全 文 ：基金项目：本研究由海南省教育厅科研基金重项目(HjKj200403)、海南省自然科学基金(80431)、中国热带农业科学院基金
(Rky0725)资助。
分子植物育种，2007，第 5卷，第 3期，第 377-383页
Molecular Plant Breeding, 2007, Vol.5, No.3, 377-383
研究报告
Research Report
北美海蓬子盐胁迫条件下抑制差减文库构建与分析
李吉涛1 龙建琪3 叶妙水1 张桂和2 郭建春1*
1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口, 571101; 2 海南大学海洋学院, 海口, 570228; 3 湖南省桃江县农业局, 桃江, 413400
* 通信作者, jianchunguoh@163.com
摘 要 北美海蓬子(Salicornia Bigelovii Torr.)是一种耐盐性极强的真盐生植物，在200 mmol/L的Na+浓度
下生长，其高度和含汁量是5 mmol/L Na+浓度下生长的2倍和2.5倍。为了研究北美海蓬子耐盐的机理和分
离耐盐新基因，我们构建了在盐胁迫条件下北美海蓬子基因表达差异的SSH文库。以北美海蓬子种子播种
于0 mmol/L NaCl MS液体培养基上幼苗(0号材料)的总RNA为Driver，200 mmol/L NaCl诱导24 h幼苗(2号
材料)的总RNA为Tester，运用SMART PCR cDNA合成技术分别合成全长cDNA。将两种cDNA群体进行抑
制差减杂交，用T/A法分别构建了盐胁迫相关基因的正向差减文库(205个克隆子)和反向差减文库(235个克
隆子)。通过PCR和反式Northern Dot-Blot消除假阳性和重复克隆子，得到在盐胁迫下特异表达的阳性克隆
85个。对测序结果正常的81个克隆进行BLASTn分析，其中有70个cDNA序列与已经报道的其它物种的核
酸序列具有较高的同源性；另外11个cDNA序列未找到有较高相似性的已知序列。81个cDNA序列中没有
与北美海蓬子中已报道的核酸序列有较高的相似性，因此，所有81个克隆序列都是北美海蓬子中的新基
因。
关键词 北美海蓬子(Salicornia Bigelovii Torr.), 盐胁迫, 抑制差减文库
Construction and Analysis of Differentially Expressed cDNA Library of
Salicornia Bigelovii by Using Suppression Subtractive Hybridization
Li Jitao1 Long Jianqi3 Ye Miaoshui1 Zhang Guihe2 Guo Jianchun1*
1 Institute of Tropical and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, 571101; 2 Ocean College of Hainan University, Haikou,
570228; 3 Taojiang Bureau of Agriculture, Taojiang, 413400
* Corresponding author, jianchunguoh@163.com
Abstract Salicornia Bigelovii Torr. is a high salt-tolerant euhalophyte. Plants growing in 200 mmol/L NaCl are
2-fl od tall and more than 2.5-fl od succulent of plants growing in 5 mmol/L NaCl. In order to study the mechanism
of salt tolerance and isolate new genes related to salt tolerance in S. Bigelovii Torr., the SSH library has been con-
structed. The completed cDNAs were synthesized by using the SMART PCR cDNA technique, in which mRNAs
isolated from the plants growing on MS liquid medium with 0 mmol/L NaCl (sample 0) as driver, and the mRNA
isolated from the plants induced with 200 mmol/L NaCl for 24 h (sample 2) as tester. The forward SSH library
containing 205 clones and the backward SSH library containing 235 were constructed by using the T/A clone
method. Finally, 85 positive clones with different segments have been selected by using PCR and reverse northern
blot. 81 clones of the above 85 clones, which were sequenced normally, have been analyzed by BLASTn. The re-
sults showed that 70 clones are homology to the reported genes from another plants; 11 clones are very low or no
homology to any reported genes. All of the 81 clones have no homology to the genes reported in S. Bigelovii Torr.,
thus they are likely to be new genes.
