheaccumulationoftotalalkaloidsgreatly.[Conclusion] TherewereacloserelationshipbetweenthegrowthofD.
loddigesianditsmainsecondarymetabolites– thedendrobineandtheaccumulationofdendrobiumpolysaccharidesandthedifferentculture
conditionshadsomeinfluencesonthesecondarymetaboliteofD.loddigesi.
Keywords　Ilumination;Ventilation;Dendrobiumloddigesicallus;Totalalkaloids;Polysaccharides
基金项目　贵州省教育厅自然科学类科研项目(黔教科 2007052)。
作者简介　卢文芸(1969-),女 ,彝族 , 贵州毕节人 ,副教授 ,从事植物
生理生化研究。 ＊通讯作者 , E-mail:yiyin@gz139.com.cn。
收稿日期　 2009-07-22
　　环草石斛(DendrobiumloddigesiRolfe.)为兰科(Orchi-
daceae)石斛属(DendrobiumSw.)多年生草本植物 ,自古就被
认为是一种优质的药用石斛品种 ,是药用石斛重要的原植物
之一 ,有养阴益胃 、生津止渴 、清热等功效 [ 1] 。现代科学研究
表明 ,石斛主要成分为多糖和生物碱 ,其药理作用与二者有
着密切关联 [ 2-5 ] 。环草石斛与其他石斛一样 ,同样存在着生
长缓慢 、自然繁殖率低 、资源短缺等问题 [ 6] 。为解决环草石
斛对野生和栽培的依赖 ,利用植物组织及细胞培养生产有用
的次生代谢产物是行之有效的方法 [ 7] 。但是 ,目前涉及不同
培养条件对环草石斛愈伤组织生长和次生代谢物积累之间
的研究文献少见报道。因此 ,有必要在前人研究的基础
上 [ 6, 8-12] ,继续探索环草石斛生长与其主要的次生代谢产
物 ———石斛碱和石斛多糖积累之间的关系 ,探索不同培养条
件对环草石斛中次生代谢物的影响 。笔者用苯酚 -浓硫酸
法和溴甲酚绿酸性染料比色法测定了不同培养条件对环草
石斛愈伤组织中的多糖和总生物碱含量 [ 13-15]的影响 ,为从
环草石斛愈伤组织中直接提取原药成分的研究提供了参考。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试材料。环草石斛的愈伤组织由贵州师范大学生
命科学学院组培室提供 ,已继代培养 1年;试验材料的鲜样
先用蒸馏水洗净 ,在滤纸上吸干水分 , 105 ℃杀青 15 min,再
于 80 ℃恒温烘箱中烘至恒重 ,用研钵研碎 ,过 60目筛 ,分别
用样品袋装好并贴上标签 ,置于干燥器中保存 。
1.1.2　仪器与试剂。SW-CJ-2FD型医用净化工作台;WSZ-
100-A型振荡器;高压蒸汽灭菌锅;7550型分光光度计。
pH值 4.5缓冲溶液:0.2 mol/L邻苯二甲酸氢钾(pH值
4.0),用 0.2 mol/L氢氧化钠调 pH值至 4.5。 0.04%溴甲酚
绿溶液:称取溴甲酚绿 40.0 mg,加 100mlpH值 4.5缓冲溶
液溶解 ,滤过即得。 0.01 mol/L氢氧化钠无水乙醇溶液。石
斛碱标准工作液(10 μg/ml):精密称取石斛碱 1.00 mg,置
100ml容量瓶中 ,加氯仿至刻度 ,摇匀。苯酚试液:称取 10 g
苯酚 ,溶于 150 g重蒸水即得 ,置棕色瓶内 ,放冰箱中备用。
葡萄糖标准工作液(100 μg/ml):精密称取 105 ℃干燥至恒
重的标准葡萄糖 100 mg,置 100 ml容量瓶中 ,加水适量使其
溶解 ,稀释至刻度 ,摇匀。精密吸取 10 ml置 100 ml容量瓶
