全 文 ：2　结果与分析
2.1　发酵培养基的优化实验表 2中极差 R1、R2 的大小可以得出各种营养因子对冰核活性和生物量影响的显著性。对冰核活性而言 , 极差最大的因素是 B(鱼蛋白胨)和 C(乳糖),依次分别是 A(甘油)、D(玉米浆), 即鱼蛋白胨和乳糖的影响都很显著 , 甘油居中 ,玉米浆影响最小;对生物量而言 , 极差最大的因素是 B(鱼蛋白胨), 依次分别是 C(乳糖)、A(甘油)、D(玉米浆), 即鱼蛋白胨影响最显著 ,乳糖次之 , 甘油第三 ,玉米浆最小。实验结果表明 , 鱼蛋白胨对 X.ampelinaTS206 的冰核活性和生物量均有较大程度提高 ,这可能是鱼蛋白胨中的多肽对 X .ampelinaTS206 的冰核活性蛋白表达具有增强作用。实验还表明 , 较高的乳糖浓度对冰核活性蛋白的表达和生物量的增长可能存在抑制作用。综合考虑冰核活性和生物量 , 确定一种较优水平的发酵培养基配方是:酵母粉 10g L、大豆蛋白胨 10g L、硫酸镁 0.5g L、蔗糖20g L、鱼蛋白胨 15g L、乳糖 1g L、甘油 20g L、玉米浆 10g L ,
pH 7.0。 表 3　正交实验结果分析
Freezing faction A B C D Dryw eight of bacteria A B C D
K1 221.7 223.3 233.3 220.0 K1 0.5196 0.5095 0.5591 0.5131
K2 218.3 216.6 216.7 228.3 K2 0.5655 0.5397 0.5081 0.5033
κ3 233.3 233.4 223.3 225.0 K3 0.5293 0.5652 0.5472 0.5980
κ1 73.9 74.4 77.8 73.3 κ1 0.1732 0.1698 0.1864 0.1710
κ2 72.8 72.2 72.2 76.1 κ2 0.1885 0.1799 0.1694 0.1678
κ3 77.8 77.8 74.4 75.0 κ3 0.1784 0.1884 0.1824 0.1793
R1 5.0 5.6 5.6 2.8 R2 0.0153 0.0186 0.0170 0.0115
Optimized A3 B3 C1 D2 Optimized A2 B3 C1 D3　　Ki means summation of corresponding comprehensive scores;κi=Ki 3;R is the maximum remainder ofκi.
2.2　发酵培养温度的优化经实验证明对数生长期的生长速率与培养温度有很大关系 ,一般是培养温度越高 , 生长速率越大[ 2] 。但 X.ampelina
TS206 的最适培养温度较低 ,因此在高于最适培养温度的情况下 ,细胞生长速率反而降低 , 同时不能有效的表达冰核活性蛋白。由图 1 所示 , 三种温度下 , 0 ～ 30h 时间范围内 ,细胞生长速率基本相当;在约 30 ～ 45h 这段时间内 , 23℃培养温度下的生长速率比 18℃高 , 按照一般细胞生长理论 , 这是正常的 , 但
23℃培养温度下的生长速率反而比 28℃高 , 说明从生物量角度考虑 , 23℃更适合 X.ampelinaTS206生长。图 1 还可看出 ,温度越高 ,到达稳定期的时间越早 , 发酵周期也就越短。
如图 2 所示 ,冰核活性蛋白表达的量 、活性与培养温度密切相关 , 在不适宜的温度下培养 , 获得的冰核活性是很低的。在 28℃,细胞的冰核活性很低 , 而 18℃的培养环境则可以获得较高的冰核活性 , 23℃时获得的冰核活性介于二者之间 , 实验充分说明冰核活性细菌表达冰核活性蛋白为条件胁迫性表
