全 文 ：巨大革耳遗传多样性的 ISSR分析 *
江玉姬 1,2，谢宝贵 2**，刘新锐 2，邓优锦 2，陈东兴 2，朱 坚 3
（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学菌物研究中心，福建 福州 350002；
3.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002）
摘要：为确定巨大革耳种质资源间的亲缘关系，本文应用 ISSR分子标记技术，对来源不同地区的野生或栽培的 9个巨
大革耳菌株进行遗传多样性分析。从 20个引物筛选获得 4个 ISSR多态性引物对巨大革耳菌株扩增，获得 23条多态性
条带，多态性比率为 85.19%；对扩增结果进行聚类分析，当遗传距离为 20%时，9个菌株聚为 2类：Ι类包括 C.m0002
菌株；Π类包括其它的 8个菌株。其中 C.m0002菌株与其它 8个菌株的遗传距离很远。经栽培出菇实验，结果表明，
C.m0002菌株的子实体似多脂鳞伞（黄伞），是同名异种；其它 8个菌株均为巨大革耳。ISSR分析的结果与子实体形态
特征一致。
关键词：巨大革耳；ISSR分子标记；遗传多样性
中图分类号：S646.9 文献标识码：A 文章编号：1003-8310（2012） 06-0032-03
Analysis of Genetic Diversity among Germplasm of Panus giganteus by ISSR Markers
JIANG Yu-ji1,2, XIE Bao-gui2, LIU Xin-rui2, DENG You-jin2, CHEN Dong-xing2, ZHU Jian3
（1.College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou Fujian 350002；2.Mycological Research
Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou Fujian 350002；3.College of Horticultur, Fujian Agriculture and
Forestry University, Fuzhou Fujian 350002）
Abstract: In order to evaluate the genetic relationship among germplasm of Panus giganteus, the genetic diversity of 9 P.
giganteus strains from different regions of china was analyzed using ISSR markers. 4 ISSR primers were selected from 20
primers were applied to amplify the DNA of 9 strains. The results showed that polymorphic bands were 23, and the poly－
morphic rates were 85.19%. UPDMA dendrogram based on ISSR markers indicated that 9 P. giganteus strains could be
distinguished into 2 groups when genetic distance was 20%, and the Ι group included C.m0002 strain, the group Π in－
cluded the other 8 strains. The genetic distance between C.m0002 strain and the other 8 strains was large. The strain C.
m0002 might be Phonliota adipose, and the other 8 strains were Panus giganteus by cultivation experiment. Their genetic
relation based on ISSR markers was corresponded with the one based on fruit body traits.
Key words: Panus giganteus; ISSR molecular marker; Genetic diversity
巨大革耳 （Panus giganteus） 又名大杯伞、大杯蕈、
大漏斗菌、猪肚菇、笋菇、大杯香菇等，隶属真担子菌门
（Basidiomycota）、担子菌纲 （Basidiomycetes）、多孔菌目
（Polyporales）、多孔菌科（Polyporaceae）、革耳属（Panus）[1]。