中 ,用水稀释至刻度即得。每 10μl含葡萄糖 1μg。浓氨水 、
浓硫酸 、氯仿 、无水乙醇等均为分析纯试剂 。
1.2　方法
1.2.1　总生物碱的测定 。用碱性氯仿提取生物碱 ,用溴甲
酚绿酸性染料比色法 [ 13]测定其含量。
1.2.2　多糖含量的测定。用 80%乙醇提取分离干扰组分
后 ,再用水提取多糖 ,以浓硫酸 -苯酚比色法 [15]测定其含量。
2　结果与分析
2.1　光照和通气量对环草石斛愈伤组织中总生物碱积累的
影响　由图 1、2可知 ,摇床的转速对环草石斛愈伤组织中总
生物碱的含量影响很大 ,不管是光培养还是暗培养 ,在转速
为 100 r/min时 ,愈伤组织中总生物碱的含量表现为最高。
而在转速为 120 r/min下培养的环草石斛愈伤组织到 40d左
右 ,其总生物碱含量已开始下降。这可能是由于愈伤组织开
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(33):16365-16368 责任编辑　熊章琴　责任校对　况玲玲
始出现褐化后 ,在液体培养基中产生一些不利于愈伤组织生
长的物质 ,这些物质可能会导致愈伤组织的分解代谢加强 ,
减少了总生物碱合成前体物的供给 ,从而影响总生物碱的合
成 。在曲线上就表现出愈伤组织生长量和总生物碱含量呈
下降的趋势。同等条件下光培养和暗培养的愈伤组织中总
生物碱的含量与其生长呈正相关 ,除在 120 r/min下培养的
环草石斛愈伤组织外 ,其他从开始培养到第 50天左右 ,总生
物碱含量一直平稳增长 ,第 50天达到积累高峰 ,然后缓慢下
降 。值得注意的是 ,在黑暗培养下 ,愈伤组织中总生物碱的
积累量比光培养下的高 ,大约是接种时的 2.3 ～ 3.9倍 ,其最
大值约是光培养下的 2倍 ,但是由于暗培养下生长量比光培
养的低很多 ,所以它的生物碱总量还是比光培养下的少 。可
知 ,适宜的转速有利于环草石斛愈伤组织中总生物碱的积
累;黑暗比光照有利于环草石斛愈伤组织中总生物碱的积
累 ,愈伤组织中总生物碱的含量积累并非随光强的增加而增
加 。从环草石斛愈伤组织生长及其总生物碱含量变化的曲
线可以看出:愈伤组织悬浮培养的最适转接时间为第 50天
左右 。与固体培养基相比 ,在整个液体培养过程中未见拟原
球茎出现。
图 1　光对不同转速下环草石斛愈伤组织中总生物碱积累的影响
Fig.1　Effectofiluminationontheaccumulationoftotalalkaloids
ofcalusfromD.loddigesiatdiferentrotationspeed
图 2　黑暗对不同转速下环草石斛愈伤组织中总生物碱积累的影响
Fig.2　Efectofdarknessontheaccumulationoftotalalkaloidsof
calusfromD.loddigesiatdifferentrotationspeed
2.2　光照和通气量对悬浮培养液中总生物碱积累的影响　由
图 3、4可知 ,随着培养时间的延长 ,悬浮培养液中总生物碱
的含量呈 “S”性变化 ,与愈伤组织细胞团中总生物碱的积累
规律是一致的 。与图 1和图 2进行比较 ,发现绝大部分生物
碱在细胞团中积累 ,推测悬浮培养液中的生物碱是由细胞中
分泌到溶液中的 ,也有可能是破碎细胞释放出来的。关于悬
浮液中的生物碱的来源 ,需要进一步试验证实。另外 ,从环
草石斛愈伤组织悬浮培养液中总生物碱含量变化的曲线可
以看出:悬浮培养中总生物碱的含量在第 50天左右为最高
(120 r/min下环草石斛愈伤组织培养液除外)。
图 3　光对不同转速下环草石斛愈伤组织悬浮培养液中总生物碱
积累的影响
Fig.3　Effectofilluminationontheaccumulationoftotalalka-
loidsinthesuspensioncultureliquidofcalusfromD.
