全 文 ：食用菌学报 2009.16(3):5 ～ 10
收稿日期:2009-04-09 原稿;2009-08-18修改稿
基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目“食用菌工厂化生产关键技术研究”[沪农科攻字(2006)第3-1号]的部分研究内容
作者简介:张美彦(1982-), 女 , 2007年毕业于南京农业大学遗传学专业 ,硕士 ,主要从事食用菌遗传育种的研究 ,
发表主笔论文 3 篇。
＊本文通讯作者
文章编号:1005-9873(2009)03-0005-06
ITS-RFLP及 SRAP标记在灰树花种质评价中的应用
张美彦 , 尚晓冬 , 李　玉 , 郭　倩 , 陈明杰 , 谭　琦＊
(农业部应用真菌资源与利用重点开放实验室 ,上海市食用菌工程技术研究中心 ,
上海市农业遗传育种重点实验室 , 上海市农业科学院食用菌研究所 ,上海 201106)
摘　要:以 25个灰树花(Grifola frondosa)菌株的子实体为材料提取基因组 DNA , ITS扩增后对产物进行酶
切 , 25个菌株的 ITS条带处于同一位置 , 酶切后部分菌株呈现不一样的切点 ,可将这些菌株大致分为三类。应
用扩增清晰 、多态性高的 47 对 SRAP 引物对这 25 个菌株进行 SRAP分析 , 共得到 138 条多态性条带 , 树状图
显示 ,这些菌株在相似度 77%水平上可分为三类 ,与 ITS-RFLP的分析结果类似。 SRAP 分析结果显示 , 有 10
个菌株可以被有效的区分 , 15 个菌株未能找到其相互之间的差异带 , 说明 ITS-RFLP和 SRAP标记可以应用
于区分菌株 ,进行种质评价。
关键词:灰树花;SRAP;ITS;种质评价
　　灰树花(Gri f ola f rondosa)是一种名贵的食
药用菌 ,因其特有的药用价值受到国内外学者的
广泛关注 。从零星的报道看 ,国内有较多的灰树
花野生资源分布 ,但对菌种选育研究还少有报
道 ,而开展育种工作必须首先对育种材料有全面
的了解和评价 ,目前灰树花可用于种质评价的特
定性状比较少 ,从分子手段入手是比较便捷有效
的方法。
ITS(internal t ranscribed spacer , 内转录间
隔区)序列分析已被应用于很多真菌物种的分子
鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群
间的系统发育关系分析 ,在食用菌中也被广泛应
用[ 1 ～ 3] 。 SRAP (sequence related ampli fied
po lymorphism ,相关序列扩增多态性)技术的基
本原理是通过设计的引物对 ORFs(open reading
f rames)进行扩增 ,上游引物对外显子进行特异扩
增 ,下游引物对内含子区域 、启动子区域进行特
异扩增。因个体不同以及物种的内含子 、启动子
与间隔区长度不等而产生多态性 ,与其它分子标
记相比 ,该标记具有简便 、稳定 、产率高 、便于克
隆目标片段的特点 ,且属于功能性分子标记 ,已
被应用于图谱构建 、比较基因组学和遗传多样性
分析 。食用菌中已成功应用于灵芝[ 4 , 5] 、香菇[ 6] 、
银耳[ 7] 、真姬菇[ 8] 等。我们对 25个灰树花菌株进
行了 ITS-RFLP (restriction f ragment leng th
polymorphism , 限制性片段长度多态性)以及
SRAP 分析 ,为分子标记在灰树花种质评价上的
应用提供一些理论依据 。
1　材料与方法
1.1 供试菌株及来源
　　本实验中所用的 25个灰树花菌株均保藏于
上海市农业科学院食用菌所菌种保藏中心 ,菌株
编号 、名称以及来源见表 1。
1.2 基因组 DNA的提取
　　采用工厂化袋料栽培获得不同菌株的子实
体 ,培养料采用文献[ 9]的最佳配方。采收的子
实体取菌柄部分分成小份冻存 ,基因组 DNA 的
提取采用改进的 CTAB 法[ 10] 。子实体裂解后 ,
加入 1/3 体积的饱和 NaCl , 13 000 g 离心
20 min ,上清液用酚∶氯仿(1∶1)抽提 2次 ,氯仿∶
异戊醇(24∶1)抽提 1次 ,无水乙醇沉淀后用 70%
的乙醇洗 2次 ,沉淀融于 100 μL TE 缓冲液(pH
8.0)中 ,加入 1 μL RNase(10 mg/mL), 37 ℃温
育 1 h 。用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
质量和浓度。
食　用　菌　学　报 第 16 卷
表 1　供试菌株及其来源
Table 1　Test strains and their origin
编号
No.