自然环境中夏、秋季节大量群生或丛生于林地腐枝层上，
主要分布在我国的河北、山西、黑龙江、青海等地区。从
自然界的生长习性和分布可以看出，巨大革耳（猪肚菇）
是一种中高温型的美味珍稀食用菌种类，菌肉肥厚，个体
较大，味道鲜美，是一种很有发展前途的夏、秋季栽培食
用菌[2]。人工栽培多进行熟料袋栽，栽培方法与常规木腐生
菌相同。但巨大革耳（猪肚菇） 人工栽培历史很短，目前
栽培用种主要来源于野生资源的驯化和引种，存在着同种
异名，同名异种的现象，给生产和育种带来了混乱产生了
严重的后果。本文应用 ISSR分子标记对国内不同地区收
集或分离的 9株巨大革耳进行了分子遗传多样性研究，为
巨大革耳菌种管理、遗传资源的保护和充分利用、育种研
*项目来源：福建省科技厅项目（08SZ00021）；国家星火计划项目（2011GA720008）。
作者简介：江玉姬，女，教授，长期从事微生物的教学与研究。E-mail: jyj1209@163.com
**通讯作者：谢宝贵，教授，长期从事食用菌栽培与育种研究。E-mail: mrcfafu@163.com
收稿日期：2012-09-08
中国食用菌 2012，31（6）：32~34
EDIBLE FUNGI OF CHINA
CN53－1054／Q ISSN 1003－8310
江玉姬等：巨大革耳遗传多样性的 ISSR分析
图 1-2 引物 ISSR13和 ISSR15的扩增电泳图
注：图中 M泳道为 Marker，1～9泳道代表的菌株见表 1；文中所
有图的 M、1～9代表同样的意义。
图 1-1 引物 ISSR5 和 ISSR12 对巨大革耳菌株 ISSR-PCR 扩增图谱
究工作的开展等提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试菌种
9株供试菌株，由福建食用菌株，质资源保藏管理中
心提供，试验编号及其它信息如表 1所示。
1.1.2 试剂
20 个 ISSR 引物为上海 Sangon 生物工程公司生产；
PCR kit、500 bp DNA Ladder Marker 购自 TaKaRa 公司，
其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3 供试培养基
斜面固体培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂
20 g，水 1 000 mL，pH值自然。
液体培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g，水 1 000
表 1 供试巨大革耳菌株及来源
泳道 保藏管理中心编号 菌株原名称 菌种来源
1 C.m0001 大杯蕈 福建农林大学菌物研究中心（野生分离）
2 C.m0002 大杯伞 河北省泌阳县真菌研究所
3 C.m0003 大杯蕈 华中农业大学菌种中心
4 C.m0004 大杯伞 湖北嘉鱼县环宇食用菌研究所
5 C.m0005 大杯蕈 福州市农业科学研究所食用菌室
6 C.m0006 大斗菇-1 三明真菌研究所
7 C.m0007 大斗菇-2 三明真菌研究所
8 C.m0008 大杯伞-1 漳州市龙海九湖食用菌研究所
9 C.m0009 大杯伞-2 漳州市龙海九湖食用菌研究所
mL，pH值自然。
出菇培养基：棉籽壳 85%、麦麸 10%、玉米粉 3%、
碳酸钙或石膏 2%，含水量 65%～70%，pH6.0。
1.1.4 巨大革耳菌丝体制备
供试菌株在 PDA试管斜面培养基上培养 7 d～10 d后，
转接到新鲜 PDA试管斜面培养基上培养至满管，用接种
耙耙碎菌块，接入 250 mL三角瓶液体培养基中，每个菌
株各接 2瓶，置于 120 r·min-1摇床上 26℃恒温培养 10 d，
用纱布过滤，蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干水分，称取 1 g
菌丝用滤纸包好，保存于-20℃下备用。
1.1.5 DNA提取
取 1 g菌丝放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转
入 7 mL的离心管，采用 CTAB法提取 DNA，-20℃保存备
用，具体操作参考文献[3]、[4]。
1.1.6 ISSR扩增
ISSR 反应体系 25 μL：模板 DNA 1.2 ng·μL-1，引物
0.4 μmol·L -1，dNTPs 0.2 mmol·L -1 ，MgCl2 2 mmol·L -1，
Taq DNA聚合酶 2 U，PCR缓冲液 1×，具体操作参考文献
[3]、 [4]，将重复性好、强度较高、清晰可辨无争议、能
体现菌株间差异的条带确认为标记条带，进行相应的统计
和分析。
1.1.7 数据统计与分析
ISSR扩增产物以 0、1统计建立 ISSR数据库。将相同
引物 PCR扩增产物中电泳迁移率一致的标记条带确认为
