全 文 ：第 6卷第
19 8 年
3 期
9 月
纤 维 素 科 学
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贝壳状革耳菌在固体及液体培养过程漆酶同工酶的产生研究 ·
付时雨 二余惠生
(中国科学院广州化学研究所纤维素化学开放实验室 广州 51 肠 50 )
文 摘 :着重研究了 白腐苗 只浏。 co 矛曰山山 在固体和液体培养过程 中胞外漆酶
及其同工酶产生规律及其差异 。 研究结果表明 : 固体和液体培养产漆酶 的最
高峰在培养 巧 d 以后 , 固体和液体培养过程漆酶同工酶的差异比较大 。 液体培
养过程中漆醉同工酶产生情况稍有差异 , 同工酶的数盆远比固体培养少 ,而且
分布在高分子量区域 。 固体培养过程中 , 漆酶同工酶的产生远 比液体培养复
杂 。 培养初期漆酶同工醉带主要分布在低分子量区域 。 随着培养时间延长同
工酶带增加 ,最多达七条同工醉带 ,其中郊分同工酶带落在高分子盆 区域 。 随
着培养时间再延 长 , 低分子量区域的同工酶带相对减弱 , 而高分子 是区域的同
工酶带增加和集 中 。 到培养后期低分了量区域的同工酶带又重新出现 。
关键词 : 漆酶 , 同工酶 , 贝壳状革耳菌 。
中图法分类号 : 必 54 . 6 ,卿3 . 335
O 前 言
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶 ( E C . 1 . 10 . 3 . 2 ) ,最早是从漆树分泌物发现 , 随后陆
续发现它广泛存在于植物 、 昆虫 、 微生物中 。 超过一个世纪 以来 , 越来越发现它在植物
许多生物过程 , 包括合成与降解均起到非常重要的作用 。 发现漆酶在植物体中木素 的
形成与沉积中起重要作用 。 同时发现许多木腐菌中都能分泌漆酶 , 证实木素的生物降
解与漆酶有密切关系 ,特别是它能参与木素单聚体的生物降解过程的多个反应 。 80 年
代 ,巧 gu hc i 通过同位素标记的木素模型物证实酚型的木素模型 物三聚体可在漆酶单独
存在下被降解 〔` 〕。 然而 ,漆酶单独存在下不能降解非酚型木素化合物 。 直到近几年 ,人
们才发现漆酶在某些助剂 (m ed iat or )和氧的存在下 , 能氧化非酚型木素模型化合物以及
降解纸浆中残余木素 =.t 3] 。 也正在此时期 , 科学家发现传统纸浆氯漂废水 中含有强致
癌剧毒物质 , 改革传统工艺迫在眉睫 。 漆酶的这方面突破 , 很快引起 国际重视 , 迅速成
为纸浆全无氯漂 白的重要潜在途径 ,漆酶的产生以及 与木素作用的深人和 系统研究迅
猛在国际范 围内展开 。
漆酶 的产生可有不同的来源 。 最近的研究 发现 , 不同来源 的漆酶其氧化能力 和反
应性能有较大 的差异 [’. 5〕;甚至同一来源的漆酶 , 同工酶之间反 应 活性也不同 0[] 。 目前
认为 ,真菌特别是白腐菌所产生的漆酶效果最佳 。 贝壳状革耳菌 ( aP 。二 co n e h a如 )是一
株降解木素能力很强 的白腐菌 v[] ,其木素降解酶系主要是漆酶 ,所产生的漆酶在助剂存
在下能有效降解纸浆中的残余木素〔“ ] 。 本文着重研究该菌在不同培养方式 , 包括液体
培养和 固体培养 , 以及培养过程中不同阶段漆酶的不同同工酶的产生规律及其差异 。
. 籍潺男霭翁翁磊 , 基金和广东省科学基金资助二 华南理工大学制浆造纸国家重点实验室在读博士生
DOI : 10. 16561 /j . cnki . xws . 1998. 03. 006
第 3期 付时雨等 : 贝充状革耳菌在 固体及液体培养过程漆醉同工酶的产生研究
1 实 验
1
.