名称
Accession No.
来源
Or igin
编号
No.
名称
Accession No.
来源
Origin
1 0206 日本 Japan 14 1412 河北 Hebei , China
2 WC367 美国宾夕法尼亚州立大学 PSU 15 1415 上海农科院食用菌研究所 I nstitute of
Edible Fungi , Shanghai
3 WC557 韩国 Korea 16 1419 福建三 明 真 菌 研 究 所 Sanming
Mycological Institute , Fujian
4 WC659 韩国 Korea 17 1422 浙江松阳 Songyang , Zhejiang
5 WC685 美国宾夕法尼亚州立大学 PSU 18 1434 上海农科院食用菌研究所 I nstitute of
Edible Fungi , Shanghai
6 WC808 美国宾夕法尼亚州 Tidioute , PA 19 1437 上海农科院食用菌研究所 I nstitute of
Edible Fungi , Shanghai
7 WC828 美国宾夕法尼亚州立大学 PSU 20 灰M合 Hui M He 浙江庆元 Qingyuan , Zhejiang
8 WC874 美国宾夕法尼亚州立大学 PSU 21 灰M庆 Hui M Qing 浙江庆元 Qingyuan , Zhejiang
9 WC904 美国宾夕法尼亚州立大学 PSU 22 灰M良 Hui M Liang 浙江庆元 Qingyuan , Zhejiang
10 WC905 美国宾夕法尼亚州立大学 PSU 23 灰M云 Hui M Yun 浙江庆元 Qingyuan , Zhejiang
11 WC922 美国宾夕法尼亚州立大学 PSU 24 灰树花 G .frondosa 浙江庆元 Qingyuan , Zhejiang
12 1408 福 建三明真菌研 究所 Sanming
Mycological Institute , Fujian
25 斯灰 GF10
Sihui GF10
斯洛文尼亚 Slovenia
13 1410 日本 Japan
PSU:The Pennsylvania State University
1.3 ITS-RFLP分析
　　ITS 扩增的反应体系为 25 μL ,包括 2.5 μL
10 × 反 应 缓 冲 液 , 2.0 mmol/L MgCl2 ,
120 μmol/L dNTP , 0.12 μmol/ L ITS1 ,0.12μM
ITS4 ,1.0 U Taq 酶 , 1.0 μL (～ 25 ng)模板
DNA 。反应条件参照文献 [ 4] 。 PCR 产物经
1.5%琼脂糖凝胶电泳 , EB染色后 ,用凝胶成象
系统保存并观察记录结果。
扩增产物经不同的限制性内切酶(Takara 公
司的 Ecol Ⅰ , Hae Ⅲ , Hha Ⅰ , Hinf Ⅰ , Pst Ⅰ和
Stu Ⅰ)进行酶切 ,酶切体系参照说明书 ,酶切产
物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳 ,EB染色后用凝胶成
象系统保存并观察记录结果 。将酶切图谱有差
异的部分 I TS扩增产物进行回收 ,送北京六合华
大基因科技股份有限公司克隆测序 ,序列结果进
行 BLAST比对 ,比对酶切位点并构建树状图 。
1.4 SRAP分析
　　参照文献[ 11]合成 SRAP引物(引物序列见表
2 ,由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。PCR反
应体系及反应条件参照文献[ 4] 。PCR 产物经
2.0%的 Agarose 凝胶电泳 ,EB染色后用凝胶成象
