免费文献传递   相关文献

NaCl胁迫对高粱根、叶鞘和叶片液泡膜ATP酶和焦磷酸酶活性的影响



全 文 :1999-03-22收到 , 1999-08-30接受。
国家自然科学基金(39570076)和山东省自然科学基金(Q99D11)资
助项目。
NaCl胁迫对高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜ATP 酶和焦磷酸酶活性的影响
王宝山1 邹 琦2
(1山东师范大学生物系 ,济南 250014;2山东农业大学生命科学院 ,泰安 271018)
摘要:NaCl 胁迫初期 , Na+主要在根和叶鞘中积累。
相应地 , 根和叶鞘液泡膜 ATP 酶 和焦磷酸酶水解活
性 、依赖 ATP 和 PPi 的质子泵活性及 Na+/H+逆向转
运活性均明显增加 , 根和叶鞘的生长没有受到抑制。
NaCl胁迫后期 , Na+开始向地上部分运输并在叶片中
积累。此时 , 叶片液泡膜质子泵和 Na+/H+逆向转运
活性开始增加 , 根和叶鞘的 Na/K 比增加 , 其液泡膜
ATP酶 和焦磷酸酶水解活性 、质子泵活性和 Na+/H+
逆向转运活性下降。相应地 ,根和叶鞘的生长也下降 。
当保温介质中 Na/K 比超过 1 时 , 液泡膜微囊 ATP 酶
和焦磷酸酶活性均随 Na/ K比的增加而下降。表明非
盐生植物液泡膜质子泵在盐胁迫的初期对 Na+在液泡
内的积累及其耐盐性起重要作用。
关键词:高粱 , 根 、叶鞘和叶片液泡膜 ATP酶 , 根 、叶鞘
和叶片液泡膜焦磷酸酶 , NaCl胁迫 , Na+积累
学科分类号:Q945
  土壤盐渍化是灌溉农业的重要问题之一 。世
界上盐渍化土壤约占可耕地面积的 10%。我国有
3亿多亩盐荒地和 1亿多亩盐渍化土壤 ,约占可耕
地面积的 25%。盐渍化土壤中最主要的离子是
Na
+ ,其浓度往往高于 25 mmol/L ,在这种土壤上绝
大多数作物的生长发育受到明显抑制。所有作物
均属于甜土植物或称非盐生植物 ,它们对Na+是敏
感的(Greenway 和 Munns 1980 , Flowers 等 1977 )。
生理学研究表明 ,作物尤其是禾本科作物的耐盐性
与其拒Na+特性有关(Greenway 和 Munns 1980 , 王
宝山等1997a)。也就是说在一定盐胁迫下 ,作物根
Na+含量明显高于地上部分。而在细胞水平上 ,植
物只有维持细胞质中低 Na+水平才能避免或降低
盐害(Flowers等 1977)。细胞的拒 Na+能力主要受
质膜和液泡膜控制。质膜一方面以其选择性吸收
功能 ,对 K+的相对吸收高于 Na+(Rubio 等 1995 ,
Schachtman和 Schroeder 1994 , Liu 和 Zhu 1998);另
一方面 , 它通过其上的 Na+/H+逆向转运蛋白把
Na+泵出细胞外。但这种 Na+/H+逆向转运蛋白
仅在某些盐生植物和海洋单细胞藻类中发现
(Lǜttge 和 Ratajczak 1997)。液泡膜则通过液泡膜
上的 Na+/H+逆向转运蛋白把细胞质中 Na+泵入
液泡中并加以积累(Gabarino 和 Dupont 1988 , Barkla
等1995 , Ballesteros等1997)。而Na+/H+逆向转运
蛋白所需动力是液泡膜上的 ATP 酶和焦磷酸酶所
产生的跨膜质子驱动力(proton motive force , pmf)。
盐胁迫显著增加根液泡膜质子泵活性(Matsumoto
和Chung 1988 , Nakamura等1992)和NaCl适应的悬
浮细胞的液泡膜质子泵活性(Reuveni等 1990 , Low
等 1996)。说明液泡膜质子泵及Na+/H+逆向转运
蛋白在植物耐盐性中通过减少或避免细胞质内盐
浓度过高而起作用(王宝山等 1996)。
高粱是全球性重要的粮食和饲料作物 ,具有较
强的耐盐和耐旱性 ,因而多种植于中等盐渍化土壤
上(Francois等 1984)。高粱在经过一段时间低浓度
盐预处理后其耐盐性明显高于未经盐预处理的对
照(Amzallag 等 1990)。外源 ABA提高了高粱对盐
胁迫的适应(Amzallag 等 1993)。NaCl胁迫下 ,高粱
根 、叶鞘和叶片生长受到抑制的程度不同 ,其 Na+
含量也不同(王宝山等 1997b ,王宝山等 2000)。本
文用耐盐性较强的高粱品种独角虎为材料 ,研究高
粱根 、叶鞘和叶片液泡膜 ATP 酶和焦磷酸酶水解
活性和质子泵活性在胁迫过程中的变化 ,高粱不同
器官液泡膜上有无 Na+/H+逆向转运蛋白活性 ,以
及这些变化与Na+在这些器官中积累的关系。旨
在了解液泡膜质子泵和 Na+/H+逆向转运蛋白在
高粱耐盐性中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
高粱(Sorghum bicolor L.)为耐盐性品种独角
虎 ,由山东农业科学院作物研究所杂粮研究室赠