1 试剂
所有试剂均为分析纯试剂 。
1
.
2 菌种
尸匕了四 co nC 加九“ 为本实验室选育的菌株 。
1
.
3 菌种培养
1
.
3
.
1 液体培养
基础培养基的配制方法如下 : aC C卜 0 . 19 , K H Z p 0 4 2 g , M多艾)4 0 . 25 9 , 微量元素溶 液
or rnL 葡萄糖 1飞 ,溶于 IL O
.
01 m ol
·
L
一 l , p H 二 5 . 8 的 N aA 。 一 HA 。 缓冲溶液中
, 以酒石酸
钱和硝酸钱为氮源 ,加人量各为 。 . 5 9 . 微量元素溶液配制按 B u , v e l l 等人的方法 01[ 。 将
上述配好的培养基在 70 k p a 压力下灭菌 20 而 n 。 经过滤除菌的 VB : ( 1岁 )L In止 加人上述
培养基中 。 培养基经分装 、 灭菌后接种 , 然后置于 39 ℃培养箱中静置培养 , 每隔 3 d 取
一次样 , 每次取三份平行试样 , 测定漆酶的活力 。
1
.
3
.
2 固体培养
经粉碎的稻草以每瓶 l飞 分装 于 30 rnL 三角瓶 内 , 在 0
.
I M卫 a 压力下灭菌 30 而 an
接种后摇匀并在 39 . 5℃静置培养 。 每隔一定时间取样 , 挤出发酵液 , 残渣用水洗 、 再
挤 , 重复三次 , 使酶液总体积约 l o mL 。 离心分离 ( 35 0 r/ 而 n , 15 而 n) , 上清液用于测酶
活 。
1
.
4 酶活测定
1
.
4
.
1 漆酶活力
用等体积 0 , 5 : nm o U L Z , 2 ’ 一 连氮 一 二 ( 3 一 乙基苯并噬哇 一 6 一 磺酸 ) (简称 A卫n s )
溶液和酶液反应 ,测定反应前 31 苗 n 内 4 20 lun 处吸光值的增加 , 每分钟使 1脚o1 人B I S 转化所需的酶量为一个活力单位 ( )U 川 。
1
.
4
.
2 活性 一 P A G E 电泳
用 1 % (质量 )的聚丙烯酞胺胶 ,不加 SD S 的条件下 , 以 pH 值 8 . 3 的三甘氨酸作为
电极缓冲液 , 在垂直板电泳仪上进行电泳 。 电泳完后 , 取出胶板放人含 0 . 03 % A B飞 的
P H 值为 4 . 0 的 N aA 。 一 AH 。 缓冲液 中反应染色 。
2 结 果
2
.
1 固体培养与液体培养条件下漆酶的产生
液体培养使用合成培养基 , 培养是在高氮 ( 2 . 4~ ol
·
L
一 ` , N )条件下 。 我们发现贝
壳状革耳菌 ( P . c o cn h以。 )培养 3d 时就有漆酶产生 ,生长到 15 d 左右 , 漆酶的酶 活升到
高峰 , 达到 130 U/ L ,生长到 1d8 后 , 漆酶的活力下降 。 (见图 l)
纤维索科学与技术 第 6 卷
604 280
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16 0 0
14 0 0
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10 0 0
8 0 0
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0 20
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入7曰·fl\刘班言
图 1
10 20
培养时间 /d
液体培养漆酶的产生 图 2
10 0 2
培养时间 /d
固体培养漆酶的产生
在固体培养条件下 ,漆酶的产生情况略有不同 , 从培养至 17 d 时漆酶出现最高峰 ,
随后下降 。 在最高峰出现前出现两个小峰 , 分别为 d7 、 or 一 14 d ,见图 2 。
2
.
2 尸 . co 翔=h 。 友“ 在液体和固体培养过程中漆酶同工酶的产生
2
.
2
.