达 ,也就是存在明显的应激反应的特点[ 4] 。综合分析培养温度对生物量和冰核活性影响 , 较优的培养温度是 18℃, 获得最大生物量的发酵时间是 48h。故在该优化条件下发酵 , 可以获得较高的冰核活性 , 达到最大生物量。
3　结论通过研究发现 , 鱼蛋白胨和乳糖对 X .ampelinaTS206 的冰核活性和生物量的影响都很显著 ,甘油影响一般 , 玉米浆影响最小。对培养基中各种营养因子的组成和发酵温度进行了较系统的优化 , 获得了发酵制备高冰核活性细菌的发酵培养基 、发酵温度 , 这对冰核活性细菌的开发利用奠定了较好的基础。另外 , 微生物发酵实际最优发酵条件往往非常复杂 , 溶氧量 、
pH值等尚需进一步探讨。如果进行变温培养或者流加培养也许能获得更大的生物量和较优质的冰核活性蛋白。 另外 ,寻求廉价的培养基原料也是 X .ampelinaTS206 实现工业化的重要条件。冰核细菌的冰核活性及其应用已成为冷冻浓缩技术领域研究的新热点。尤其是 , 使用冰核蛋白进行冷冻浓缩可以更
好地保持食品原有风味 , 因此 ,开发前景广阔[ 6] 。参考文献:[ 1] 刘健 ,陈庆森.冰核活性细菌特有动力学初探[ J] .食品科学 , 2002,
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贝壳状革耳菌染料脱色作用的研究梅运军 ,胡道伟 ,鲁明波 ,朱雄伟 ,常天俊(华中科技大学生命科学与技术学院 , 湖北 武汉 430074)摘要:利用比色法研究了贝壳状革耳菌产漆酶体系在不同情况下对两种不同类型合成染料的降解脱色。结果表明 , 染料在较低浓度(10mg L)时 , 漆酶对其降解迅速而彻底;pH 值 、培养方式(静态培养 、摇瓶培养)对降解作用都有较大的影响;通过在不同时间(0d、6d、18d)向产酶体系中加入染料证实了漆酶活性与染料脱色率呈正相关。关键词:贝壳状革耳菌;合成染料;脱色;漆酶中图分类号:X703.1;Q949.32　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2002)06-0034-03
收稿日期:2002-07-18;修回日期:2002-09-26作者简介:梅运军(1975-),男 ,硕士生 ,从事环境微生物研究。
　　近年来 ,对白腐真菌的研究引起了广泛关注 , 其研究领域逐步涉及到多环芳烃 、氯代芳烃 、二氯苯胺 、染料 、炸药 、农药
等有机 、有毒物质的降解[ 1] ,显示了白腐菌在环保方面极大的应用前景。其降解作用是通过分泌的酶系来实现 , 该酶系由三种同工酶组成:木素过氧化物酶(Lignin peroxidase , 简称
Lip)、锰过氧化物酶(Mn-dependent peroxidase ,简称 Mnp)和漆酶(Laccase , 简称 Lac)。贝壳状革耳菌是一株生长迅速 、有选择性降解木素的优
良白腐菌[ 2] , 它所产生的木素降解酶为漆酶和锰过氧化物酶 ,
其中主要是漆酶[ 3] 。 Elithabeth等试验了白腐菌对 23种工业染料的脱色效果 ,结果表明只有漆酶活力和染料的脱色效果呈
现正相关 ,说明漆酶在染料脱色中起重要作用[ 4] 。本文考察了贝壳状革耳菌产漆酶体系对两种不同染料的降解能力。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌种:贝壳状革耳菌(Panus conchatus), 菌号 5.154 , 购自中科院微生物所。
1.1.2　培养基
PDA培养基(g L):土豆汁(煮沸过滤)20%(v v), 葡萄糖
20 ,MgSO4 1.5 , KH2PO4 3 , VB1(微量),琼脂 12 , pH 6.0。染料处理培养基(g L):葡萄糖 10 ,酒石酸铵0.5 , KH2PO4 2,MgSO4·7H2O 0.5 , CaCl2 0.075 ,微量元素溶液 10ml , Tween80 1 ,
