全 文 ：○研究报道○
白构菌液体发酵合成漆酶的培养条件研究
徐　勇 , 朱均均 , 叶汉玲 , 勇　强 , 尤纪雪 , 余世袁
(南京林业大学 化工学院 , 江苏　南京　210037)
摘　要:提高底物碳源的聚合度和采用有机氮源有利于诱导白构菌(Flammulina velutipes)合成漆
酶 ,实验结果表明选择淀粉和黄豆粉作为白构菌液体发酵制取漆酶的碳源和氮源有良好的效果。
采用振荡培养能够强化白构菌液体发酵体系内的传质作用 ,更适于菌体的生长及漆酶的合成。以
180 r/min速率振荡培养白构菌 16 d , 漆酶活力可达到 308 IU/mL ,比静置培养提高 83.3%。经活化
后的白构菌接种并在振荡条件下培养可显著提高漆酶活力 , 180 r/ min 振荡培养 6 d 后漆酶活力可
达到 1 749 IU/mL。
关键词:漆酶;白构菌;液体发酵
中图分类号:Q939.96　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-3433(2004)03-0001-05
　　真菌漆酶(Laccase , EC 1.10.3.2)是一种
含铜的多酚氧化酶(Cu-contained polyphenol
oxidase),可催化的底物包括单酚 、邻苯二酚 、
对苯二酚 、甲氧基酚 、抗坏血酸和二胺化合物
(如苯二酚 、多巴胺等)等[ 1] ,并可直接用于脱
除植物纤维原料中的木质素[ 2] 。它与木质素
过氧化物酶(Lignin Peroxidases)、锰过氧化物
酶(Mnganese Peroxidases)及其生成菌可广泛
应用于生物制浆 、造纸 、降解有毒异型化合物
和环境保护等领域[ 3 ～ 5] 。其中 ,漆酶在前期
应用研究中表现出独特的优点 ,如性能稳定 ,
适于固定化使用;使用时可不需要过氧化氢
的参与 ,也可以有效地脱氯;部分漆酶还可以
组成型生产 ,且表达量较高 。近年来 ,还开展
了漆酶在制造纤维板 、刨花板和纸板等木质
纤维类材料领域的研究开发工作[ 6～ 7] ,因此
在 3种真菌木质素降解酶中 ,漆酶最具发展
潜力。
自然界中能够合成木质素降解酶或酶系
的真菌分为软腐菌和白腐菌 ,它们大多是属
于子囊菌纲 、担子菌纲和半知菌类[ 8] 。目前 ,
以粉状孢菌(Phanerochaete spp), 多孔菌
(Polyporus spp),木云芝(Trametes sppI)和里氏
木霉(Trichoderma spp)等菌株合成漆酶的文
献较多 ,而有关白构菌(Flammulina velutipes)
合成漆酶的研究却鲜见报道 。本研究采用液
体发酵技术培养白构菌 ,对其合成漆酶的培
养条件进行了初步研究 。
1　材料与方法
1.1　菌种
白构菌由上海微生物所提供 ,经南京林
业大学驯化后 ,接种于斜面或平板上 ,4 ℃保
·1·林产化工通讯　　2004年第 38卷第 3期
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271063)
作者简介:徐 勇(1971-),男 ,湖北安陆人,讲师 ,在职博士生 ,主要从事林产生物化学加工研究。
藏 。
1.2　液体培养基与产酶
培养基:0.1% KH2PO4 , 0.05%MgSO4·
7H2O , 0.1% Tween 80 , 微量元素适量 , 以
0.025 mol/L柠檬酸缓冲液配制。使用时添
加适量的碳源和氮源 ,121 ℃灭菌 25 min ,冷
至室温后加入 0.005%VB1(采用微滤法过滤
除菌)。
产酶方法 1:在 250 mL三角瓶中加入 30
mL培养基(若静置培养 ,则再加入 5 mm 玻
璃珠 15 g),由平板接入 8 mm 菌落 ,在(28
℃±2)条件下静置或振荡培养 。
产酶方法 2:在 250 mL三角瓶中加入 50
mL土豆培养基(PDA),由平板接入 8 mm