1 液体培养过程中漆酶 同工酶的产生
我们利用活性 一 PA C E 电泳技术考察了 卢b刀猫 e o cn 灿公出 在合成培养基 中不同 培养
阶段漆酶同工酶的产生 (见图 3 ) 。 A l 是液体培养 d8 时的漆酶活性带 , 清楚地看到有三
个漆酶同工酶活性 。 当培养至 l ld 时 , 漆酶的活性带主要是两条 (见 图 3 中 2A ) , 但位
置在较低的分子量区 ,而原来在培养 d8 时三条漆酶同工酶活性带位置上仍可见到隐约
的漆酶带 ,但强度是十分弱 的 。 当培养到 14 d 时 ,漆酶同工酶带与 l ld 大致相同 (见图 3
中 3A ) , 当培养到 17 d 时 , 漆酶同工酶带又恢复培养 s d 时 的状态 (见 图 3 中 人4 ) 。 总的
来看 ,在液体培养过程 中漆酶同工酶的产生是有变化 , 但总体来讲变化不象固体培养那
样明显 。
2
.
2
.
2 固体培养过程中漆酶同工酶的产生及其变化
为 了避免在培养过程中因添加物造成对酶的产生有所影响 , 我们将菌直接接种在
经灭菌的稻草固体培养基上 ,不加任何外来的营养源 , 考察类似天然状态下 , 菌在整个
培养过程中漆酶 同工酶的产生及其变化规律 。 取不同培养天数 的发酵试样 , 对酶进行
彻底抽提 , 抽得酶液用活性 一 PA G E 电泳技术对其漆酶 同工酶进行分析 , 结果见 图 4 。
从图 4 中我们不难看到 ,在固体培养的不同阶段 ,漆酶 同工酶的产生有着十分明显 的变
化 。 图 4 中 lB 是固体培养 d4 时漆酶酶带 ,清楚地看到有四条漆酶同工酶带的存在 , 其
中 , 第二条显示强度特别强 , 主要酶带在较低分子量 区 , 当培养进人第 d6 ,见 图 4 中 B2 ,
漆酶同工酶带显著增加 , 出现六条酶带 ,而且强度相近 , 分布从低分子量 向高分子量过
渡 。 培养进人第 d7 时 , 酶带增至七条 (见 图 4 中 B 3) , 培养 10 至 1d4 , 即图 4 中的 B4 、
B S
、
B 6
、 和 B7 、 , 我们发现其低分子量区的酶带逐渐减弱 , 而高分子量区域的酶带则逐渐
增强 。 当培养至 1d9 ,发现酶带又出现变化 , 虽然高分子量区域的酶带依然保持为主 的
地位 , 但低分子量的酶带再次出现 。 此时发酵已进人后期 ,底物 已经变得 十分柔软 , 菌
丝已经出现 自溶 ,可能低分子量酶带是由于菌丝 自溶 ,从胞 内释放出来 。
第 3期 付时雨等 :贝充状革耳菌在 团体及液体培养过程漆醉同工醉的产生研究
, 卜~ 翻. .