VB1 1×10 -4 , pH 3.0。
图 1　漆酶分泌曲线
图 2　中性灰 2BL 浓度对脱色率的影响———10mg L;—＊—20mg L;—■—30mg L
　　微量元素溶液(g L):NaCl2 1.0 ,MgSO4·7H2O 3.0 , FeSO4·
7H2O 0.1 , CoSO4·7H2O 0.1 , CaCl2 0.1 , ZnSO4·7H2O 0.1 , CuSO4
34 第 12卷第 6 期　2002 年12月 Vol.12 , No.6　Dec.2002
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2002.06.024
图 3　酸性蓝 R浓度对脱色率的影响———10mg L;—＊—20mg L;—■—30mg L
图 4　中性灰 2BL加入时间对脱色率的影响
图 5　酸性蓝 R加入时间对脱色的影响
图 6　pH对染料脱色率的影响
图 7　pH对酶活的影响
·5H2O 0.01 , KAl(SO4)2 0.1 ,H3BO3 0.01 , NaMoO4 0.01 , NTA 1.5。
1.1.3　染料强酸性蒽醌染料:酸性蓝 R;金属络合偶氮染料:中性灰
2BL。
1.2　方法
1.2.1　菌丝体的制备:将 28℃固体培养条件下培养 5d 的菌体接种到 PDA 液体培养基中 , 每 250mL 的三角瓶中加 100mL液体培养基 ,接入菌体 , 120r min , 28℃恒温振荡 7d 待用。
1.2.2　染料废水色度测定:将处理过的染料废水抽滤 , 再经离心分离(6000r min , 20min), 用蒸馏水作对照 , 在岛津 UV-240分光光度计上测定染料废水的吸光度值。在低浓度时 , 染料的浓度与其最大特征吸收波长的吸光度值成正比 ,可用染料最大特征波长处的吸光度变化来反映染料浓度的变化。染料脱色率(Γ)的计算公式:Γ(%)=(A0-A t) A0×100%。
式中 A0 、At 分别表示初始时刻和 t时刻染料在特征波长处的吸光度值。
1.2.3　漆酶酶活的测定:取 0.5mmol L ABTS 溶液 2mL , pH
3.0、28℃下加入 2mL酶液启动反应 ,用失活的酶液作对照。测定反应前 3min 内λ=420nm 处吸光度的变化 ,以每分钟 OD 值
的增加计算酶的活力[ 5] 。
2　结果与分析
2.1　合成培养基中漆酶分泌曲线对高产漆酶培养基研究发现 , PDA和半合成(如加入麦芽汁)培养基中漆酶具有很高的活性 , 但在实际工业应用中因成本过高而成为工业应用的瓶颈。为此 , 作者将葡萄糖 、酒石酸铵 、pH 、Tween80 作为影响因子对高产漆酶培养基进行了优化。通过正交实验设计得到贝壳状革耳菌高产漆酶的合成培养基组成(g L):葡萄糖 10 , 酒石酸铵 0.5 , Tween80 1 , KH2PO4 2 ,
CaCl2 0.075 , MgSO4·7H2O 0.5 , 微量元素溶液 10mL , VB1 1 ×
10-4 , pH 3.0 。图1 显示了优化培养基中漆酶酶活随时间变化的曲线。在培养体系中 , 前期漆酶酶活随菌体培养时间延长
而增加 , 18d 后漆酶酶活达到最大 , 随后酶活又逐渐减小。 原因可能是前期菌体生长占优势 , 后期营养消耗殆尽 , 菌体生长受抑制而促进了次生代谢 , 培养基中酶活逐渐增加;后期酶活又不断下降 , 部分漆酶已经失活。
2.2　贝壳状革耳菌对染料的降解