菌落 ,在(28±2)℃条件下 ,以 180 r/min振荡
培养 6 d后得种母液(菌球状)。在 500 mL 三
角瓶中加入 90mL 培养基 ,灭菌后接入 10mL
种母液 ,在(28±2)℃条件下 ,以 180 r/min 振
荡培养 。取培养液 , 经 3 000 r/min 离心 20
min后取上清液得产酶液 。
1.3　分析测定
漆酶活力的测定[ 9] :移取 0.5 mmol/L
2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑)-6-磺酸
(ABTS)溶液 3.0 mL(以 0.1 mol/L pH=4.5
醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制)置于 1 cm 的比
色皿中 ,迅速放入 30 ℃水浴中预热 5 min ,加
入经适当稀释的酶液 0.1 mL ,启动反应。在
波长 λ=420 nm 处测定稳定反应4 min内吸
光度 OD 值的平均变化速率 ,取每分钟氧化
1μmol ABTS 所需的酶量为 1个漆酶活力单
位 。消光系数ε=3.6×10-4 L/(mol·cm)。
还原糖(RS)测定:采用 DNS 法(3 , 5-二
硝基水杨酸法),蛋白质浓度测定采用考马斯
亮兰法 。
2　结果与讨论
2.1　碳源对漆酶合成的影响
真菌漆酶属于诱导酶 ,碳源对于菌体生
长和酶合成的影响显著 。在 250 mL 摇瓶中
装入 30 mL基础培养基 ,分别以初始浓度为
20 g/L 的不同糖类物质为碳源 ,加入 2 g/L
蛋白胨 ,调节初始 pH=4.8 ,静置培养白构菌
至 8 d后 ,各碳源所得产酶液的 pH 值和漆酶
活力如表1所示。
静置培养时 ,接种后白构菌在上述不同
的培养基中均呈辐射状生长 ,并形成白色菌
膜覆盖在培养液的表面 ,但不形成菌球 。采
用考马斯亮兰显色法测定酶液中的可溶性蛋
白质 ,浓度均很低或不能检出。又由表 1可
见 ,培养至 8 d 后 ,各产酶液的 pH 值变化也
较小 ,这表明白构菌在上述各培养基中静置
生长时 ,分泌至胞外的可溶性蛋白质较少 。
表 1　碳源对漆酶合成的影响
碳源种类 pH 值 漆酶活力(IU/mL)
葡萄糖 4.82 44.5
木　糖 4.78 36.6
蔗　糖 4.84 71.7
纤维二糖 5.15 22.5
低聚木糖 4.79 87.5
淀　粉 5.06 82.2
以不同碳源培养白构菌所得的漆酶活力
差异明显 。在单糖类碳源中 ,葡萄糖的产酶
效果优于木糖 。产酶 8 d后 ,二者对应的漆
酶活力分别为 44.5 IU/mL和 36.6 IU/mL ,相
差21.6%。而采用低聚糖类培养基时产酶
性能的差异就更加显著 。其中 ,以蔗糖为碳
源产酶 8 d后 ,酶活力可达到 71.7 IU/mL ,较
葡萄糖又提高了 59.8%;但以纤维二糖为碳
源时 ,酶活力急剧下降 ,仅为 22.5 IU/mL ,比
蔗糖培养基下降 68.6%;而低聚木糖培养基
的酶活力可达到最高值 87.5 IU/mL ,比葡萄
糖提高近一倍。采用淀粉静置培养至 8 d
后 ,漆酶活力为82.2 IU/mL ,可达到低聚木糖
产酶水平的 93.9%。实验结果表明 ,提高底
物碳源的聚合度有利于增强对白构菌的诱导
作用。低聚木糖是白构菌合成漆酶的最佳底
物碳源 ,同时高聚合度的淀粉对白构菌合成
漆酶的诱导效果也较好 。由于低聚木糖的制
备成本较高 ,因此可选择廉价的淀粉作为白
·2· 林产化工通讯　　2004年第 38卷第 3期
构菌合成漆酶的底物碳源。
2.2　氮源对漆酶合成的影响
以 20 g/L 淀粉为底物碳源 , 分别添加
2 g/L 不同类型的氮源静置培养白构菌至8 d
后 ,所得产酶液的 pH值和漆酶活力如表2所
示 。
由表2可知 ,除酒石酸铵以外 ,无机类氮
源静置培养白构菌所得漆酶的酶活力普遍较
