全 文 ：改构的野生革耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定
杨建强!刘刚!汤国营!戴红梅!朱厚础
军事医学科学院 生物工程研究所!北京 !#!
!摘要 在野生革耳漆酶的 $%&’ 序列 ()端添加 !* 个核苷酸后得到突变基因 !# 将其克隆入表达载体 +,-./!’!重组质
粒 +,-./!’ 0 1$$2 经 $%&线性化!电击转化毕赤酵母 34(( 细胞 经过菌落 ,.5 鉴定的转化子 +,-./!’ 6 1$$2434(( 在甲
醇诱导后分泌表达活性重组漆酶 7..2!比未添加该段序列的野生革耳漆酶基因 ! 在毕赤酵母中表达的活性提高 8 倍多
其培养液上清经凝胶过滤层析和离子交换层析后!得到了电泳纯的漆酶蛋白!以 ’92: 为底物在 +;<=* 时测得比活为 (=>?
@ 6 AB 根据 :%:4,’CD 测定的重组漆酶 7..2 的表观相对分子质量为 >8 >
!关键词# 野生革耳菌$漆酶$改构$表达$毕赤酵母
!中图分类号 E#?> !文献标识码 ’
!#$%&&’() *+, -.$/01230(+ (/ 34% 5(,0/067 86+6 (/ 9*::2&6
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MTLA $-.5? @5A,-P QFR HNKF $1LFKR IFHL HNK KW+TKGGILF XK$HLT +,-./!’= 2NK TK$LAVIFQFH +1QGAIR +,-./!’ 6 1$$2 1IFKQTIYKR
ZIHN $%& ZQG HTQFGMKTTKR IFHL $,>,- B-?C6@,? 34(( VO K1K$HTL+LTQHILF AKHNLR= ’MHKT RITK$H ,.5 G$TKKFIFBP HNK HTQFGMLT[
AQFH +,-./!’ 6 1$$2434(( ZKTK $J1HJTKR IF 1I\JIR AKRIJA QFR GK$TKHKR Q$HIXK 7..2 QMHKT AKHNQFL1 IFRJ$HILF= 2NK Q$HIXI[
HO LM 7..2 ZNI$N KF$LRKR BKFK NQR VKKF ALRIMIKR ZQG HZL HIAKG NIBNKT HNQF HNQH ZNI$N KF$LRKR BKFK NQR JFALRIMIKR=
2NK TK$LAVIFQFH 7..2 ZQG +JTIMIKR HL K1K$HTL+NLTKHI$ NLALBKFKIHO VO GK\JKFHIQ1 GHK+G LM BK1 MI1HTQHILF QFR ILF4KW$NQFBK
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漆酶 !1Q$$QGK 又称苯二醇 _氧氧化还原酶
!D.!‘!=(=8#是一类含铜的多酚氧化酶$ 它最早发现
于日本紫胶漆树!D>5? E&@.,,F&@-的渗出物中#后来证
明亦广泛存在于真菌中# 近年来也发现存在于细菌菌
株中$但自然界中主要生产者还是白腐菌$真菌漆酶参
与真菌的多种生物学过程#与孢子生成%菌索形成%色
素产生等相关a!b$ 由于漆酶对芳香化合物具有聚合或解
聚的催化特性# 特别是能够转化或降解木素及其类似
物#使它在生物制浆%生物漂白%废水处理%芳香化合物
脱毒乃至选择性生物整治和区域性生物转化等方面具
有重要的应用价值和开发潜力$
巴斯德毕赤酵母具有高表达%高稳定%高分泌和可
对表达蛋白进行加工和翻译后修饰!如糖基化%二硫键
形成等等优点$ 近年来#已有一些不同来源的真菌漆
酶基因在毕赤酵母中被表达#如 #@-%&C&? E&@?,6!6@ 漆
酶 a8P(b#$7.6B6@5? ,..-G-@,5.? 漆酶 a-H5漆酶a*b及 I6%& !,1.6?5?漆酶a>b等$
野生革耳!$-.5? @5A,?是新发现的一种能生产漆
酶的真菌#该菌所产的漆酶系组成型漆酶#具有较高的
酶活和较好的热稳定性# 因而具有良好的研究价值和
开发潜力$ 最近的研究表明#野生革耳漆酶在毕赤酵母
中重组表达时产物的活性较低a#b$ 我们通过对野生革耳
漆酶的 $%&’ 序列进行改造# 获得了重组野生革耳漆
酶酶活有所提高的突变体$
! 材料与方法
!=! 材料
带有漆酶基因 ! 的质粒 +S%!?2 6 1$$ 由中国科学院生物物
理研究所龚为民研究员惠赠$大肠杆菌 %;*Q 感受态购自北京鼎
国公司$ 毕赤酵母 34(( 和载体 +,-./!’ 均为本室保存$
常用限制性内切酶%%&’ 聚合酶和 2< %&’ 连接酶为宝生
物公司产品$$%&为 &KZ DFB1QFR 9IL1QVG 产品$’92:&8)#84QYI
文章编号：!c48d8*e(f8**f< 研究报告
!收稿日期 8*f!f8c
!作者简介 杨建强!!c#(f #男#博士研究生#!电话!f>>c生 物 技 术 通 讯
7D22D5: -& 9-g2D.;&g7gCh iL1‘!> &L‘( SQOP 8* !
