全 文 ：收稿日期:2007-04-07
作者简介:郭　英(1979-),女 ,有机化学硕士研究生 ,主要从事
天然药物的分离分析。通讯作者:高云涛 ,教授。
广枣提取物体外清除活性氧自由基及抗氧化作用研究
郭　英 ,贝玉祥 ,王雪梅 ,高云涛
(云南民族大学化学与生物技术学院 , 昆明　650031)
摘要:利用 Fenton 反应产生羟自由基·OH ,光照核黄素产生超氧阴离子自由基 O -·
2
, 分光光度法研究了广枣
提取物体外清除活性氧自由基的作用。用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法研究广枣提取物对·OH 诱发卵磷
脂脂质过氧化损伤的抑制作用。实验结果表明 , 广枣提取物能有效清除活性氧自由基 ,对卵磷脂脂质过氧损
伤有显著抑制作用。
关键词:广枣提取物;活性氧自由基;抗氧化
中图分类号:R284.2　文献标识码:A　文章编号:1005-5320(2008)05-0022-02
Scavenging Effects of Choerospondia on Active Oxygens and Its Antioxidation in vitro
GUO Ying ,BEI Yu-xiang ,WANGXue-mei , GAO Yun-tao
(School of Chemistry and Bio-Science , Yunnan Nationalities University , Kunming 650031 ,China)
Abstract:Scavenging effects of Choerospondia on active oxygen species ·OH and O -·
2
generated by Fenton reaction and riboflavine
pho tosensitization in vitro w ere investigated by the means of spectrophotometry.The inhibition effects of Choerospondia on the lecithin
lipid peroxidation induced by hydroxy l radical were observed by thiobarbit uric acid spectropho tometry .The results showed that
Choerospondia could scavenge active oxygen efficiently .I t could also significantly inhibitlipid peroxidation by hydroxy l radical.
Key Words:Choerospondia;active oxygen;antioxidation
　　广枣为蒙医常用药材 ,系漆树科南酸枣属植物
南酸枣 Choerospondias- nx il laris(Roxb.)Burt t et
Hill的成熟干燥果实 ,又名五眼果 、酸枣 、山枣子 、人
面子 、货朗果 、鼻涕果 、野枣子等 ,已被中华人民共和
国药典收载[ 1] 。蒙医认为 ,广枣具有行气活血 、养
心安神功能 ,用于治疗气滞血瘀 、胸痹作痛 、心悸气
短 、心神不安等症[ 2] 。蒙药治心病药方中半数以上
以广枣为主药或配有广枣 ,疗效确切可靠。广枣除
具特殊的药用价值外 ,在湖南民间还有着悠久的食
用习俗 ,主要用于开胃消食 ,醒酒等[ 3] 。
广枣化学成分主要有总黄酮 、酚酸类 、多糖等成
分[ 4 ,5] ,由于含有酚羟基 ,在细胞膜发生脂质过氧化
反应时 ,本身可脱H 氧化 ,提供电子给自由基 ,从而
有效地终止自由基的连锁反应[ 6] 。实验主要研究
广枣提取物对活性氧自由基的清除作用及对卵磷脂
体外脂质过氧化抑制作用 。本实验主要以芦丁标准
品为对照 ,研究广枣提取物对活性氧自由基的清除
作用及对卵磷脂体外脂质过氧化抑制作用 ,为广枣
的综合利用提供一定的基础 。
1　实验部分
1.1　材料与仪器
广枣药材(产地:湖南 ,购于陕西省药材公司 ,由
陕西省药品检验所进行鉴定 ,以当量浓度计 ,即用 1
L 溶液中所含溶液的克当量数来表示的浓度),核黄
素(VB2), 氯化 硝基四 氮唑 兰(NBT)(购自
ChemBase公司),番红花红(Safranine T),芦丁标准
品 ,蛋氨酸 , 2—硫代巴比妥酸(TBA), 三氯乙酸
(TCA)。所用试剂均为分析纯 ,实验用水为二次蒸
馏水。
7200型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪
器公司),数显恒温水浴锅 , S3120A 超声波清洗器 ,
低温超速离心机 ,光照箱(自制 , 35cm ×30 cm ×25
cm ,光源为纯稀土节能灯 ,灯功率 45 W)。