2.2.1　染料浓度对降解作用的影响在灭菌培养基中分别加入两种不同的染料 , 使其终浓度分别为(mg L):10、20、30。每 250mL三角瓶中按照 10%(v v)接入上述制备的菌丝体悬浮液 , 工作体积为 100mL。其实验结果如图 2、3所示。图 2 表明 ,贝壳状革耳菌产漆酶体系对不同浓度的中性灰 2BL降解速率不同 , 脱色率也存在很大差别。随着脱色时间的延长 ,脱色率都呈上升趋势。菌体脱色 3d 后 , 三种不同浓度的中性灰 2BL脱色率分别为 82.5%、71.3%、45.7%,比较三种不同浓度下的质量降解效果就会发现 , 10mg L降解效果几乎是 30mg L的 2 倍 , 10mg L 降解效果和 20mg L 相差不大 ,但随着染料浓度增加 , 菌膜上因吸附残留的染料也逐渐增多。图 3也显示了同样趋势 ,菌体脱色 3d 后 ,对三种不同浓度的染料脱色率达到 92.3%、89.1%、57.6%, 只有 30mg L 染料溶液中的菌膜略带蓝色。比较图 2、3 ,从染料脱色率的曲线可以得出 , 贝壳状革耳菌对两种染料都有较好的脱色效果 , 但对酸性蓝 R的脱色能力要远高于中性灰 2BL。原因可能是贝壳状革耳菌产漆酶对蒽醌类染料有较好的降解效果 , 而对金属络合染料中的偶氮类染料的降解能力较弱 , 也可能是染料的加入限制了漆酶的产生或降低了漆酶活性。
2.2.2　染料加入时间对脱色率的影响由贝壳状革耳菌产漆酶曲线可知 , 前期漆酶酶活与时间呈正相关。因此实验选取了 0d、第 6d、第 18d 添加染料 , 考察染料加入时间与染料脱色率的关系。(染料取 20mg L)结果如图 4、5。比较图 4 、5可知 , 菌体对两种染料的脱色效果存在一定的差别 , 说明菌体对两种染料的降解能力存在差异 , 这与前面得到的结果一致;但图 4、5 也存在相同之处:随着染料加入时间的推后 , 菌体对染料的降解迅速而彻底 , 结合图 1 中漆酶酶活在前期与时间呈正相关 , 可见漆酶在染料降解中起着重要的作用。
2.2.3　间歇培养对染料脱色率的影响在实际工业处理染料废水中 , 菌体对染料的降解是处在一个动态体系中 , 本实验模拟了动态环境中菌体对染料的降解。当菌体在高产漆酶的培养基中培养到 18d 后 ,用染料溶液(20mg L)置换不同体积的培养液。分两种比例置换 , 置换 1 2
和 1 3(v v), 一定时间测定染料的脱色率。结果见表 1。表 1　间歇培养对染料处理的影响
处理时间(d) 1 2 3 菌体颜色
置换体积 中性灰2BL 酸性蓝R 中性灰2BL 酸性蓝 R 中性灰2BL 酸性蓝 R 中性灰 2BL 酸性蓝R
1 3(v v) 59.4% 64.3% 69.5% 78.6% 94.2% 97.6% 白色 白色
1 2(v v) 51.1% 58.6% 62.2% 68.6% 90.5% 95.7% 略带灰色 白色
表 2　粗酶液对染料的处理
染料处理时间(h) 2 4 8 12 24
中性灰 2BL(%) 31.7 45.3 57.2 68.5 75.6
酸性蓝 R(%) 41.5 47.1 60.3 75.2 89.8
　　由表 1 可知 ,贝壳状革耳菌能够直接降解染料 , 而且培养体系中置换体积为 1 3(v v)时 , 其降解速率和效果都较好 , 即在培养体系中染料浓度越低 , 其降解速率及其降解效果越好;而实际染料废水中 , 染料含量很低 , 所以用贝壳状革耳菌处理含上述两种染料的废水有一定的实际意义 。
2.2.4　粗酶液对染料的处理菌体在高产漆酶培养基中培养 18d 后抽滤 ,所得滤液即为粗酶液。向滤液中加入上述两种染料 , 终浓度为 20mg L。 脱
352002 年 12 月　　　　　　　　　　　　　贝壳状革耳菌染料脱色作用的研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
色效果见表 2。由此可知 ,在漆酶活性达到极值时处理染料 , 效果最好。比较表 2 和图 4、5得到 , 在培养基中染料浓度适当时 ,菌体脱色作用主要来自于培养体系中漆酶对染料的降解 ,菌膜对染料的吸附在本实验中几乎可以忽略。