系统保存并观察记录结果 。对各引物的扩增情况
进行统计 ,有条带记为 1 ,无则记为 0 ,应用 NTSYS
聚类分析软件对条带进行分析 ,构建树状图。
表 2　SRAP 标记正向 、反向引物的序列
Table 2　Sequences of SRAP primers
类型
Type
引物名称
Pr imer
序列
Sequence
正向引物 me1 TGAGTCCAAACCGGATA
Forward me2 TGAGTCCAAACCGGAGC
pr imers me3 TGAGTCCAAACCGGAAT
me4 TGAGTCCAAACCGGACC
me5 TGAGTCCAAACCGGAAG
me6 TGAGTCCAAACCGGTAG
反向引物 em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Reverse em2 GACTGCGTACGAATTTGC
pr imers em3 GACTGCGTACGAATTGAC
em4 GACTGCGTACGAATTTGA
em5 GACTGCGTACGAATTAAC
em6 GACTGCGTACGAATTGCA
em7 GACTGCGTACGAATTATG
em12 GACTGCGTACGAATTGTC
em13 GACTGCGTACGAATTGGT
em15 GACTGCGTACGAATTCTG
2　结果与分析
2.1 ITS扩增
　　基因组 DNA 提取后 , 分别测定浓度 , 将
DNA 模板浓度稀释到 10 ng/μL ,采用 ITS 通用
引物对 25 个菌株进行扩增后 ,所有菌株扩增条
6
第 3 期 张美彦 , 等:ITS-RFLP及 SRAP标记在灰树花种质评价中的应用
带均为单一带 ,处于大约 700 bp 的位置。
2.2 ITS-RFLP分析
　　本实验中共用 6 种限制性内切酶对 ITS 扩
增产物进行了酶切 ,其中 P stI 、StuI 均未将 ITS
区切开 , Ecol I、Hin f I均切开但是菌株间没区别 ,
HaeⅢ在斯灰GF10的 ITS 区的酶切位点与其余
菌株不同 , HhaI 在 4 个菌株(WC367 、WC808 、
1434 、斯灰GF10)的 ITS区的酶切位点与其余菌
株不同 ,也就是说 , HhaI可以将这 4个菌株与其
它菌株区分开来 , HaeⅢ可以从这 4 个菌株中将
斯灰 GF10区分出来 。
选了 WC367(2 号)、WC808(6 号)、1422
(17号)、1434(18号)、灰 M 良(22号)、灰 M 云
(23号)、斯灰 GF10(25号)7 个菌株 ,分别代表
酶切的三类 ,对其 ITS 扩增序列进行克隆测序 ,
序列结果进行 BLAST 比对后发现 ,这些条带均
为灰树花 ITS 区域的序列 ,因来源于美国的
WC367 、WC808的 ITS序列已登录 GenBank(序
列号为 AY049126 和 AY049137),我们将其余
5个菌株的序列提交到 GenBank , 序列号为
FJ766486-FJ766490。
用 DNA star软件包的 Mapdraw 对序列进行
模拟酶切 ,切得的条带大小与实际的电泳结果一
致。 HaeⅢ在斯灰 GF10 的 ITS 区有 1个切点 ,
在其余 24个菌株的 ITS 区有 2个切点 , HhaI 在
其中 4个菌株(367 、808 、1434 、斯灰 GF10)的 ITS
区有 1个切点 ,而其余 21个菌株则有 2个切点 。
将所测序列连同 GenBank 登录的 WC557 ,
WC659 ,WC685 ,WC828的 I TS 序列(登录序列
号分别为 AY049131 , AY049135 , AY049136 ,