低 ,这与某些白腐菌的产酶特征相符 。其中 ,
硫酸铵的产酶效果最差 ,培养 8 d后 ,酶活力
仅为 31.2 IU/mL ,而酒石酸铵对应的酶活力
可达到最高值 87.4 IU/mL。采用有机类氮源
培养基所得的酶活力均较高 。其中 ,蛋白胨
和黄豆粉对应的酶活力分别为 82.2 IU/mL
和 79.5 IU/mL ,均可达到酒石酸铵产酶水平
的 90%以上。而采用硫酸铵和蛋白胨混合
型氮源培养白构菌时 ,并不能提高漆酶活力 ,
其产酶效果与单纯使用硫酸铵基本一致。与
蛋白胨和酒石酸铵等相比 ,黄豆粉的成本低
廉 ,从生产成本考虑 ,在白构菌液体发酵制取
漆酶的生产工艺中可选取黄豆粉为氮源。
表 2　氮源对漆酶合成的影响
氮源种类 pH 值 漆酶活力(IU/mL)
硫酸铵 4.83 31.2
尿　素 6.70 46.0
酒石酸铵 4.88 87.4
酵母浸膏 5.02 71.6
蛋白胨 4.85 82.2
黄豆粉 5.05 79.5
硫酸铵+蛋白胨 4.92 30.0
2.3　振荡对漆酶合成的影响
在大量的研究中 ,白腐菌发酵一般均采
用固体发酵或液体静置培养法 ,振荡或搅拌
对于不同白腐菌株液体发酵产酶的影响差异
较大[ 10～ 11] 。采用微生物液体深层发酵工艺
可显著提高生产效率 ,而白构菌又属于好氧
菌 ,在生长过程中需要耗用大量的氧气 ,所以
研究振荡和搅拌对于白构菌液体发酵制取漆
酶的影响规律具有重要的意义。在 250 mL
的摇瓶中 ,以 20 g/L 淀粉和 2 g/L 蛋白胨培
养基对振荡和静置培养方式的产酶效果进行
了比较 。研究发现 ,在培养过程中 ,两种培养
方式形成的菌落形式存在着明显的差异 ,在
振荡培养中菌体呈菌球状;而在静置培养中 ,
菌丝先呈放射状生长 ,至 10 d后基本上可形
成一层覆盖液面的白色菌膜。培养至 14 d
时 ,开始形成子实体并逐渐增大 。图 1表明 ,
在前 8 d的培养期内 ,两种培养方式对应的
酶活力和 pH 值基本一致;至 8 d 后 ,尽管两
者之间的 pH 值基本没有差异 ,但酶活力却
表现出明显的分化。其中 ,静置培养所对应
的酶活力上升速率较慢 ,至 14 d后 ,由于子
实体的形成 , 酶活力不再上升 ,维持在 168
IU/mL左右;相比而言 ,振荡培养的酶活力上
升速率较快 , 至 14 d 后上升速率进一步加
快 ,至 16 d可达到 308 IU/mL ,比静置培养提
高 83.3%。
分析出现分化的原因 ,笔者认为 ,培养至
8 d后 ,由于两种培养方式对应的菌体均已经
增至一定的浓度 ,此时菌体对养分和氧的需
求旺盛 。显然 ,与静置培养相比 ,高速振荡能
够强化液体培养体系内的传质作用 ,更适于
菌体的快速生长合成及漆酶的分泌。而本实
验所选用 180 r/min的振荡速率并未破坏白
构菌菌体 ,因此其产酶效果明显优于静置培
养 。
2.4　活化白构菌以淀粉为碳源合成漆酶的
反应历程
采用20 g/L淀粉添加 2.0 g/L酒石酸铵
培养基 ,接入体积分数 10%经活化后的白构
菌种母液 ,在 180 r/min的条件下振荡培养 ,
可极为显著地提高漆酶活力。由图 2 可见 ,
接种后还原糖浓度呈直线下降 ,这表明经活
化后的菌体迅速进入了生长期。培养 3 d
后 ,pH 值表现出缓慢上升的趋势 ,而漆酶活
力快速上升;至 4 d后 ,漆酶活力达到 1 381
IU/mL ,之后漆酶活力的变化出现一个平缓
期 ,但 pH 值仍然继续上升;至第 6 d 时 , pH
值达到 6.39 , 而漆酶活力可增至 1 749 IU/
·3·林产化工通讯　　2004年第 38卷第 3期
mL。分析原因为此时的培养条件已不适于
白构菌的生长 ,菌体开始自溶 ,释放出部分的
胞内酶 ,使酶活力出现跃升和 pH 值进一步
增高 。持续增高的 pH 值会导致酶变性失
活 ,酶活力迅速下降。至第 8 d ,pH 值达到7.