loddigesiatdiferentrotationspeed
图 4　黑暗对不同转速下环草石斛愈伤组织悬浮培养液中总生物
碱积累的影响
Fig.4　Effectofdarknessontheaccumulationoftotalalkaloids
inthesuspensioncultureliquidofcalusfromD.loddige-
siatdiferentrotationspeed
　　由表 1可知 ,悬浮培养液中总生物碱总量比愈伤组织中
总生物碱总量低很多;转速为 100 r/min时悬浮培养液中总
生物碱占其愈伤组织中总生物碱的百分含量最高 ,转速为
120r/min时最低。尽管培养液中的含量低 ,但是因其体积
大 ,所以总生物碱的总量应该还是可观的。因此 ,不能轻易
否定环草石斛愈伤组织悬浮培养液的价值 ,尤其是在大规模
工业化生产时 ,更要考虑综合开发和利用。
2.3　光照和通气量对环草石斛愈伤组织中多糖积累的影
响　由图 5、6可知 ,光照下环草石斛悬浮培养的愈伤组织中
多糖含量与其生长基本同步 ,培养前 10 d,多糖含量稍有下
降 ,从第 10天以后 ,多糖含量迅速增加 ,在第 50天时达到最
大值 ,随后多糖含量又逐渐下降;而在黑暗条件下 ,随着培养
时间的增加 ,多糖含量在不断下降 ,愈伤组织多糖的积累与
其生长呈负相关 。这可能与光照下愈伤组织能进行光合作
用有关 。总之 ,光对愈伤组织中总生物碱和多糖积累的影响
是不同的。另外 ,在试验中发现 ,随着光强的增加 ,环草石斛
愈伤组织中多糖的含量逐渐升高 ,在多糖积累高峰期 ,收获
后的多糖含量大约是接种时的 1.7 ～3.4倍。
16366 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
表 1　黑暗条件下愈伤组织中总生物碱积累总量与培养液中总生物碱积累总量的比较
Table1　ComparisionofthetotalalkaloidcontentinthecalusandtheculturesolutionofthecalusfromD.loddigesiindark
转速∥r/minRotationspeed
愈伤组织中 Calus
含量∥%Content 总量∥μgTotalamount
悬浮培养液中Suspensioncultureliquid
含量∥μg/mlContent 总量∥μgTotalamount
悬浮培养液中总生物碱总量占愈伤组织中总生物碱总量的比例∥%Proportionoftotalalkaloidcontentinthesuspensioncultureliquidinthatinthecalus
60 0.031 0 3 008 2.01 75 2.49
80 0.034 5 3 588 3.53 151 4.22
100 0.054 5 3 956 5.01 252 6.37
120 0.032 6 3 395 2.96 77 2.27
图 5　光对不同转速下环草石斛愈伤组织中多糖积累的影响
Fig.5　Efectofiluminationontheaccumulationofpolysaccha-
roseofcalusfromD.loddigesiatdiferentrotationspeed
图 6　黑暗对不同转速下环草石斛愈伤组织中多糖积累的影响
Fig.6　Effectofdarknessontheaccumulationofpolysaccharose
ofcallusfromD.loddigesiatdiferentrotationspeed
2.4　悬浮培养的愈伤组织生长和总生物碱 、多糖积累的关
系　对于高等植物细胞大量培养生产有用代谢产物来说 ,光
照条件是一个很重要的物理因子。据 Butcher报道 [ 16] ,光影
响着植物体内酶的活性和次生代谢产物的积累 ,光照处理得
当 ,可收到显著的效果。
以环草石斛愈伤组织在 MS1+2, 4-D0.1 mg/L+3%蔗
糖 , pH值 5.8 ～ 6.2,摇床转速 100 r/min,培养温度(25 ±
2)℃,光周期 12 h/12 h,光照强度(0, 500 ～ 1 000)lx等条件
下悬浮培养 50d的统计情况来比较愈伤组织的生长量 、总生
物碱和多糖积累的关系。试验结果表明 ,光培养比暗培养更
有利于环草石斛愈伤组织的生长和多糖的积累;但是 ,暗培
养却比光培养更有利于提高环草石斛愈伤组织中总生物碱
的含量 。由表 2可知 ,培养 50 d后 ,愈伤组织收获量的干重
在光培养下大约是接种时的 4.03倍 ,在暗培养下大约是接
种时的 1.15倍;收获后的愈伤组织中总生物碱含量在光培
养下大约是接种时的 2.17倍 ,在暗培养下大约是接种时的
3.89倍;收获后的愈伤组织中总生物碱总量在光培养下大约
是接种时的 8.84倍 ,在暗培养下大约是接种时的 4.52倍;收
获后的愈伤组织中多糖含量在光培养下大约是接种时的
3.34倍 ,在暗培养下其含量比接种时还低;收获后的愈伤组
织中多糖总量在光培养下大约是接种时的 13.45倍 ,在暗培
养下大约仅是接种时的 1.15倍 。
表 2　光培养和暗培养条件下环草石斛愈伤组织的生长和生物碱、多糖积累情况