2.2.5　pH值对染料脱色率的影响白腐菌处理染料废水时 ,处在一个复杂的体系中 ,环境中各种因子都会对白腐菌的脱色作用产生一定影响。 pH 值很大程度地影响酶的活力 , 从而影响了酶对整个反应体系的催
化作用[ 6 , 7] 。本实验考察了 pH 值对贝壳状革耳菌降解脱色染料作用以及对漆酶酶活性的影响 ,得到了如图 6 、7 所示结果。由图 6可知 , pH 值的变化对白腐菌的脱色作用有相当显著的影响 ,当 pH 值为 3.0～ 3.5 时 ,菌体的降解脱色效果较好 ,当 pH 值为 3.0 时 ,对中性灰 2BL、酸性蓝 R的脱色作用都达到最大 , 分别为 71.3%、89.1%, 随着 pH 值的增大 , 白腐菌的脱
色率逐渐减小 , 当 pH 值达到 6.0 时 , 白腐菌的脱色率达到最低 ,分别为 47.6%、54.3%,这与图 7 所示 pH 值对漆酶酶活影响一致 ,由此也可推测漆酶在染料脱色中起着重要作用。因此在用白腐菌处理染料废水时 ,维持水体一定的 pH 值是必要的。
2.2.6　培养方式对染料脱色率的影响在研究白腐菌对染料脱色降解作用时 , 采用了静置和摇瓶两种培养方式。结果如表 3。表 3　不同培养方式对染料脱色率的影响
处理时间(d) 1 2 3 菌体颜色
培养方式 中性灰2BL 酸性蓝 R 中性灰2BL 酸性蓝R 中性灰 2BL 酸性蓝 R 中性灰2BL 酸性蓝 R
静置 33.5% 40.7% 61.8% 76.6% 63.1% 79.2% 灰色 微蓝
摇瓶(120 min)59.5% 63.6% 68.4% 80.5% 71.3% 89.1% 微灰 白色　　从表 3数据可知 , 白腐菌置于摇瓶培养时明显对染料脱色有利 ,其原因是摇瓶条件加强了体系中溶氧传递 , 而漆酶对染料的降解过程是一个氧化过程 , 体系中一定的溶氧平衡是必需的 ,所以在对菌体进行深层发酵时 , 或是在其工业应用中必须提供溶氧。
3　结论
对白腐菌染料脱色能力的研究表明 , (1)白腐菌漆酶对两种不同染料都有较好的脱色效果 , 显示了漆酶在染料降解方面具有实际的应用价值;(2)通过用菌体培养体系与单独用粗酶液对染料降解的比较表明 , 在处理低浓度染料废水时 , 漆酶起着直接的降解作用;在处理高浓度的染料废水时 , 菌体对染料有一定的吸附 , 菌膜呈现一定颜色 , 通过比较上述两种处理方式脱色染料时发现 , 在对染料进行处理时 , 漆酶的降解脱色作用在染料的脱色中起着主导作用 ,在处理低浓度的染料废水时菌体的吸附作用几乎可以忽略 ,这与钞亚鹏等人报道漆
酶酶活与染料脱色呈现正相关相吻合[ 8] ;(3)环境条件是制约脱色作用的一个重要因素 , 通过考察培养方式 、pH 值对染料脱色作用影响 , pH 值对酶活性影响最大 , 也直接影响了漆酶降解作用;其次是培养方式 , 静态环境不利于对染料的降解 ,前期研究也发现静态不利于贝壳状革耳菌分泌漆酶 ,由此也可推测漆酶在染料降解中的主导作用。参考文献:[ 1]邓耀杰 ,林鹿 ,詹怀宇.白腐菌对芳香化合物的降解机制[ J] .环境科学与技术 , 1999 , 3:8-12.[ 2] Yu H S ,Cai Z Y ,Hung X Y , et al.Biological degradation of rice straw[M].In:ki rk T K ,Chang HM ed.Applications of Biotechnology of Pulp and Pa-