378 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
盐渍是作物减产的主要原因之一。植物为了适
应盐渍非生物胁迫，会发生复杂的生理生化变化。
包括：(1) 植物体的形态适应，如：肉质化、产生
泌盐结构盐腺和盐囊泡、根部过滤土壤盐份或阻止
盐分运输到叶 (Greenway and Munns, 1980)；(2) 细
胞内渗透调节：细胞内会主动积累一些可溶性溶质
来降低胞内渗透势，以保证逆境条件下水分的正常
供应 (侯彩霞和汤章城, 1999)；(3) 活性氧清除机制：
高盐条件下植物产生复杂的分子反应，如胁迫蛋白
和可溶性渗透物质的产生，这些物质可清除活性氧
或阻止活性氧对细胞结构的伤害 (杜秀敏等, 2001)；
(4) Na+外排和区域化，以减少植物细胞体内盐浓度
的积累对细胞的伤害 (Blumwald et al., 2000; Zhang et
al., 2001; Yamaguchi et al., 2003)。已经发现与植物合
成小分子渗透物质、晚期胚胎发生富集蛋白 (LEA)、
渗透亚调节蛋白 (OSM)、水通道蛋白、K+通道蛋白
蛋白激酶、蛋白磷酸酶、各种转录因子、Ca2+及钙
调素等参与的各种信号传导途径与作物的耐盐有关
(Lin and Zhu, 1997; van der Meer, 1998; Sugihara et al.,
2000; Ishitani et al., 2000)。由于植物的耐盐性是多基
因控制的数量性状，且耐盐的机理在不同的植物中
不同，其复杂性为人们理解植物耐盐机理和培育抗
盐作物增加了难度。盐生植物在长期的进化过程中
形成了对土壤高盐分的适应，在高盐土壤中正常生
长发育，因此研究盐生植物的耐盐机理是揭开植物
耐盐之谜的有效途径；研究盐胁迫下基因表达差异
有利于进一步揭示植物耐盐的分子机制。
海蓬子属植物耐盐主要是利用离子区域化作
用 (ionic compartmentalization)，将高浓度的 Na+隔
离在液泡内，降低液泡水势，提高细胞的吸水能
力，从而形成大量的薄壁细胞，即肉质化 (succulent)
(Hasegawa et al., 2000)。研究表明，海蓬子耐盐机
理与液泡膜上的腺苷三磷酸酶 (ATPase)以及 Na+/H+
逆向运输蛋白有关 (Moriau et al., 1999; Wu et al.,
2004)。此外，海蓬子属植物的耐盐还受到其它很多
因素的影响，包括细胞膜的稳定性以及细胞壁中有
关成分、糖类物质代谢活性、氮类物质合成、内源
细胞分裂素水平、光合与呼吸酶活性的变化等都对
海蓬子属植物的耐盐起到一定的影响 (魏爱丽和陈
云昭, 2000; 王丽燕和赵可夫, 2004)。北美海蓬子属
于海蓬子属植物，是世界上最具耐盐性的植物之
一，典型的真盐生植物，其最适生长环境的盐分
为 200 mmol/L NaCl，在此浓度下其各项生物学指
标如分枝数、株高、种子数等均达到最大值 (Ayala
and O’leary, 1995)。因此研究北美海蓬子耐盐的分
子机制对了解真盐生植物耐盐机制，克隆最具耐盐
性的基因具有重大意义。
1 材料与方法
1.1材料
0号材料：北美海蓬子种子播种于含 0 mmol/L
NaCl的液体MS培养基上 (以吸水纸作为支持物)；
置于光照培养箱中 20℃、16 h光照条件下培养 25 d。
2号材料：播种于含 0 mmol/L NaCl的液体MS
培养基的材料，置于 20℃、16 h光照条件下培养
24 d后，置于含 200 mmol/L NaCl的MS液体培养
基上诱导 24 h。
RNA提取试剂 Trizol购于上海生物工程公司；
荧光染料 SYBR Green购于北京鼎国生物公司；
SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit、PCR-SelectTM
cDNA Substraction Kit、Advantage2 PCR Kit 为
CLONTECH Laboratories Inc.产品；DNA Fragment Pu-
rifi cation Kit、DH5α、各种限制性内切酶、克隆载体
pMD18-T vector均购于大连宝生物公司 (TaKaRa)；
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter
KitⅡ为 Roche公司产品、PCR相关试剂购于北京鼎
国生物公司。
1.2 北美海蓬子幼苗总 RNA的提取
100 mg北美海蓬子幼茎，液氮研磨成粉，转
入 1.5 mL离心管，加 1 mL Trizol (约为 10倍样品
体积)，室温放置 5 min后加 300 μL氯仿剧烈摇动，
12 000 r/min，4℃离心 10 min。取上清液加等体积异
丙醇混匀，室温放置 5 min，13 000 r/min，4℃离心
5 min。去上清，沉淀用预冷的 75%乙醇 (用 DEPC
水配)洗 2~3次。室温干燥后溶于适当的无 RNase
的水中。
1.3 抑制缩减杂交
用纯化的 Tester和Driver的总RNA，按照 SMART
PCR cDNA合成试剂盒提供的方法合成双链全长
cDNA，电泳回收集中于 500~3 000 bp间的带。经
RsaⅠ酶消化后连上接头，通过正向、反向两轮杂交
和两次 PCR扩增后得到抑制缩减杂交产物。
1.4 抑制缩减 cDNA文库的构建
分别用正向、反向抑制缩减杂交产物与 pMD-
18-T vector (TaKaRa)连接，转化 E. coli DH5α，感
379北美海蓬子盐胁迫条件下抑制差减文库构建与分析Construction and Analysis of Differentially Expressed cDNA Library of Salicornia Bigelovii by Using Suppression
受态细胞的制备参考《分子克隆试验指南》(J. 萨姆
布鲁克等, 著, 黄培堂等,译, 2002, 分子克隆实验指南
第三版, pp. 98-99)，涂板，得到正向和反向 SSH文库。
1.5 重组子的鉴定
采用内切酶消化、菌落 PCR法和反向 Northern
斑点杂交的方法对重组子进行鉴定。
1.5.1 内切酶消化
将平板上通过蓝白斑筛选初步确定含有重组质
粒的阳性菌落用牙签挑筛出来，接种于含氨苄青霉
素 (100 µg/mL)的 LB培养液中，于 37℃、300 r/min
振荡培养过夜。碱法小量制备重组质粒参考《分子
克隆试验指南》 (J. 萨姆布鲁克等, 著, 黄培堂等, 译,
2002, 分子克隆实验指南第三版, pp.27-29)推荐的方
法进行。用 HindⅢ和 BamHⅠ对质粒进行双酶切，
1.2%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm恒压条件下电泳 3
min后，于紫外灯下观察。
1.5.2 菌落 PCR
以 37℃、300 r/min振荡培养过夜的重组子阳
性菌落的菌液为模板，试剂盒提供的引物：Nested
PCR primer1: 5-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAG-
GT-3；Nested PCR primer 2R: 5-AGCGTGGT CGC-
GGCCG AGGT-3 进行 PCR反应。反应条件为 94℃
变性 5.0 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1.5 min，
30个循环，然后 72℃延伸 10 min。取 5.0 μL PCR
产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm恒压条件
下电泳 30 min后，于紫外灯下观察。
1.5.3 Reverse Northern斑点杂交
分别回收正向和反向差减 cDNA的 PCR产物，
经酶切去除接头后用 DIG DNA Label Kit标记作为
正向探针和反向探针。制备差减文库的两份相同拷
贝的尼龙膜分别于正向、反向 DIG标记探针 42℃杂
交 16 h。室温 (25℃) 2×SSC，0.1% SDS洗膜 5 min
2次；68℃，0.5×SSC，0.1% SDS洗膜 15 min 2次，
然后用 DIG DNA Detection Starter Kit检测。
2 结果与分析
2.1 总 RNA提取
用 Trizol分别提取 0号和 2号北美海蓬子幼苗
总 RNA。RNA电泳结果 (图1)可见 28 S、18 S、5.8 S
rRNA 3条明显的主带，表明 RNA完整性较好，可
以用于 ds-cDNA的合成。
2.2 抑制缩减杂交中 PCR扩增结果
经 RsaⅠ酶消化的平末端短片段连上接头，再