同一条带，扩增阳性记录为“1”，扩增阴性记录为“0”，
利用 SPSS10.0分析软件的 Jaccard方法计算样品间的遗传
相似性，用类平均法（UPGMA） 对 ISSR统计形成“0/1”
表型数据矩阵进行聚类分析，生成遗传距离聚类图[5,6]。
1.1.8 出菇实验
栽培出菇实验参考刘斌等[7]的方法。
2 结果与分析
2.1 ISSR结果与分析
从 20个引物筛选出 4个多态性好的引物（表 2），扩
增的结果见图 1。
从图 1中可知，4个引物对 9个菌株扩增的片段大小
在 1.0 kb～3.0 kb之间，各个引物扩增的位点数分别为 7、
8、5、7，平均位点数为 6.25；平均每个引物产生个 5.75
个多态性条带。ISSR共扩增出 27个位点，多态性条带总
共为 23，多态率为 85.19%。经过软件处理后，建立树状
图（图 2）。
从图 2可以看出，5号、6号、7号、9号菌株聚为一
类，它们的相异系数为 0，可能为同种异名；3号、4号
表 2 ISSR引物序列
引物 序列 退火温度/℃
ISSR5 VDH（TCG）5 57.4
ISSR12 （AG）8 T 50.0
ISSR13 （GA）8 C 52.0
ISR15 （CA）8 G 52.0
第 31卷 第 6期 33
菌株及 1号、8号菌株各聚为一类，2号菌株单独一类；2
号菌株与其它 8个菌株的遗传距离很远，3 号、4 号、1
号、8号菌株与 5号、6号、7号、9号菌株有一定的遗传
距离。当相异系数 D为 0.20水平上，9个菌株聚为 2类：
Ι类包括 2号菌株；Π类包括 1号、3号、4号、5号、6
号、7号、8号、9号菌株。2号菌株与其它 8个菌株的遗
传距离很远，故对 9个菌株进行了栽培出菇实验，以观察
子实体的形态是否有差异。
2.2 子实体形态分析
根据栽培出菇实验结果表明，C.m0002菌株的子实体
（图 3） 明显不同于其它菌株，酷似多脂鳞伞（黄伞），是
同名异种，单独归为 Ι类；其它 8个菌株均为巨大革耳，
子实体的形态较一致，部分菌株的子实体形态见图 4、图
5 和图 6，归为第 Π 类。子实体特征分析的结果与 ISSR
分类的结果吻合。
3 讨论
近年来，不断快速发展的 DNA分子标记技术越来越
多的被应用在研究种质资源的多样性以及分子辅助遗传育
种上，显示出了极大的优越性。它不仅能快速的获得分析
结果，而且其结果不受外界环境因素和生长发育阶段的影
响；所以，分子标记已经成为分子水平的种质资源亲缘关
系及检测种质资源多样性和品种鉴定的有效工具[8]。
ISSR是由 Zietkiewi CZ等 [9]创建的一种简单重复序列
间扩增多态性分子标记。ISSR技术与常规 PCR有相同的
反应条件，该技术克服了限制性内切酶片段长度多态性
RFLP 标记、 SSR 标记和随机扩增多态性 DNA 标记
（RAPD） 的技术限制，具有操作简单、引物扩增的结果重
现性较好、模板 DNA 用量少等优点，且不需要知道基因
组序列，可以检测基因组许多位点的差异 [6-8]，已广泛应用
于动植物种质鉴定、遗传作图和基因定位，尤其在分子遗
传学基础贫乏的作物研究中显示出极大的优势[10,11]。但在食
用菌中的应用还不多，在香菇 [8]、杏鲍菇[12]、金针菇[13]、松口
蘑及花鹅膏菌 [11]、天麻 [14]、侧耳属[10]等品种的鉴定及亲缘关
系研究中的应用已有报道，但用 ISSR技术分析巨大革耳
菌株间的亲远关系目前没有相关的文献报道。
9个菌株的 ISSR分析中，5号（C.m0005）、6号（C.
m0006）、7号（C.m0007）、9号（C.m0009） 的遗传距离为
零，结合子实体的形态特征可认定它们为同种内的菌株。
C.m0003、 C.m0004、 C.m0005、 C.m0006、 C.m0007、 C.
m0008、C.m0009七个栽培菌株分别来自武汉、湖北嘉鱼、
福州、三明 4个不同的地方，其中 C.m0008与其它 6个菌
株有一定的遗传距离，说明有一定的遗传多态性，但不丰
富。而 C.m0001和 C.m0002菌株与其它 7个菌株间的遗传
距离较远。出菇实验结果表明，C.m0002菌株的子实体似
多脂鳞伞（黄伞），是同名异种；其它 8个菌株均为巨大
革耳。本研究的结果以及 ISSR标记在香菇、杏鲍菇、金
针菇、侧耳属等的应用，说明 ISSR分子标记在食用菌的
种质资源遗传多样性、亲缘关系分析中的应用是可信的。
本研究结果也将为巨大革耳的生产和育种以及种菌管理提
供基础数据。
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图 2 9个菌株的 ISSR聚类树状图
相异系数
图 6 C.m007菌株的子实体图
图 3 C.m002菌株的子实体图 图 4 C.m003菌株的子实体图
图 5 C.m001菌株的子实体图
中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA Vol． 31 No．634