送。挑选大小一致 , 籽粒饱满的种子 。用 0.1%
HgCl2溶液表面消毒 8 min 。自来水冲洗 5次 ,通气
浸泡 12 h后均匀播种于洗净的河沙中。每盆 20
粒 ,每天浇1/2浓度的 Hoagland营养液。温室温度
为 22 ~ 28℃/15 ~ 20℃(白天/黑夜)。RH 为 45%
181植物生理学报 , Acta Phytophysiologica Sinica 2000 , 26(3):181~ 188
~ 55%/60%~ 70%。补充光照使达到叶片表面的
光强约为 200μmol m-2 s-1 。光照时间 14 h/d。播
种后第8天(幼苗为2叶1心)开始NaCl处理 ,NaCl
溶液用1/2浓度的 Hoagland营养液配制 ,每天递增
25 mmol/L 至 100 mmol/L。尔后用 100 mmol/L 溶
液继续处理 ,分别在第0 、1 、2和 7 天把高粱植株从
沙子中小心取出 ,迅速洗掉根表面沙子 ,吸干 。并
把第 1叶叶鞘和叶片分开。分别测定有关生理指标。
1.2 Na+和 K+测定
方法同王宝山等(1997b)。
1.3 液泡膜微囊的制备
按每克鲜材料加 2 ml匀浆缓冲液 ,其组成为:
蔗糖 250mmol/L 、MgSO4 3 mmol/L 、EGTA 3mmol/L 、
PVP 0.5%(W/ V)、 PMSF 0.2 mmol/L 、 DTT 1
mmol/L和 Tricine 100 mmol/L ,用 Tris调 pH 至 7.8。
用高速匀浆器匀浆 3次 ,每次 2 s。4层纱布过滤 ,
滤液 10 000×g , 2 ~ 4℃(Beckman J2-21型离心机 ,
JA20转头)离心 30 min。上清液小心加到 24%
(W/W)蔗糖溶液上 , 蔗糖溶液用含有 EGTA 1
mmol/L 、MgSO4 3 mmol/ l 、DTT 2 mmol/L 和 Hepes 10
mmol/L(用Tris 调 pH至 7.5)的溶液配制。105 000
×g , 2 ~ 4℃(Beckman L7-65 型离心机 , SW40转
头)离心 90 min。收集 0%~ 24%蔗糖界面的液泡
膜并用稀释缓冲液稀释 3 ~ 4倍 ,其组成为:MgSO4
3 mmol/L 、PMSF 1 mmol/L、DTT 1 mmol/L 和 Hepes
50 mmol/L ,用 KOH 调 pH 至 7.0。80 000×g , 2 ~
4℃(Beckman L7-65型离心机 , Model65转头)离心
30 min。弃去上清液 , 并仔细吸干 ,沉淀溶解于悬
浮缓冲液 , 其组成为:甘油 40%(V/ V)、MgSO4 3
mmol/L、DTT 1 mmol/L和 Hepes 10 mmol/L ,用KOH
调 pH 至 7.0。所制备的液泡膜微囊先用液氮速
冻 ,然后于-72℃冷冻保存。
1.4 液泡膜 ATP酶和焦磷酸酶水解活性测定
参考 Fischer-Schliebs(1997)方法。液泡膜 ATP
酶和焦磷酸酶水解活性分别用它们水解 ATP 和
PPi释放的 Pi 量来表示。ATP 酶水解活性的反应
介质为 0.5 ml , 含 KCl 50 mmol/L 、Na2MoO4 0.1
mmol/ L 、Brij58(布里剂 58)0.002%(W/ V)、NaN3
1 mmol/L 、MgATP 3mmol/L和 Tricine 25 mmol/L(用
Tris调 pH 至 7.5)。加入 2 μg 蛋白质的液泡膜微
囊以启动反应 ,在 37℃恒温水浴中保温 30 min ,加
入0.1 ml 20%TCA终止反应。取反应液 0.2ml用
蒸馏水补充到 3 ml ,加入 2 ml硫酸亚铁钼酸铵试
剂 ,摇匀后 2 ~ 60 min 在 722 型分光光度计(660
nm)上比色 。空白对照为不加液泡膜微囊的反应
液。液 泡 膜 ATP 酶 水 解活 性 表 示 为 不 含
Bafilomycin A1(一种大环内酯类抗生素)和有
Bafilomycin A1 20 nmol/L 时活性之差 ,即 Bafilomycin
A1 抑制的水解活性。液泡膜焦磷酸酶水解活性测
定基本上与液泡膜ATP 酶水解活性测定相同 。以
Na4PPi 0.2 mmol/L(焦磷酸钠)代替MgATP 3mmol/L ,
含有 MgSO4 2 mmol/L , 以含有 KCl 50 mmol/L 和不
含KCl活性之差表示液泡膜焦磷酸酶水解活性 ,即
指K+刺激的液泡膜焦磷酸酶水解活性。由于每
mol PPi水解释放 2 mol Pi ,故水解活性应除以 2。
1.5 液泡膜质子泵活性的测定及 Na+/H+逆向转
运活性测定
参考 Blumwald和 Polle(1987)方法。依赖 ATP
的和依赖 PPi的质子泵活性用单位时间 、单位膜蛋
白的荧光淬灭值来表示 。反应液总体积为 2.5 ml ,