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生态因素对海洋微藻蛋白质含量的影响杨海波 ,于媛 ,李英敏 ,张欣华 ,刘艳(大连大学 化学与化学工程系 , 辽宁 大连 116622)摘要:考察了光照时间 、培养温度 、二氧化碳通入量等生态因素对处于不同生长时期的小球藻 、等鞭金藻 、新月菱形藻中的蛋白质含量的影响。结果表明 ,不同种类的微藻 , 生态因素对其胞内蛋白质含量的影响不同。小球藻在光照 17h 、培养温度 19℃、每日间歇通入 25mLCO2 L培养液的条件下 ,培养至对数对数生长期 , 蛋白质含量达到 70%;等鞭金藻在光照 17h 、培养温度 19℃以上 、不通入 CO2 的条件下培养至静止期 ,蛋白质含量接近 70%;新月菱形藻光照 17h、培养温度 25℃、不通入 CO2 的条件下培养至对数对数生长期 ,蛋白质含量超过 70%。关键词:生态因素;蛋白质;小球藻;等鞭金藻;新月菱形藻中图分类号:Q949.208　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2002)06-0036-02
收稿日期:2002-04-23;修回日期:2002-08-03基金项目:辽宁省博士启动基金资助项目(001059)作者简介:杨海波(1968-),女 ,博士 ,教授 ,研究方向:生物化工 、无机化学。
　　海洋藻类中含有大量的生物活性物质 , 这些活性物质具有多种重要的生理功能 , 如高度不饱和脂肪酸能治疗人类循环系统的多种疾病 , 蛋白质和糖蛋白等能提高人体的抗肿瘤
活性 , 增强人体免疫力 、抗病毒和病原菌感染的能力[ 1-3] 。目
前 ,有关微藻脂肪酸的研究较多[ 4 ,5] , 而对微藻中其它活性物质的研究尚少 ,李师翁等人[ 6] ,发现了培养基中加入乙酸钠能
提高蛋白质含量。李乐农等人[ 7] 发现螺旋藻的蛋白含量随光照时间的延长而增加。然而 , 生态因素对微藻细胞及其在不同生长时期胞内蛋白质含量的影响的研究尚未见报道。因此 ,本文考察了一些生态因素包括细胞生长时期和环境条件(如温度 、通气量 、光照周期等因素)对三种处于不同分类地位的微藻在不同的生长时期胞内蛋白质含量的影响 ,为阐明细
胞内蛋白质合成和积累的优化生态条件 , 实现大规模培养提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　藻种三种处于不同分类地位的藻种由辽宁省海洋水产研究所提供 ,具体分类见表 1。表 1　实验所用微藻
门 纲 目 科 属
小球藻(Chlorella spp.) 绿藻 绿藻 绿球藻 卵胞藻 小球藻
等鞭金藻(Isochrysis zhangjingensis) 金藻 金鞭藻 金鞭藻 等鞭藻 等鞭金藻
新月菱形藻(Nitzschia closterium) 硅藻 硅藻 羽纹硅藻 菱形硅藻 菱形硅藻
1.2　培养条件培养液为经过过滤 、煮沸后冷却的海水 , 并加入 0.1%的康维营养液。藻种用 5L摇瓶间歇培养 , 培养液体积 4L , 接种量 20%。光强 6000Lux ,培养温度和光照周期依据实验确定。
图 1　藻细胞相对生长量随培养时间的变化
1.3　蛋白质含量的测定采用微量凯氏定氮法测定。蛋白质质量表示为蛋白质质量占干细胞质量的百分比 , 藻细胞经离心浓缩后 , 80℃烘至恒
重。
1.4　细胞密度的测定采用血球板计数法。
2　结果与讨论
2.1　细胞生长周期的确定在室温及自然光照条件下 , 用 5L 摇瓶间歇培养小球藻 、新月菱形藻及等鞭金藻 , 每天振摇 3 次 ,用血球板计数法隔天测定细胞密度 , 以在不同培养时间测定的细胞密度与初始接种量的比值(细胞相对生长量)为纵坐标 ,培养时间为横坐标作图 , 结果见图 1。从中可以明显地确定细胞生长周期 , 在培养的前 6d 内 ,细胞相对生长量明显增加 , 藻细胞处于较快的对数生长期;在
36 第 12卷第 6 期　2002 年12月 Vol.12 , No.6　Dec.2002