进行差减杂交。经过两轮杂交后，Tester和 Driver
中共同表达的基因得到了抑制，不能在 PCR中扩
增出，只有在 Tester中特有的序列才能得到有效扩
增。如图 2所示未经差减杂交的对照 PCR扩增产
物明显比经过两轮杂交后的 PCR扩增结果多，说
明杂交效果较好。
图 2 杂交前后PCR扩增产物
注: M: 分子标记; A: 对照1; B: 正向杂交; C: 反向杂交; D: 对
照2
Figure 2 The PCR product before and after hybridization
Note: M: Marker; A: Control 1; B: Forward hybridization; C:
Backward hybridization; D: Control 2
2.3 抑制差减杂交文库的构建
分别用正反向差减杂交后的 PCR产物，以 T/A
克隆法构建质粒载体文库。从正向差减文库中挑取
了 205个白色克隆子；从反向差减文库中挑取了
235个白色克隆子。克隆饱满清晰 (图 3)。
图 1 北美海蓬子总RNA
注: 0: 0号样品RNA; 2: 2号样品RNA
Figure 1 Total RNA of S. bigelovii
Note: 0: RNA from sample 0; 2: RNA from sample 2
380 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
2.4 重组子的筛选
2.4.1 PCR法筛选重组质粒
运用菌液 PCR方法对正向差减文库的 205个
克隆子进行筛选，获得 138个重组子，插入片段大
小基本位于 250 bp到 1 000 bp间 (图 4)。
2.4.2 反向 Northern斑点杂交筛选阳性差异片段克隆
将 2号 Tester和 0号 Driver材料的 ds-cDNA分
别用地高辛进行标记后作为正、反向探针，分别与
点在尼龙膜上的正向差减 cDNA文库的 138个阳性
克隆菌落的 PCR产物进行反向 Northern斑点杂交。
经洗膜、压片、显影和定影后，将正向探针 2号
Tester杂交膜上的杂交信号与反向探针 0号 Driver
杂交膜上的杂交信号进行对比分析后，找出在 Tes-
ter膜中杂交信号强于 Driver膜的克隆及在 Tester
膜中有杂交信号，而在 Driver膜中没有杂交信号的
克隆共 85个。图 5所示的是 Reverse Northern Dot-
Blot的部分图片。
2.5 基因片段序列分析
将经过反向 Northern斑点杂交筛选的 85个阳
性差异片段克隆进行序列测定，结果显示共有 81
个克隆的插入序列可以进行 BLASTn分析。
分析表明，所有的 81个克隆 cDNA片段在北美
海蓬子中均为首次被分离，其中有 11个片段从未
图 3 SSH文库
注: A: 正向差减文库; B: 反向差减文库
Figure 3 SSH Library
Note: A: Forward subtracted cDNA library; B: Backward sub-
tracted cDNA library
图 4 SSH文库中部分重组子PCR检测电泳图
Figure 4 The detection of the clones in the SSH library by PCR
图 5 反向Northern斑点杂交图
Figure 5 Reverse Northern Dot-Blot
被报道过的未知基因，其余 70个克隆的 cDNA序
列与功能已知的核酸序列同源性较高，可以推测
其功能。分析结果表明 (表 1)，所得到的差异表达
381北美海蓬子盐胁迫条件下抑制差减文库构建与分析Construction and Analysis of Differentially Expressed cDNA Library of Salicornia Bigelovii by Using Suppression
cDNA片段克隆中，结构蛋白基因很少被克隆，而
在总 mRNA中占较小比例的信号转导相关蛋白、物
质代谢相关酶、基因表达调控相关蛋白、氧化还原
酶类等却大量被克隆。其中物质代谢相关酶基因克
隆 16个，约占 23%；信号转导相关蛋白基因克隆
9个，约占 13%；基因表达调控相关基因克隆 9个，
功能
Function
克隆子及克隆号
Clones & Sample No.