1.2　实验方法
1.2.1　广枣有效成分的提取
取干燥的广枣药材适量粉碎 ,准确称取 40 ～ 60
目粉末 5.0 g ,加入一定量的石油醚超声波提取 30
min ,抽滤 ,滤渣挥发干燥除去残余的石油醚 ,加入
60 %浓度的乙醇溶液 100 ml超声提取 60 min 、离
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心 ,将上层清液倒入 250 ml具塞锥形瓶中 ,作为待
测液 。
1.2.2　广枣多酚的测定
取1.2.1中的待测液 5 ml于 10 ml比色管中 ,
以酒石酸亚铁比色法[ 6] 测定多酚的含量。本实验
以100 mg/L 没食子酸为标准 ,测定波长 540 nm ,回
归方程:A=0.018c(r=0.9998)。计算广枣多酚浓
度:c=0.13 mg/ml。
1.2.3　抗氧化活性的测定
1.2.3.1　超氧阴离子自由基的产生及清除活性测
定　采用光照核黄素[ 7]的方法用 0.05 mol/L pH =
7.4 的 PBS 缓冲液为溶剂 ,配制 1.67×10-5 mol/L
核黄素 ,0.01 mol/L 蛋氨酸 , 4.6×10 ～ 5 mol/L 氯
化硝基四氮唑兰(NBT)。分别取上述 3 种溶液各
2.0 ml ,加入各种浓度的广枣提取物(样品)和芦丁
标准品(对照)溶液 2.0 ml ,空白管以 2.0 ml缓冲液
代替样品溶液。置于光照箱中光照 30 min ,取出后
以缓冲溶液为参比于 560 nm 处测定溶液的吸光
度。清除率按下式计算:A0 为空白管的吸光度 ,A样
为样品管的吸光度。
清除率=A0-A样
A0
×100 %
1.2.3.2　羟自由基的产生及清除活性测定[ 8] 　采
用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基(Fenton 反
应),该反应产生的羟自由基可使番红花红褪色。针
对这一特点来研究广枣提取物对羟自由基的清除能
力。
取 0.05 mol/L pH 7.4 的磷酸缓冲溶液 1.0
ml , 40 μg/ml 番红花红 1.0 ml , 0.945 mmol/L
EDTA-Fe(Ⅱ)(新鲜配置)1.0 m l ,广枣提取物(样
品)和芦丁标准品(对照)溶液 0.5 ml 、3%H2O21.0
ml(新鲜配置),混合后在 37℃水浴中反应 30 min
后在 520±1 nm 处测定吸光度 As。空白组以 0.5
ml蒸馏水代替样品测定吸光度 A0 ,对照组以 1.5
ml蒸馏水代替 H2O2 和样品测定吸光度 A ,用 3.5
ml蒸馏水代替番红花红 、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2 、样
品 ,1.0 ml磷酸盐缓冲溶液 ,调零 。并按下式计算
清除率 D%:
D%=As-A0
A-A0 ×100%
1.2.3.3　对脂质过氧化抑制活性的测定[ 9] 　取
1 ml卵磷脂溶液(用 200 mg 卵磷脂溶解于 30 ml
0.05 mol/L pH 7.4 PBS ,冰浴震荡),加入 pH 7.4
PBS缓冲液 1.0 ml ,不同浓度的广枣提取物和芦丁
标准品(对照)1.0 ml ,2.5 mmol/L EDTA-Fe(Ⅱ)
1.0 ml ,混匀后于 37℃水浴中反应 45 min ,再加入
28 %(W/V)的 TCA2.0 ml ,1 %(W/V)的 TBA1.0
ml ,混匀后置于 100℃沸水浴中加热 10 min ,冷却后
在 532±1nm 处测定吸光度 A样 ,用 PBS 缓冲液调
零 ,空白管用 PBS 缓冲液代替样品测吸光度A0 。并
按下式计算抑制率:
抑制率=A0-A样
A0
×100%
2　结果与讨论
2.1　对超氧阴离子自由基的清除作用
当清除率达到 50%时广枣中多酚的当量浓度
为 0.041 mg/ml ,广枣中多酚的当量浓度 0.078
mg/ml时 ,清除率达最大 ,最大清除率为 67.35%。
而芦丁中多酚的当量浓度为 0.070 mg/ml ,当芦丁
中多酚的当量浓度 0.100 mg/ml时 ,最大清除率
为 71.3%,这说明广枣提取液与芦丁对·OH 的清除
作用相近。
2.2　对 Fenton反应产生·OH 的清除作用
当清除率达到 50%时 ,广枣中多酚的当量浓度
为 0.11 mg/ml ,当广枣中多酚的当量浓度 0.50
mg/ml时 ,清除率达最大 ,最大清除率为 96%。而
芦丁中多酚的当量浓度为 0.52 mg/m ,当芦丁中多
酚的当量浓度=0.86 mg/ml清除率为 86%。这说
明广枣提取液比芦丁对·OH 的清除作用大 。
2.3　对脂质过氧化的抑制作用
在 532 nm下测定广枣提取液对卵磷脂脂质过
氧化的抑制作用:当清除率达到 50%时 ,广枣中多
酚的当量浓度为 0.52 mg/ml ,提取液浓度和抑制率