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图 3
3 讨
液体培养漆醉同工酶的活性电泳 图 4 固体培养漆醉同工酶的活性电泳
人卜液体培养 s d
人:3 液体堵养 14 d
人5 :固体培养 7 d
2A
:液体培养 l d
A :4 液体培养 17 d
5 1:培养 4 d : a Z :培养 6 d : 5 3:培养 7 d
4B
;堵养 s d : B S:堵养 10 d ; 6B :堵养 13 d
B 7:培养 一4 d : B吕.培养 一g d
论
白腐菌的木索降解酶系 目前认为主要有三种 , 即木素过氧化物酶 , 依赖锰过氧化物
酶和漆酶 。 另外 ,一 些氧 化还原酶也被认为可能在木素生物降解过程中起一定作用 。
不同 白腐菌木素降解酶系 的组成有很 大的差异 。 大体可分为三种类型 〔’ 0] , 即木素过氧
化物醉 一 依赖 锰过氧化物醉 , 漆酶 一 依赖锰过氧化物酶 , 木素过氧化物酶 一 依赖锰过氧
化物酶 一 漆酶 。 但是这种分法并非绝对 。 不同营养源和一些微量元素的加人等均会在
三种酶的产生上发生不同的扶抑作用 。 尸 . co 砚 h`比` 活 属 于漆酶 一 依赖锰过氧化物酶类
型 。 目前在不同培养方式及条件下还未检测 出木素过氧化物酶的 活力 , 但是在液体培
养中改变营养源及一些微量元素 的加人会较大地影 响两种 木素降解酶 的 比例 〔’ ` 一 ` 2〕。
三种木素降解酶都有不少报道 ,提及同一种木素降解酶不同 的同工酶其 氧化能力和 作
用效果有较显著的差别 。 所以 了解同工酶 的形式乃至产生 的变化规律 ,对发挥酶 的作
用能力 将是 十分重妥的 。 从上述我们的研究结果可以较清楚地看 出 , 培养方式对同工
酶的产生有较大 的影响 , 培养不同阶段同工酶的产生也有不少的变化 。 相对来讲 , 液体
培养较为简单 , 可能由于营养 、 环境以及代谢产物相对简单 。 而固体培养就不 同 , 底物
是一种复杂的营养源 , 以稻草为例 , 除了纤维素外 ,还有半纤维素 、抽提物和不同微量元
素 ,所 以整体代谢过程将生成大量的 , 而且随培养时间 、 条件的不同 , 而又会发生变化的
纤给家 科学与技术 第 6卷
代谢产物 , 这些产物又将会反过来抑制或促进酶乃至同工酶的产生 , 我们已经发现 尸 .
co 配八口友。 培养过程加人一些木素降解产物 , 如 : 对香豆酸 、 票芦醇和紫丁香醛等均能诱
导大量漆酶的产生 i `3 ] 。 同工酶的产生亦 同样受到影响 (资料尚待发表 ) 。 这些原因将
构成固体培养在同工酶的产生上较液体培养复杂 。 但是菌生长在大 自然 , 大体上处于
固体状态下生长 , 经过长期优化 ,将建立一个较佳的降解酶系 。 也就是说 , 酶乃至同工
酶的产生应该 比较齐全 。 因此 , 酶以及同工酶产生规律的研究将有利于我们优化现有
的应用途径和开拓新的应用范围 。
参 考 文 献
l 比gu hc i T . W cx 刁 反 1 eT hc on l , 1乡X ) , 24 ; 23 一 63
2 OB ur 加 n a is R , P山 e e h1 G . F EBS 址 t te r , 19卯 , 2 6 7 : 90 一 102
3 B o ur 加 n n a is R , P苗e e M G . A PP I M i e o b io l B i o te e hn ol , 19 2 , 36 : 823 一 8 2 7
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Ch e n C h e记ou n g . H o lZ fo scr h u n g
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双厂仪沼 an d uP lp i n g Ch e而 s it y rP o e e e d i: 、 g , 19 9 7 , 13 0 ( l 一 4 )
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10 址 if J e o sn o n e ￡ a l . A e at C h i而ca 段 an d i n a说e a , 1 9 8 7 , B4 1 : 7 6 一 7 69
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12 王佳玲 ,余惠生 , 黄秀瑜 ,付时雨 . 纤维素科学与技术 , 19 98 , 6( 3 ) : 27 一 31
13 王佳玲 ,付时雨 ,余惠生 ,黄秀瑜 .纤维素科学与技术 , 19 97 , 5 ( 4 ) : 25 一 32
7 3第 3期 付时雨等 :贝充状革耳菌在固体及液体培养过程漆蔺同工璐的产生研究
S加 d ise o na lc c a s se s iofo们仪` po r dc e u db ya Pns uc oc na h ts u
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p耐 u e t i o n co e u耽 d aft e r 15 d a y s Of in e u ab it on fo r 加 ht sol id s at te an d s ub me 飞de e ul ut 心 . M o r e
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P r ed u e it o n Of l a e ase is
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e o m p l e x
, 仆 e ba l l ds o f i s o fo ns d e t e e t e d i n ht e i n iit al s t ag e id s itr b u t e d n l a i irl y i n ht e ar ea o f lm 、 e r
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