物质代谢相关酶

Enzymes related to
material metabolism
肉豆蔻酰转移酶(21), 酯酶(29), 磷酸(酯)酶(75), β-淀粉酶(79), 丝氨酸-type肽酶(80), 泛肽交联酶(85), 乙
醇脱氢酶(88), 乙酰-CoA合成酶(101), 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(110), 磷酸丙糖异构酶(TIM) (118), 1-氨基
环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶(119), ATP-依赖型蛋白水解酶(127), 丙酮酸脱氢酶(138), 膜丙氨酰氨基肽酶
(177), 磷酸甘油水解酶(193), 乙酰乳酸合成酶 (196)
N-myristoyl transferase (21), Esterase (29), Phosphatase (75), Beta amylase (79), Serine-type peptidase (80),
Ubiquitin-conjugating enzyme (85), Alcohol dehydrogenase (88), Acetyl-CoA synthetase (101), Fructose
1,6-bisphosphate aldolase (110), Triosephosphate isomerase (TIM) (118), ACC synthase (119), ATP-dependent
protease (127), Pyruvate dehydrogenase (138), Membrane alanyl aminopeptidase (177), 2-phospho-D-glycerate
hydrolase (193), Acetolactate synthase (196)
信号转导相关蛋白
Proteins related to sig-
naling transduction
ATP结合蛋白 (23, 38), 转化生长因子β (TGFβ)受体Ⅰ (147), ADP-核糖基化因子(5), ADP核糖基化因子1
(arf1) (77), 主体水通道蛋白MIP (95, 117, 186), 转运蛋白 (107)
ATP-binding protein (23, 38), Transforming growth factor beta receptor Ⅰ (147), ADP-ribosylation factor (5), ADP-
ribosylation factor 1 (arf1) (77), Major intrinsic protein (95, 117, 186), Antiporter/drug transporter/ transporter (107)
免疫相关蛋白
Immunogenic protein
主要组织相容性复合体Ⅰ (113), 主要组织相容性复合体Ⅱb (149)
Major histocompatibility complex class Ⅰ (113), MHC class Ⅱb (149)
细胞周期相关蛋白
Proteins related to
cell division
中心粒相关蛋白(98), 细胞周期蛋白依赖性激酶7 (161)
Centrin-related protein (98), Cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) (161)
表达调控相关蛋白
Proteins for gene ex-
pression regulation
亮氨酸拉链蛋白 (10, 123), RNA结合蛋白 (13), RNA解螺旋酶 (25), DNA结合转录因子 (43), 核基质转录
因子(151), DNA解螺旋酶(153), 转录调节蛋白(156), 转录辅助因子(189)
Leucine zipper protein (ZIP) (10, 123), RNA-binding protein-like protein (13), RNA helicase (25), Binding/
transcription factor (43), Nuclear matrix transcription factor (151), Protein binding / transcription regulator
(156), Transcriptional coactivator (189)
能量转化相关蛋白
Proteins for energy
transfer
ATP合成酶 (81), ATPase家族(128), ATP结合激酶(145)
ATP synthase (81), ATPase family (128), ATP-binding kinase (145)
光合系统相关蛋白
Proteins related to
photosynthesis
细胞色素b5还原酶/氧化还原酶(32), 叶绿素a/b结合蛋白(42, 90, 111, 134, 135, 143, 204), 光系统Ⅰ P700脱辅
基蛋白A2 (psaB) (52), 细胞色素b (131)
Cytochrome-b5 reductase/ oxidoreductase (32), Hlorophyll a/b binding protein (42, 90, 111, 134, 135, 143,
204), Photosystem Ⅰ P700 apoprotein A2 (psaB) (52), Cytochrome b (131)
伤害相关蛋白