87 ,酶活力下降至 856 IU/mL。之后 ,由于菌
体大部分已死亡 ,pH值和漆酶活力均趋于稳
定 。上述结果表明 ,采用经活化后的白构菌
种母液接种并在振荡条件下产酶 ,可大大提
高漆酶活力 ,至 6 d漆酶活力可达到最高值 1
749 IU/mL。
—◇—振荡培养漆酶活力;—○—静置培养漆酶活力;
—★—振荡培养 pH 值;—◎—静置培养 pH 值
图 1　培养方式对漆酶合成的影响
—◇—漆酶活力;—■—pH值;—○—还原糖
图2　白构菌以淀粉为碳源合成漆酶的历程
3　结论
3.1　提高底物碳源的聚合度有利于增强对
白构菌合成漆酶的诱导作用 。在本实验所采
用的碳源中 ,白构菌以低聚木糖产漆酶的活
力最高 ,淀粉对白构菌合成漆酶的诱导效果
也较好 ,培养 8 d漆酶活力为 82.2 IU/mL ,产
酶水平可达到低聚木糖的 93.9%。生产中
可选择淀粉作为白构菌液体发酵制取漆酶的
底物碳源。
3.2　白构菌以酒石酸铵为氮源静置产漆酶
的活力最高 ,而以有机氮源产漆酶的活力也
较高 。以黄豆粉为氮源静置培养 8 d后 ,漆
酶活力为79.5 IU/mL ,可达到酒石酸铵产酶
水平的 90%以上 ,由于黄豆粉价格低廉来源
广 ,故可选取黄豆粉作为白构菌液体发酵制
取漆酶的优良底物氮源 。
3.3　采用振荡培养能够强化白构菌液体发
酵体系内的传质作用 ,更适于菌体的生长及
漆酶的分泌 。以 180 r/min产酶 16 d ,漆酶活
力可达到 308 IU/mL , 比静置培养提高
83.3%。
3.4　采用经活化后的白构菌种母液接种并
在振荡条件下发酵培养 ,可大大提高白构菌
漆酶活力 , 产酶至 6 d 后 ,漆酶活力可达到
1 749 IU/mL。
参考文献:
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SELECTION OF CULTURE CONDITIONS FOR LACCASE
BIOSYNTHESIS WITH FLAMMULINA VELUTIPES
XU Yong , ZHU Jun-jun , YE Han-ling , YONG Qiang , YOU Ji-xue , YU Shi-yuan
(College of Chemical Engineering , Nanjing Forestry University , Nanjing 210037 , China)
Abstract:Induction on the laccase biosynthesis with Flammulina velutipes was enhanced with the higher DP carbon source
and organic nitrogen source.Among experimented substrates , xylo-oligosaccharides and ammonia tartrate are the best carbon
source and the best nitrogen source , respectively.The laccase activity yielded with starch could reached 93.9% as much as
xylo-oligosaccharides and the result from organic nitrogen sources is satisfying , so starch and soybean powder was selected as
carbon source and nitrogen source for Flammulina velutipes biosynthesizing laccase , respectively.By enhancing the transfer in
a liquid medium , shaking could improve growth rate and enhance laccase excretion of Flammulina velutipes.The laccase ac-
tivity reached 308 IU/mL in the shaking culture , which was 83.3% more than that in the static culture.The laccase activity
of Flammulina velutipes was improved remarkably as it was inoculated after activation and grew in a shaking fermentor , and it
reached 1 749 IU/ mL at 180 r/min for 6 days.
Key words:laccase;Flammulina velutipes;liquid fermentation
(收稿日期:2004-01-05)
○政策法规○
加快林业发展当前要处理好六大关系
全国绿化委员会副主任 、国家林业局局
长周生贤最近在部署 2004年工作时提出 ,林
业部门要抓住林业发展的战略机遇期 ,延长
林业发展的高峰期 ,把握战略上的主动性 ,提
高策略上的有效性 ,在落实中央林业决定和
全国林业工作会议精神 、加快林业发展中 ,坚
持统筹 、协调发展 ,正确处理好六大关系。
1.正确处理好林业发展与国家建设的关
系 ,就是要处理好局部与全局的关系;2.正确
处理好资源培育与保护的关系 ,加快林业发
展首先要加快森林资源培育;3.正确处理好
生态建设与产业发展的关系 ,生态建设是产
业发展的基础 ,产业发展是生态建设的动力;
4.正确处理好东部 、中部与西部林业发展的
关系 ,我国东部 、中部 、西部自然 、经济 、社会
状况和林业发展的基础 、条件不同 ,需要统筹
谋划 、分类指导;5.正确处理好深化内部改革
与扩大对外开放的关系;6.正确处理好人的
发展与事业发展的关系。详情可登陆网站
http:// sdep.cei.gov.cn/ indexa/aindex.htm
(赵　霞)
·5·林产化工通讯　　2004年第 38卷第 3期