含蔗糖 250 mmol/L 、KCl 100 mmol/L 、 NaN3 1
mmol/L 、吖啶橙(acridine orange)5 μmol/L 、Tris-ATP
3mmol/L 或Na4PPi 0.2 mmol/L、Tricine 20 mmol/L 、
用Tris调 pH 至 7.5 , 加入 40μg 膜蛋白 ,于28℃预
保温约 4 min ,加入 MgCl2 使其终浓度为 3 mmol/L
启动反应 。用上海第三分析仪器厂生产的 960 型
电脑自动记录荧光分光光计记录最大荧光值(F),
荧光淬灭值(ΔF)。激发光为 495 nm ,发射光为 540
nm ,狭缝为 2 nm 。质子泵活性用 ΔF/F mg-1蛋白
min-1来表示。而Na+/H+逆向转运活性则用当质
子梯度趋于平衡时 ,即 F 趋于最大时 ,加入 EGTA
使其终浓度为 3 mmol/L ,以螯合 Mg2+而清除液泡
膜ATP 酶活性 ,尔后加入葡萄糖钠使其终浓度为
20mmol/L ,记录荧光恢复值(ΔF ), Na+/H+逆向
转运活性以 ΔF /ΔF μg-1蛋白min-1表示。
1.6 蛋白质含量测定
用 Bradford(1976)方法。
2 结果
2.1 NaCl胁迫对生长和 Na+、K+含量的影响
NaCl胁迫对高粱根 、叶鞘和叶片不同器官的
鲜重和干重的影响不同(表 1)。100 mmol/L 的
NaCl胁迫 1 d时对根 、叶片和叶鞘鲜重均无显著影
响。胁迫 2 d时对叶鞘鲜重影响最明显 ,下降到占
对照的 87.0%,根的鲜重略有下降 ,而对叶片鲜重
仍无显著影响。胁迫 7 d 时 ,三者均明显下降 ,但
182 植 物 生 理 学 报                  26 卷
仍以叶鞘鲜重受到的影响最为严重。如果以干重
为单位 ,只有根的干重在胁迫 2 d后随胁迫时间的
延长而下降 ,而叶片的干重随胁迫时间延长而增
加 ,叶鞘的干重虽随胁迫时间延长而下降 ,但仍高
于对照 。根和叶鞘中 Na+含量均随胁迫时间延长
而成倍增加 ,胁迫 1 d时即增加 4倍多 。胁迫 7 d
时叶鞘中Na+含量比对照增加9.5倍 。与根和叶
鞘相比 ,叶片中Na+含量在胁迫初期增加很少 ,只
有在胁迫 7 d时才成倍增加 。根 、叶片和叶鞘中
K+含量对 NaCl 胁迫表现出不同反应类型 ,根中
K
+含量随胁迫时间延长而明显下降 ,叶鞘中 K+含
量则随胁迫时间增加而明显增加 ,而叶片中 K+含
量在 2 d之前则没有明显变化 , 7 d时显著增加 。
根和叶鞘 Na/K比成倍增加 ,叶片略有增加(表 1)。
表 1 NaCl胁迫对高粱根 、叶鞘和叶片生长及其 Na+、K+含量和 Na/K 比的影响
Table 1 Effects of NaCl stress on the root , sheath and blade growth of sorghum seedlings and their Na+ , K+cotents and Na/K ratio
Plant part Time(d) Fresh weight(g/plant)
Dry weight
(g/plant)
Cation contents(μmol/g FW)
Na K Na/K
Root 0 18.66±0.78a(100.00) 1.09±0.05a(100.00) 19.67±0.78a(100.00) 37.11±2.54a(100.00) 0.53a
1 18.93±1.07a(101.45) 1.25±0.05b(114.68) 85.42±6.56b(434.27) 34.44±2.06b(92.81) 2.48b
2 17.21±0.68b(92.23) 1.03±0.03b(94.50) 98.59±7.89b(501.22) 26.86±1.61b(72.38) 3.67b
7 15.10±0.71b(80.92) 0.94±0.03b(86.24) 109.76±7.68b(558.01) 21.03±1.56b(56.67) 5.22b
Sheath 0 3.00±0.21a(100.00) 0.26±0.01a(100.00) 16.27±0.52a(100.00) 90.39±5.42a(100.00) 0.18a
1 3.00±0.23a(100.00) 0.35±0.02b(134.62) 75.32±3.27b(462.94) 107.60±6.02b(119.04) 0.70b
2 2.61±0.18b(87.00) 0.33±0.01b(126.92) 91.23±4.67b(560.73) 123.28±6.16b(136.39) 0.74b
7 2.20±0.12b(73.33) 0.31±0.02b(119.23) 154.11±9.54b(947.20) 135.18±7.04b(149.55) 1.14b