AY049138)用 Phylip 软件包进行系统发育分析 ,
选择 G.sordulenta 的 ITS 序列 (序 列号 为
AY049142)做为外类群 ,所得树状图如图 3 所
示。由图中可以看出 , WC367 、WC808 、1434 和
斯灰 GF10这 4个菌株为一个类群 ,明显区分于
其它 7个菌株 ,而斯灰 GF10 与其余 3 个又有明
显不同 ,这与酶切图谱显示的信息一致 。
2.3 SRAP分析
　　应用 SRAP 引物对 25个灰树花品种的子实
体 DNA 进行了扩增 ,其中 47对引物的扩增产物
有明显清晰的条带 ,每对引物的扩增条带数目为
3条到 15条 ,对清晰可辩的条带进行统计 ,多态
性条带数目为 138条。
将多态性条带统计后用 N TSYS 软件进行聚
类分析 ,构建树状图。
7
食　用　菌　学　报 第 16 卷8
第 3 期 张美彦 , 等:ITS-RFLP及 SRAP标记在灰树花种质评价中的应用
　　从聚类分析的结果可以看出 , 本实验中 25
个菌株在相似度约为 77%的水平上分为三大类 ,
其中来自斯洛文尼亚的斯灰 GF10自成一类 ,来
自美国的 WC367 、WC808以及上海农科院食用
菌研究所的1434归为第二大类 ,这 3个菌株在相
似度为 92%的水平上又按照菌株来源分为两类 。
其余的 21 个菌株归为第三大类 , 其中 WC557 、
1412 、1419 、WC659 、WC922 、1408可以被单独区
分出来 ,而其余的 15个菌株相似度为 100%,表
明其遗传基础极为相似 。
3　讨论
　　由于我国栽培灰树花的时间不长和灰树花
子实体形态易受环境影响多变等原因 ,传统上用
于其它食用菌如香菇等依据形态等指标进行菌
株分类的技术方案尚远不成熟 ,因此分子生物学
的鉴定对于灰树花这种食用菌具有特殊的重要
意义 。本实验中应用了 ITS-RFLP 以及 SRA P
两种方法对灰树花菌株进行种质评价。其中两
个限制性内切酶对 I TS 产物的酶切图谱将 25个
菌株分为三类 , 斯灰 GF10 为一类 , WC367 ,
WC808以及 1434 为一类 ,其余为第三类 。取这
三类中的代表性菌株进行测序 ,序列中限制性酶
切位点的分布将其分为三类 ,与电泳结果相同 ,
用 ClustalW对序列进行比对 ,构建的树状图也
将其分为三类 。这说明 ITS-RFLP 可以对灰树
花菌株进行大致的划分 。对于此类研究 ,可以充
分利用已经有的研究结果 ,先从网上获得已知灰
树花菌株的 ITS 长度及序列 ,进行内切酶种类的
筛选 。然后有目的选择内切酶进行酶切 ,这样可
以最大程度的提高研究工作的效率 ,避免盲目
性。实验中应用 SRAP 引物对灰树花菌株进行
了扩增 ,结果显示 , 25 个灰树花菌株大致分为三
类 ,且分类结果与 I TS-RFLP 的结果是一致的 。
在由 21个菌株组成的第三类中 , 1412 ,1419以及
WC557之间差异相对较大 ,WC659 ,WC922以及
1408相似度较高 ,亲缘关系较近 。其余 15个菌
株目前为止尚未找到差异性条带 ,需要进一步用
更多的引物或者更多的手段区分 ,但是由目前的
结果也可以看出 ,这 15个菌株之间的亲缘关系
比较近 ,可能存在同种异名的现象 。另外 ,部分
菌株存在特异的 SRAP 条带 ,可以尝试将这些条
带转化为更为稳定的 SCAR标记 ,提供鉴定菌株
更为便捷而有效的途径 。
致谢:感谢美国宾夕法尼亚州立大 学
DANIEL J.ROYSE 教授提供菌株资源 。
参考文献
[ 1] 郑和斌 , 李晓宇 , 吕作舟 , 等.阿魏菇 、白灵菇及杏鲍
菇亲缘关系的研究[ J] .食用菌学报 , 2005 , 12(4):
1-4.