成正比 , 当广枣中多酚的当量浓度 0.66mg/ml
时 ,抑制率达最大 ,其抑制率高达 66%。由此可见 ,
广枣提取液对卵磷脂脂质过氧化表现出较好的抑制
作用 ,而芦丁对卵磷脂脂质过氧化没有抑制作用 。
3　结　论
用光照核黄素的方法产生 O-·
2
,可使氯化硝基
四氮唑兰产生蓝色物质 ,该物质在 560 nm 处有最
大吸收峰 。随着反应的进行 ,蓝色物质的生成就越
多 ,加入广枣提取液可使 O-·
2
的产生受到抑制 ,进而
蓝色物质的生成也受到抑制 ,体现了广枣提取液对
O-·
2
的清除能力。
根据 Fenton 反应的原理 , H2O2 在 Fe2+存在的
条件下可生成·OH , ·OH 可使番红花红褪色 ,番红
花红在 520 nm 处有最大光吸收 ,加入广枣提取液
后 ,可有效阻止番红花红褪色 ,体现了广枣提取液对
·OH 的清除能力 。
卵磷脂可被·OH 氧化损伤产生丙二醛(MDA)
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类似物 ,硫代巴比妥酸(TBA)可与 MDA类似物反
应生成粉红色物质 ,该物质在 532 nm 处有最大光
吸收 ,加入广枣提取液后 ,可有效抑制 MDA 的生
成 ,体现了广枣的抗脂制过氧化作用。
综上所述 ,广枣提取物有很好的清除活性氧自
由基能力 ,并对卵磷脂脂质过氧化损伤有显著抑制
作用 。
参考文献:
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基和由羟自由基诱导的脂质过氧化的影响 [ J] .中国药
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外实验研究[ J] .中国食品添加剂 , 2003(05):22-25.
收稿日期:2008-01-15
作者简介:江维克(1963-),男 , 硕士 ,副教授 ,主要从事中药有
效成分与质量标准研究。
HPLC测定尿清舒胶囊中大黄素的含量
江维克1 ,周　涛1 ,陈再洁2
(1.贵阳中医学院 ,贵阳　550002;2.贵阳科瑞特医药开发研究所 , 贵阳　550001)
摘要:目的:用高效液相色谱测定尿清舒胶囊中大黄素含量。方法:采用 Hypersil C18柱(ODS2)(4.6 mm×
250 mm , 5 μm)色谱柱 ,以甲醇—0.1%磷酸溶液(80∶20)为流动相 , 流速 1.0 ml/ min ,检测波长为 437 nm , 柱
温 , 30℃。结果:大黄素在 0.202 ～ 2.424 μg 内呈良好的线性关系 , 平均加样回收率为 99.87%。结论:方法简
便 、重复性好 ,可作为尿清舒胶囊含量控制方法。
关键词:尿清舒胶囊;HPLC 法;大黄素
中图分类号:O657.7+2　文献标识码:B　文章编号:1005-5320(2008)05-0024-02
　　尿清舒胶囊是由国家药品监督管理局《国家中
成药标准汇编》内科·肾系分册收载的“尿清舒颗粒”
(WS-10988(ZD-0988)-2002)改剂型而成 ,其处
方由山木通 、野菊花 、虎杖 、地胆草 、车前草 、重楼等
药味组成 。具有清热利湿 ,利水通淋的功效 ,用于湿
热蕴结所致淋症 ,小便不利 ,淋沥涩痛 ,慢性前列腺
炎属上述证候[ 1] 。为了有效的控制本品质量 ,采用
HPLC对大黄素进行了含量测定 ,获得满意效果 。
1　仪器试药
高效液相色谱仪(日本岛津 10A):岛津 LC -
10ATVP 输液泵 , SPD-10AVP 紫外检测器 ,岛津
CS —Light中文版色谱工作站(版本:2.00.00Sub),
CTO-10Asvp色谱柱恒温箱。
岛津 UV-1700型紫外可见分光光度计;CH-
250型超声波清洗器(北京创新德超声电子研究
所);电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公
司);岛津 AUW220型(分度值 0.01 mg)电子天平;
容量瓶 。
大黄素对照品(供含量测定用):购于中国药品
生物制品检定所 ,批号为 110756-200110。
甲醇为色谱纯(美国 TEDIA 公司);磷酸为分
析纯(国产);水为重蒸馏水 。
2　方法与结果
2.1　对照品溶液的制备　精密称量大黄素对照品
20.20 mg ,置 50 ml量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻
度 ,摇匀 ,即得大黄素对照品储备液(每 1 ml含大黄
素 0.4040 mg)。精密量取 5 ml储备液 ,置 25 ml量
瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,即得大黄素对照品
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