Blade 0 1.92±0.13a(100.00) 0.28±0.02a(100.00) 25.59±0.63a(100.00) 94.78±5.65a(100.00) 0.27a
1 2.10±0.12a(109.38) 0.32±0.02b(114.29) 35.05±2.32b(136.97) 97.36±6.02a(102.72) 0.36b
2 1.81±0.09a(94.27) 0.34±0.01b(121.43) 38.58±3.02b(150.76) 98.92±5.89a(104.35) 0.39b
7 1.59±0.12b(82.81) 0.36±0.02b(128.57) 108.12±5.08b(422.51) 102.28±7.13b(107.91) 1.07b
Data are means(n=5)±SE.Data with different letters in the same column showed significant difference at P=0.05 level.
2.2 液泡膜 ATP酶和焦磷酸酶水解活性
用蔗糖密度梯度(0%/24%,W/W)离心法分
离获得高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜微囊 。用不同抑
制剂鉴定液泡膜纯度(表 2)。在高粱液泡膜 ATP
酶活性最适 pH(7.5)条件下 ,总ATP 酶活性受到液
泡膜ATP酶专一性抑制剂(NO-3 和 Bafilomycin A1)
的强烈抑制 ,而质膜 ATP 酶(P-型)专一性抑制剂
(钒酸根离子),线粒体ATP 酶(F-型)专一性抑制剂
(叠氮钠)对总 ATP 酶活性的抑制作用都很小 。
根 、叶鞘和叶片之间总 ATP 酶活性对不同抑制剂
响应相似 。相对而言 ,叶片液泡膜微囊的纯度稍差
一些 ,因为叶片 Bafilomycin A1抑制的 ATPase活性
只占总ATP 酶活性的 48.1%,而根和叶鞘分别沾
55.0%和 58.3%。说明所制备的膜微囊主要是液
泡膜微囊 。0.002%Brij 58足以使所有内面向外类
型(inside-out)液泡膜微囊 ATP 酶催化部位与其底
物结合 ,从而使两种类型液泡膜微囊 ATP 酶均产
生水解活性 , 作为总活性(100%)的话 , 而不加
Brij58只有胞质面向外类型(right-side out)液泡膜
微囊 ATP 酶产生水解活性 ,两者活性百分数之差
即为内面向外类型液泡膜微囊所占比例 , 根占
40%左右 ,而叶鞘和叶片占 30%左右。
  浓度为 100 mmol/L 的 NaCl胁迫下根 、叶鞘和
叶片液泡膜ATP 酶和焦磷酸酶活性变化如图 1所
示。在非盐胁迫下 ,根和叶鞘液泡膜 ATP 酶活性
明显高于叶片 ,实验过程中三者活性均无明显变
化。NaCl胁迫第 1天时 ,根和叶鞘液泡膜 ATP 酶
活性成倍增加 ,第 2天时降至接近对照的水平 ,至
第 7天时已明显低于对照。叶片液泡膜 ATP 酶活
性在胁迫初期缓慢增加 ,至第 2天时达最大值 ,尔
后一致维持在这个水平(图 1A)。在非盐胁迫下 ,
液泡膜焦磷酸酶活性的大小顺序是:叶片>叶鞘>
根。实验的第 1天后 ,根和叶鞘液泡膜焦磷酸酶活
性均缓慢增加。叶片液泡膜焦磷酸酶活性第 1天
前轻微增加 ,尔后下降。第 2天后三者均保持相对
稳定 。NaCl胁迫后 ,根和叶鞘液泡膜焦磷酸酶活
性在胁迫第 1天均明显增加 ,尔后即下降 。胁迫第
2天时 ,根液泡膜焦磷酸酶活性已下降到低于对照
1833期       王宝山等:NaCl胁迫对高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜ATP 酶和焦磷酸酶活性的影响
表 2 高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜微囊的特征
Table 2 Characterization of the tonoplast vesicles of sorghum roots , sheaths and blades
ATPase activity(μmol mg-1 protein h-1)
Root Sheath Blade
pH 7.5
 No Brij 58* 10.2±2.8(60.4) 13.8±2.6(73.4) 2.4±0.5(70.6)
 Brij 58 0.002% 16.9±3.1(100.0) 18.8±3.9(100.0) 3.4±0.3(100.0)
 No KCl 27.0±2.7(86.3) 29.9±3.9(81.0) 5.8±0.4(54.7)
 KCl 50 mmol/L 31.3±1.8(100) 36.9±5.9(100) 10.6±0.8(100)
 Bafilomycin A1 20 nmol/L 14.0±1.8(44.7) 15.5±2.1(42.0) 5.5±0.3(51.9)