[ 2] 付立忠 , 李海波 , 魏海龙 , 等.四个红菇科菌株的
rDNA ITS 序列分析和系统发育研究[ J] .食用菌学
报 , 2007 , 14(2):23-28.
[ 3] SH EN Q , GEISER DM , ROYSE DJ.Molecular
phylog enetic analy sis of Gri fola f rondosa (maitake)
reveals a species par titio n sepa rating eastern No rth
American and Asian iso lates[ J] .Mycolog ia , 2002 ,
94:472-482.
[ 4] 许美燕 , 唐传红 ,张劲松 , 等.利用 S RAP 和 ISSR 建
立快速鉴定灵芝属菌株的 SCAR 标记[ J] .菌物学
报 , 2008 , 27(5):707-717.
[ 5] SUN SJ , GAO W , LIN SQ , et al.Ana ly sis of
g ene tic diversity in Ganoderma population w ith a
novel mo lecular marker SRAP [ J] .Appl M ic robio l
Bio technol , 2006 , 72:537-543.
[ 6] 付立忠 , 魏海龙 ,李海波 , 等.香菇 SRAP扩增体系的
建立与优化[ J] .食用菌学报 , 2006 , 13(4):10-15.
[ 7] 曲绍轩 , 高　山 , 黄晨阳.S RAP 、ISS R和 RAPD 分
子标记技术在银耳菌株鉴别上的应用[ J] .食用菌学
报 , 2007 , 14(3):1-5.
[ 8] 李翠翠 , 郭立忠 ,卢伟东 , 等.RAPD 和 S RAP 分子标
记在真姬菇菌种鉴定中的应用[ J] .食用菌学报 ,
2009 , 16(1):21-25.
[ 9] 蔡令仪.灰树花培养料配方筛选与菌株品比试验初
报[ J] .食用菌学报 , 2001 , 8(4):43-46.
[ 10] 张　红 ,秦莲花 , 谭 琦 ,等.用改进的 CTAB 法提取
香菇基因组 DNA[ J] .上海大学学报(自然科学版),
2006 , 12(5):547-550.
[ 11] 林忠旭 ,张献龙 , 聂以春 , 等.棉花 SRAP 遗传连锁
图构建[ J] .科学通报 , 2003 , 48(15):1676-1679.
[本文编辑] 　朱丽娜
9
食　用　菌　学　报 第 16 卷
Evaluat ion of Grifola frondosa Germplasm Using
I TS-RFLP and SRAP Markers
ZHANG Meiyan , SHANG Xiaodong , LI Yu , GUO Qian , CHEN Mingjie , TAN Qi＊
(Key Laboratory of Applied Mycologic al Resources and Utilization , Ministr y of Agr icultur e;Shanghai Resear ch
Center for Edible Fungi Biotechnology and Engineer ing;Shanghai Key Laboratory of Agricultur al Genetics and
Breeding;Inst itute of Edible Fungi , Shangha i Academy of Agricultur al Sciences , Shangh ai 201106 , China)
Abstract:Genom ic DNA samples prepar ed from f ruit bodies of 25 Grifola frondosa str ains were amplif ied
with ITS (internal transcribed space r)pr imers.Although the PCR reaction products exhibited identical
electr ophoresis patte rns , hydrolysis using a r ange of restr iction endonucle ases r evealed that the ITS bands
contained dif fer ent r estr iction enzyme cutting sites and could be separ ated into thr ee broad groups based on
the sequences of the hydrolytic produc ts.SRAP amplification employing 47 SRAP (sequence r elated
amplif ied polymorph ism)primer pairs gene ra ted 138 polymorphic bands.A phylogram constructed using the
SRAP data eff ectively dif fer entiated ten stra ins whereas no obvious dif fe rences were de te cted between the
remaining 15 str ains.Our data implied that ITS-RFLP and SRAP markers we re e ff ective in G .frondosa
str ain identif ica tion and germplasm evaluation.
Key words:Grifola frondosa ;sequence rela ted amplif ied polymorphism(SRAP);internal tr anscribed spacer
(ITS);germplasm evaluation
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