Proteins related to
stresses
热震惊相关蛋白 (7, 19, 136), 氧化胁迫反应因子OXSR1 (93)
Heat-shock protein (7, 19, 136), Oxidative-stress responsive 1 (OXSR1) (93)
氧化还原酶类
Oxidoreductases
谷胱甘肽转移酶(2), 铜锌超氧化物岐化酶(86, 94), 氨基乙酸多酚氧化酶 (89), 硫氧还蛋白(103), 1,5-二磷
酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基rbcS-3 (121), 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基rbcL (174)
Glutathione S-transferase (2), Copper/zinc-superoxide dismutase (86, 94), Glycine max diphenol oxidase lac-
case (89), Thioredoxin (103), Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit (rbcS-3) (121),
Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) (174)
其它
Others
叶绿体核糖体循环因子(141), tRNA基因(144), secY 基因 (167), 肌球蛋白重链1 (6), 组蛋白1 (41), 核糖体
RNA结合蛋白(78), 外膜蛋白C (ospC) (115), 叶绿体37 kD内膜蛋白 (120)
Chloroplast ribosome recycling factor (141), Transfer RNA gene (144), secY gene (167), Myosin heavy poly-
peptide 1 (6), Histone H1 (41), Ribosomal RNA-binding protein (78), Outer surface protein C (ospC) (115),
Chloroplast 37 kD inner envelope membrane protein (120)
表 1 BLASTn推测克隆序列功能
Table 1 The function presumed by BLASTn analysis
382 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
约占 13%；氧化还原酶类基因克隆 7个，占 10% 。
3 讨论
3.1 抑制差减杂交
抑制差减杂交技术 (suppression subtractive hy-
bridization, SSH)利用了差减杂交技术、限制性内切
酶与抑制 PCR相结合的方法，经过两次杂交和两
次 PCR，以富集和获得目标片段，具有以下优点：(1)
假阳性率被大大降低，可获得较多的特异性表达产
物，阳性率高可高 94% (Von Tein et al., 1997)；(2)
具有高敏感性，均等化富集目标片段，避免了表达
序列标签 (expressed sequence tag, EST)分析中高丰
度基因重复测序的缺点，使得低丰度 mRNA也能
被检测到 (罗志勇等, 2003; Zheng et al., 2004; 徐碧
玉等, 2005)。因此 SSH 技术被应用于植物差异表达
基因的分离 (Kuang et al., 1998; 王永胜等, 2001; 郭
新红等, 2001; 张大栋等, 2006)。
但是 SSH法也有其缺点：(1)反应需要几微克
量的 mRNA，有些珍贵材料很难获得足够的起始量，
同时很低丰度的差异表达的基因可能检测不到；(2)
合成的 cDNA被限制内切酶消化，获得的目的片段
较短，要进一步研究还需通过其它方法，如 RACE
技术拉全长，获得全长特异性 cDNA (骆蒙等, 2000;
Wang et al., 2005)。
针对 SSH技术的缺点，我们己经采取了很多
方法来避免：(1) RNA用量大，通过 SMART PCR
cDNA 合成技术获得 ds-cDNA，仅以 50~100 ng
总 RNA作为起始材料，就能获得几微克全长 ds-
cDNA，同时省略了分离 mRNA这一环节，减少了
mRNA的损失和降解的机会。(2)通过 SSH技术
获得的是 RsaⅠ消化后的 cDNA片段，不是全长
cDNA，现在有很多方法可以克隆到全长 cDNA，
如 RACE、cDNA文库等，这些工作正在开展。(3)
所需研究材料的遗传背景差异不能太大，本研究使
用的一对材料采自同株北美海蓬子幼苗，差异仅在
于是否经过 NaCl的诱导，增强了实验的针对性。
3.2 重组子的筛选方法
本研究选取正向差减文库中的 1~10号克隆提
取质粒，进行酶切鉴定。同时以正向差减文库中
1~10号克隆的菌液作为模板进行 PCR检测。通过
两种方法比较发现 PCR方法优于酶切法，主要体
现在 PCR可以直接利用菌液作为模板，省去质粒
提取的步骤，而且每次检测样品多，检测得到插入
片段的大小结果真实、可靠，同时获得插入片段的
量较多，反应产物适用于下一步实验分析。而酶切
法不但要求提取较高质量和数量的质粒，同时当插
入片段内部有检测时所用内切酶的位点时，就不能
准确检测到插入片段的大小，所以用 PCR方法进
行大规模筛选重组子是比较理想和经济的方法。
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