 KCl 50 mmol/L+azide 1 mmol/L 27.6±4.1(88.2) 32.7±4.9(88.6) 8.4±1.3(79.2)
 KCl 50 mmol/L+azide 1 mmol/L +KNO3 50 mmol/L 16.0±1.6(51.1) 16.3±0.9(44.2) 5.9±0.4(55.7)
 Bafilomycin A1-sensitive ATPase activity** 17.2±2.1(55.0) 21.5±1.8(58.3) 5.1±0.3(48.1)
pH 6.5
 KCl 50 mmol/L 28.4±3.7(100) 30.0±4.1(100) 15.6±1.2(100)
 KCl 50 mmol/L + vanadate 0.1 mmol/ L 20.7±1.7(72.9) 21.0±1.8(70.0) 11.4±0.8(73.1)
ATP hydrolysis activity were determined in the presence of different inhibitors or stimulators and Brij 58 0.002%(W/ V).Data are means
±SE(n=9).Data in brackets are percentages of control.The tonoplast vesicles were harvested from the band between 0% and 24%
(W/W)sucrose.*The activity in the presence of Brij 58 is total activity expressed as 100% and proportion of the inside-out vesicles was
calculated from difference of 100% and the percentage of activity in the absence of Brij 58.**Bafilomycin A1-sensitive tonoplast ATPase
activity was calculated as the difference of the data obtained in the presence of KCl 50 mmol/ L , and KCl 50 mmol/ L and Bafilomycin A1 20
nmol/ L.
水平 ,而叶鞘仍高于对照 。叶片液泡膜焦磷酸酶活
性在胁迫第1天时没有明显变化 ,第 2天时成倍增
加 ,而后缓慢下降 ,但至第 7天时仍高于对照(图
1B )。
2.3 液泡膜质子泵活性
依赖 ATP 的和依赖 PPi的质子泵活性对 NaCl
胁迫的响应不同(图 2)。除了胁迫第 7天时 ,根依
赖ATP的质子泵活性受到严重抑制外 ,NaCl胁迫
显著促进根 、叶鞘和叶片依赖 ATP 的质子泵活性
(图 2A)。从时间进程来看 ,在 NaCl 胁迫初期 ,根
和叶鞘依赖 ATP 的质子泵活性先增加 ,尔后下降 ,
胁迫 7 d时 ,根依赖ATP的质子泵活性已降至对照
的12%左右 。叶片ATP 依赖的质子泵活性随时间
的增加而一直增加 ,胁迫到第 7天时达最高值 。相
对依赖ATP 的质子泵活性而言 ,根 、叶鞘和叶片依
赖PPi的质子泵活性对 NaCl胁迫更敏感(图 2B)。
NaCl胁迫 1 d时 , 根和叶鞘依赖PPi的质子泵活性
明显增加 ,第 2天时开始下降 ,且根已降至对照的
70%左右 。第 7 天时根和叶鞘依赖 PPi的质子泵
活性均明显低于对照。叶片依赖 PPi的质子泵活
性在 NaCl胁迫初期没有明显变化 ,胁迫至第 7天
时开始下降。
图 1 NaCl 100 mmol/ L处理的高粱幼苗根 、叶鞘和叶片液
泡膜 ATPase(A)和 PPase(B)活性的变化
Fig.1 Changes in tonoplast ATPase(A)and PPase(B)activities
in roots , sheaths and blades of sorghum seedlings treated with NaCl
100 mmol/L
Data are means(n=5)±SE.
184 植 物 生 理 学 报                  26 卷
图 2 NaCl 100 mmol/ L 处理的高粱幼苗根 、叶鞘和叶片依
赖ATP(A)和依赖 PPi(B)的液泡膜质子泵活性
Fig.2 ATP-dependent(A)and PPi-dependent(B)proton pump
activity of the tonolpast vesicles prepared from the roots , sheaths
and blades of sorghum seedlings treated with NaCl 100 mmol/ L
Data are means(n=5)±SE.