Table2　TheaccumulationoftotalalkaloidsandpolysaccharoseofcallusofD.loddigesiunderthecultureconditionsoflightanddark
培养条件
Cultureconditions
接种量g(DW)
Inoculationamount
增长率∥%
Growthrate
收获量g(DW)
Harvestedamount
总生物碱含量∥%Contentoftotalalkaloids
接种时
Attheinoculationtime
收获后Afterharvesting
总生物碱总量∥mg(DW)Totalamountoftotalalkaloids
接种时
Attheinoculationtime
收获后Afterharvesting
多糖含量∥%Polysaccharosecontent
接种时
Attheinoculationtime
收获后Afterharvesting
多糖总量∥mg(DW)Totalamountofpolysaccharose
接种时
Attheinoculationtime
收获后Afterharvesting
光培养 0.18 403.0 0.725 4 0.014 0 0.030 4 0.002 5 0.022 1 3.92 13.08 0.705 6 9.488 2
Lightculture
暗培养 0.18 114.9 0.206 8 0.014 0 0.054 5 0.002 5 0.011 3 3.92 3.91 0.705 6 0.808 6
Darkculture
　　由图 7、8可知 ,在光培养下 ,环草石斛愈伤组织中总生
物碱和多糖的积累与其生长基本同步;随着环草石斛愈伤组
织鲜重增殖率的增加 ,总生物碱和多糖积累也逐渐升高 ,在
鲜重增殖率达到最高时 ,总生物碱和多糖的积累也达到最
高 ,之后 ,随着鲜重增殖率的下降 ,总生物碱和多糖的积累减
缓或下降。由图 9、10可知 ,在暗培养下 ,愈伤组织生长缓
慢 ,多糖的积累与其生长呈负相关 ,但黑暗培养却提高了愈
伤组织中总生物碱的含量;随着环草石斛愈伤组织鲜重增殖
率的增加 ,总生物碱的积累也逐渐升高 ,在鲜重增殖率达到
最高时 ,总生物碱的积累也达到最高 ,之后 ,随着鲜重增殖率
的下降 ,总生物碱的积累逐渐下降 。造成这种结果的原因可
能是光照促进了植物的糖代谢 ,减少了生物碱合成前体物的
供给 ,从而影响生物碱的合成。
3　结论与讨论
(1)研究结果表明 ,环草石斛生长与其主要的次生代谢
产物———总生物碱和石斛多糖积累之间有着密切的关系 ,不
同培养条件对环草石斛中次生代谢产物具有一定的影响。
环草石斛悬浮培养的愈伤组织生长曲线呈 “S”型 [ 10] ;在光照
16367　37卷 33期　　　　　　　　　　　　卢文芸等　不同培养条件对环草石斛愈伤组织中次生代谢产物的影响
图 7　光照下悬浮培养的环草石斛愈伤组织生长和总生物碱积累
的关系
Fig.7　Relationshipbetweenthecalusgrowthandtheaccumu-
lationoftotalalkaloidsofsuspensionculturedcalusfrom
D.loddigesiinlight
图 8　光下悬浮培养的环草石斛愈伤组织生长和多糖积累的关系
Fig.8　Relationshipbetweenthecalusgrowthandtheaccumu-
lationofpolysaccharoseofsuspensionculturedcalus
fromD.loddigesiindark
图 9　黑暗下悬浮培养的环草石斛愈伤组织生长和总生物碱积累
的关系
Fig.9　Relationshipbetweenthecalusgrowthandtheaccumu-
lationoftotalalkaloidsofsuspensionculturedcalusfrom
D.loddigesiindark
条件下 ,环草石斛悬浮培养的愈伤组织中总生物碱和多糖含
量的积累与其生长基本同步 ,光照有利于悬浮培养愈伤组织
的生长和多糖的积累;在暗培养条件下 ,愈伤组织生长缓慢 ,
多糖的积累不与其生长同步 ,但暗培养却可以提高愈伤组织
中总生物碱的含量。愈伤组织具备了直接提取原药成分的
可能性。
图 10　黑暗下悬浮培养的环草石斛愈伤组织生长和多糖积累的
关系
Fig.10　Relationshipbetweenthecalusgrowthandtheaccumu-
lationofpolysaccharoseofsuspensionculturedcalus
fromD.loddigesiindark
　　(2)由于实验室培养的愈伤组织具有生物合成的全能
性 ,又不受地理 、气候等条件的限制 ,污染小 ,方便实行工业
化生产 ,可节省土地 ,降低成本 ,缩短生产周期 。因此 ,把愈
伤组织作为生物反应器是工厂化生产环草石斛次生代谢产
物的有效途径。
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