2.4 液泡膜 Na+/H+逆向转运活性
在非盐胁迫下 ,高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜上
存在着Na+/H+逆向转运活性 ,而且三者之间没有
明显区别 。100 mmol/L 的NaCl胁迫第 2天时 ,根 、
叶鞘和叶片液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白活性均
明显增加 ,但以叶鞘增加最为明显 ,其次是根(图
3)。
2.5 外源 Na/K比对液泡膜 ATP酶和焦磷酸酶
活性的效应
当保温介质中含有 50 mmol/L 的 KCl时 ,液泡
膜微囊 ATP 酶活性最高 。随着保温介质中 Na/K
比的增加 ,液泡膜微囊 ATP 酶活性直线下降(图
4)。液泡膜微囊焦磷酸酶活性在保温介质中Na/K
比为 0.5时最高 ,达 1 时即抑制其活性 ,尔后随着
保温介质中 Na/K 比增加焦磷酸酶活性逐渐下降
(图 5)。
3 讨论
  近几年的研究表明只有某些盐生植物质膜上
图 3 NaCl 100 mmol/L处理 2 d的高粱幼苗根 、叶鞘和叶片
液泡膜 Na+/H+逆向转运活性
Fig.3 Na+/H+ antiport activity of tonoplast-enriched vesicles
prepared from the roots , sheaths and blades of sorghum seedlings
treated with NaCl 100 mmol/L for 2 d
Data are means(n=5)±SE.
图 4 分析介质中 Na/K 比对对照高粱叶鞘液泡膜微囊
H+-ATPase 活性的影响
Fig.4 Effect of ratio of Na/K in assay medium on H+-ATPase
activity of tonoplast-enriched vesicles prepared from control
sorghum sheaths
Data are means(n=5)SE.Na+ and K+ ware added as NaCl and
KCl.
有Na+-ATP 酶和 Na+/H+逆向转运蛋白 ,把细胞
质中Na+泵出细胞外。而非盐生植物和典型积盐
型盐生植物则主要是把 Na+区域化到液泡中。一
方面降低细胞质 Na+ ,维持其低 Na/K 比 ,另一方
面作为渗透调节物质(王宝山等 1996 , Lǜttge 和
Ratajczak 1997 , Liu和 Zhu 1998)。有关根 、叶鞘和
叶片液泡膜ATP酶 ,焦磷酸酶及质子泵活性在胁
1853期       王宝山等:NaCl胁迫对高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜ATP 酶和焦磷酸酶活性的影响
图 5 分析介质中 Na/K 比对对照高粱叶鞘液泡膜微囊
H+-PPase活性的影响
Fig.5 Effect of ratio of Na/K in the assay medium on PPase ac-
tivity of tonoplast vesicles prepared from control sheaths of sorghum
seedlings.
Na+and K+were in NaNO3 and KNO3.Data are means(n=5)±
SE.
迫过程的变化及其与 Na+在这些器官中的积累的
关系研究甚少。本实验所用的高粱幼苗具有较强
的耐盐性 ,其耐盐阈值可达 135 mmol/L 的 NaCl(王
宝山等 1997b)。NaCl处理初期 ,根 、叶鞘和叶片鲜
重没有明显变化 ,后期显著下降。而干重除了根的
干重与鲜重变化相似 ,叶鞘和叶片干重均随盐处理
时间延长显著增加 , 这可能与其 Na+ 、K+积累有
关。NaCl处理初期根中 Na+含量就成倍增加 ,而
K+含量显著下降 ,从而导致 Na/K比超过 1。叶片
中Na+含量在NaCl处理初期略有增加 ,而 K+含量
没有明显变化 ,因此 , Na/K 比远低于 1。叶鞘中
Na
+含量也成倍增加 ,但 K+含量却显著增加 ,因
此 ,Na/K比也远低于 1。根 、叶鞘和叶片之间的最
大区别是根和叶鞘主要是由含有大中央液泡的薄
壁细胞组成 ,其功能是吸收和储藏 。而叶片则主要
是由叶肉细胞组成 ,其特点含有大量叶绿体 ,其功
能是光合作用 ,液泡所占体积较小 。在一定程度盐
胁迫下 ,高粱根和叶鞘一方面积累Na+ ,减少向叶
片的运输 ,另一方面把根中 K+转运到叶鞘和叶片
中 ,从而维持叶片细胞质低 Na/K 比。这与植物个
体水平耐盐性相一致(Greenway 和 Munns 1980)。
非盐生植物根似乎没有把 Na+分泌到土壤中的机
制(Jeschke 1984)。我们用分根实验证明高粱根具
有把Na+分泌到土壤中的能力 ,但仅占吸收Na+的
10%~ 15%,而且只在低盐处理中起作用(王宝山
等2000)。这就说明高粱的耐盐性主要是把Na+区
域化到液泡中 。
Na
+在液泡中的积累是一个逆浓度梯度的过
程 ,依赖于液泡膜质子泵所建立的跨液泡膜质子驱
动力 ,质子驱动力驱动液泡膜 Na+/H+逆向转运 。
这在盐生植物和非盐生植物均得到证实(王宝山等
2000)。但许多非盐生植物 ,特别是盐敏感植物的
液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白在进化过程中丢失
(Mennen等 1990)。
NaCl胁迫下 ,根和叶鞘液泡膜 ATP 酶和焦磷
酸酶水解活性 、质子泵活性首先明显增加 ,尔后逐
渐下降 ,叶片液泡膜 ATP 酶和焦磷酸酶水解活性
和依赖ATP 的质子泵活性尔后增加并维持较高活
性。高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜上存在 Na+/H+逆
向转运活性 ,NaCl胁迫刺激根和叶鞘 Na+/H+逆向
转运活性 。这些结果表明 ,NaCl胁迫下高粱根 、叶
鞘和叶片液泡膜质子泵活性和 Na+/H+逆向转运
活性的变化是与 Na+在这些器官中的积累相一致
的。这也证明 ,非盐生植物的根和叶鞘的液泡在盐
胁迫的初期起到Na+库的作用 ,减少Na+向地上部
分功能叶片和生长点的运输 。但是 ,长期盐胁迫就
使根和叶鞘液泡的 Na+达饱和状态 ,就会首先在这
些器官的细胞质中积累 ,继而过多 Na+运输到地上
部分功能叶片 ,导致细胞质 Na/K比增加 ,从而使
液泡膜 ATP 酶和焦磷酸酶活性下降 ,最终导致生
长抑制。本文用体外实验证明保温介质中 Na/K
比超过 1时对高粱液泡膜 ATP 酶和焦磷酸酶活性
均产生明显抑制。这和 NaCl胁迫下叶鞘和叶片内
Na/K比及其液泡膜质子泵活性变化基本吻合。但
根则不尽一致 ,根在胁迫第 1 天时 Na/K 比就达
2.48 ,而此时液泡膜质子泵活性最高 ,尔后逐渐下
降。与叶鞘和叶片相比 ,在非盐胁迫下 ,根中 Na/K
比就几乎是叶片的 2倍 ,叶鞘的 3倍 。这可能与液
泡膜质子泵的器官专一性及同功酶有关(Lǜttge 和
Ratajczak 1997),详细机制有待研究 。
参 考 文 献
Amzallag GN , Lerner HR , Poljakoff-Mayber A(1990).Induction
of increased salt tolerance in Sorghum bicolor by NaCl pre-
treatment.J Exp Bot , 41:29~ 31
Amzalag GN , Seligmann HA (1993).A development window for
salt-adaptation in Sorghum bicolor.J Exp Bot , 44:645 ~
652
186 植 物 生 理 学 报                  26 卷
Ballesteros E , Blumwald E , Donaire JP, Belver A(1997).
Na+/ H+ antiport activity in tonoplast vesicles isolated from
sunflower roots by NaCl stress.Physiol Plant , 99:328 ~
334
Barkla JB , Zingarelli L , Blumwald E , Smith JAC(1995).Tono-
plast Na+/H+ antiport activity and its energization by the
vacuolar H+-ATPase in the halophytic plant Mesembryan-
themum crystallinum L.Plant Physiol , 109:549~ 556
Blumwald E , Polle RJ (1987).Salt tolerance in suspension cul-
tures of sugar beet.Plant Physiol , 83:884~ 887
Bradford MM(1976).A rapid and sensitive method for the quan-
titation of microgram quantities of protein utilizing the priciple
of protein-dye binding.Anal Biochem , 72:248~ 254
Fischer-Schliebs E , Ball E , Berndt E , Besemfelder-Butz E ,
Binzel ML, Drobny M , Mǜhlenhoff D , Mǜller M , Rakowski
K , Ratajczak R(1997).Differential immunological cross-re-
actions with antisera against the V-ATPase of Kalanchoe dai-
gremontiana reveal structural differences of V-ATPase sub-
units of different plant species.Biol Chem , 378:1131 ~
1139
Flowers TJ , Troke PI , Yeo AR (1977).The mechanism of salt
tolerance in halophytes.Annu Rev Plant Physiol , 28:89 ~
121
Francois LE , Donovan T , Maas EV(1984).Salinity effects on
seed yield , growth and germination of grain sorghum.Agron
J , 76:741~ 744
Gabarino J , Dupont FM (1988).NaCl induces a Na+/H+ an-
tiport in tonoplast vesicles from barley roots.Plant Physiol ,
86:231 ~ 236
Greenway H , Munns R(1980).Mechanism of salt-tolerance in
nonhalophytes.Annu Rev Plant Physiol , 31:141~ 190
Jeschke WD(1984).K+-Na+ exchange at cellular membranes.
Intracellular compartmentation of cations and salt tolerance.
In:Stamples RC , Tonniessen GH (eds).Salinity Tolerance
in Plants-Strategies for Crop Improvement.NY:Wiley-Inter-
science , 37 ~ 66
Liu JP , Zhu JK (1998).A calcium sensor homolog required for
plant salt tolerance.Sci , 280:1943~ 1945
Low R, Rockel B , Kirsch M , Ratajczak R , Hortensteiner S ,
Martinoia E , Lǜttge U , Rausch T(1996).Early salt stress
effects on the differential expression of vacuolar H+(ATPase
genes in roots and leaves of Mesembryanthemum crys-
tallinum.Plant Physiol , 110:259~ 265
Lǜttge U , Ratajczak R(1997).The physiology , biochemistry and
molecular biology of the plant vacuolar ATPase.In:Leigh
RA , Sanders D(eds).Advances in Botanical Research(Vol
25).The Plant Vacuole.Oxford:Academic Press , 253 ~
296
Matsumoto H , Chung GP(1988).Increase in proton-transport ac-
tivity of tonoplast vesicles as an adaptive response of barley
roots to NaCl stress.Plant Cell Physiol , 29:1133 ~ 1140
Mennen H , Jacoby B , Marschner H(1990).Is sodium proton an-
tiport ubiquitous in plant cells? J Plant Physiol , 137:180~
183
Nakamura Y , Kasamo K , Shimosato N , Sakata M , Ohta E
(1992).Stimulation of the extrusion of protons and H+-
ATPase activities with the decline of pyrophosphatase activity
of the tonoplast in intact mung bean roots under high NaCl-
stress and its relation to external levels of Ca2+ ions.Plant
Cell Physiol , 32:139~ 149
Reuveni M , Bennett AB , Bressan RA , Hasegawa PM(1990).
Enhanced H+-transport capacity and ATP hydrolysis activity
of the tonoplast H+-ATPase after NaCl adaptation.Plant
Physiol , 94:524~ 530
Rubio F , Gassmann W , Schroeder JI(1995).Sodium-driven
potassium uptake by the plant potassium transporter HKT1
and mutations conferring salt tolerance.Sci , 270:1660 ~
1663
Schachtman DP , Schroeder JI (1994).Structure and transport
mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter
from higher plants.Nature , 370:654~ 658
Wang BS(王宝山), Zou Q(邹  琦), Zhao KF(赵可夫)
(1996).Advances in the vacuolar translocating proteins and
salt tolerance in plants.Chin Bull Bot(植物学通报), 13:
30~ 36(in Chinese)
Wang BS(王宝山), Zhao KF(赵可夫), Zou Q (邹 琦)
(1997a).Advances in mechanism of crop salt tolerance and
strategies for raising crop salt tolerance.Chin Bull Bot(植
物学通报), 14:25~ 30(in Chinese)
Wang BS(王宝山), Zou Q(邹  琦), Zhao KF(赵可夫)
(1997b).Response of different organ growth of sorghum to
NaCl stress and the threshhold salinity.Acta Bot Boreali-Oc-
cident Sin(西北植物学报), 17:279 ~ 285(in Chinese)
Wang BS(王宝山), Zou Q(邹  琦), Zhao KF(赵可夫)
(2000).Effect of NaCl stress on ionic contents in different
organs of sorghum plants.Acta Agron Sin (作物学报), (in
press , in Chinese)
1873期       王宝山等:NaCl胁迫对高粱根 、叶鞘和叶片液泡膜ATP 酶和焦磷酸酶活性的影响
Effects of NaCl Stress on the Tonoplast ATPase and PPase Activity in
Roots , Sheaths and Blades of Sorghum Seedllings
WANG Bao-Shan1  ZOU Qi2
(1 Department of Biology , Shandong Teachers University , Jinan 250014;2 College of Life Science , Sandong Agricultural University , Taian 271018)
Abstract:During the early period of NaCl stress ,
Na
+
accumulated mainly in roots and sheaths
(Table 1).Correspondingly , the tonolast ATPase
and PPase hydrolysis activity(Fig.1), ATP- and
PPi-dependent proton pump activity andNa+/H+
antiport activity in roots and sheaths increased
significantly(Figs.2 , 3), but root and sheath
growth was not inhibited(Table 1).During the
later period of NaCl stress , Na+ began to be
transported to the shoots and accumulated in the
blades(Table 1).At this time , proton pump ac-
tivity and Na+/H+ antiport activity in the blades
also began to increase(Figs.2 ,3), ratio of Na/K
of the roots and sheaths increased(Table 1)and
their tonoplast ATPase and PPase hydrolysis activ-
ity(Fig.1), tonoplast proton pump activity and
Na
+/H+ antiport activity decreased(Figs.2 , 3).
Correspondingly , root and sheath growth was re-
duced(Table 1).ATPase and PPase activities of
the tonoplast vesicles decreased as the Na/K ratio
in the reaction medium rose to higher than 1
(Figs.4 , 5).These results indicated that the
tonoplast proton pump activity of nonhalophyte
plays an important role in Na+ accumulation in
vacuoles and salt tolerance during the early period
of salt stress.
Key words:Sorghum bicolor , tonoplast ATPase of the roots ,
sheaths and blades , tonoplast PPase of the roots , sheaths and
blades , NaCl stress , Na+ accumulation
188 Acta Phytophysiologica Sinica 2000 , 26(3):181 ~ 188