生 物 技 术 通 讯
!##$% &’ (&)#*+’)!),- ./0123 ’/14 5678 9::;
?@!4ABCD70=B6/0>H 6H>I# 和抗生素 JB/H><#5
分别购自 &CL/MB< 和 %>MN6 公司$ 质粒提取试剂盒和琼脂糖凝
胶回收试剂盒为 OL/NBM6 公司产品$ 分离纯化用层析介质为
OD6LN6H>6 公司产品$ (>/P0/4::: 发酵罐为 ’BQ (LFHR %H>S
BG>H公司产品$
!T% 低盐 !(%-OU%-OU%%(5,-%(55- 培养基的配制&见
&CL/MB< 6?7%B0BHC#5 !#$% VWLB??>/< X>C 的使用说明指南 ’
基础盐培养基和 O#5Y微量元素的配方见文献Z[\$
Y19 重组表达质粒的构建
Y191Y 目的基因 &##’ 的改造及扩增 根据文献]^&Y:\所报道及
,B_HHB??>/< ’/1 _-‘4^44Y4a端添加编码 ; 个氨基酸残基的酵母
偏爱密码子!表 2$
设计扩增引物如下 (&((’AP(;aAb*,*#*,_,____,_,*,
_#*,,,**,,#,_*A4a& 引入了 )$*!酶切位点 ’&((+A$(;cA
,b#b#_,_##_##,,#b,#b_,,_,_,_,,,b,#b,b_,,#,,,
A4a& 其中划线部分核苷酸序列为编码 ; 个氨基酸的酵母偏爱密
码子&并引入了终止密码子和 ,-.!酶切位点$
以重组质粒 W5UY[# d 0HH 为模板&O*$ 扩增条件均为(^‘e
热变性 ; N>< 后& 按 ^‘e 4: ?%3Ye 4: ?%f9e ^: ? 条件进行
4: 个循环&最后 f9e延伸 ; N><$ 获得的 Ob$ 产物称为 &((+$
Y1919 重组质粒 WO&bJ_ d 0HH# 的构建 目的基因 &((+ 的扩增
产物回收纯化后&用 )$*!和 )-.!双酶切&再回收&与经同样双
酶切的表达载体 WO&bJ_ 连接&转化大肠杆菌 U+;6 感受态$ 涂
布于含 9; NM d N! 的 JB/H><#5抗性的低盐 !T 平板上&4fe培养
Y3 D 后&挑单克隆培养提取质粒进行酶切鉴定后测序$重组质粒
WO&bJ_ d 0HH# 的构建如图 Y$
Y1914 重组转化子 WO&bJ_ d 0HH#AgA44 的获得及菌落 Ob$ 鉴
定 参照 &CL/MB< 6?7%B0BHCB#5 /($. VWLB??>/< X>C 的使用
指南& 制备酵母 gA44 感受态细胞$ 提取 WO&bJ_ d 0HH# 重组质
粒&以 /01!酶切线性化后胶回收$ 将 [: #!酵母 gA44 感受态
细胞和 Y: #! 线性化重组质粒 WO&bJ_ d 0HH# 混合&置于预冷的
电极杯中&9 ::: . 条件下电击 ‘1Y N?& 立即加入 Y N! 冰预冷
的 Y N/0 d !山梨醇&混匀后静置于 4:e温箱中&Yh9 D 左右取出&
转到加有 Y N! -OU 培养基的试管中&4:e 9:: L d N>< 培养 9h4
D$取 ‘:: #! 左右涂布预热的 -OU%!含 Y:: NM d N! JB/H><#5平
板&4:e培养 43 D 左右有单菌落长出$
挑单克隆转化子& 重悬于 Y: N! 无菌水中& 加入 ; N! ;
i dN! 的溶细胞酶&4:e温育 Y: N><&浸入液氮中放置 Y N><$ 取
; N! 细胞裂解液作为模板& 以 &((’AP 和 &((’A$ 为扩增目的基
因的引物$ Ob$ 反应条件见上述$
Yj4 重组漆酶的诱导表达
Yj4jY 重组漆酶 !bb# 在摇瓶中的诱导表达 转化子 WO&bJ_ d
0HH#AgA44 接种于 9; N! (5,- 培养基中&4:e%9:: L d N>< 培
养 Y[ D&将培养液于 Y ;:: L d N>< 离心 ; N>< 收获菌体&重悬菌
体于 9; N! (55-!含 :j4 NN/0 d ! bF%)‘液体培养基中&使其
起始 23::< 培养&每 9‘ D 补加甲醇至
终浓度为 :j;k&同时取样检测培养液中的生物量和漆酶活性&并
向培养基中加入一定量的缓冲液以保持培养基的 W+ 值$用转化
子 WO&*J_ d gA44 作为对照$
Y1419 重组漆酶 !**# 在 ; ! 发酵罐上的发酵培养 在发酵罐
中装入 91; ! 基础盐培养基&高压灭菌$ 将罐温控制到 4:e&用
氨水调节培养基的 W+ 至 ;1:$ 按 ‘k的接种量接种 Y:: N! 转化
子 WO&*J_ d 0HH#AgA44 培养液于发酵罐中&并加入 YY N! O#5Y
微量元素成分及适量生物素$ 第一相培养约 9‘ D 后溶氧出现反
跳&说明基础盐中的限制性碳源甘油成分已耗尽$ 此时补加 ;:k
的甘油$ 每升 ;:k的甘油中预加 Y9 N! O#5Y微量元素成分及
适量生物素$当 23::先用每升添加含 Y9 N! O#5Y 微量元素成分及适量生物素的
Y::k甲醇&以 :13 N! d N>< 的流速诱导 Yh9 D 使溶氧下降至一恒
定值&然后加大流量使溶氧保持在 9:k以上$
Y1‘ 漆酶酶活测定
以 _T#% 为底物&测定反应前 4 N>< 内反应液在 ‘9: 吸光度值的增加 $ 反应液包括 ;: NN/0 d ! 乙酸钠缓冲液
!W+‘1;%9 NN/0 d ! _T#%$ 一个酶活单位!i是指在上述条件
下 & 反应体系中每分钟催化 Y NN/0 _T#% 氧化所需的酶量 $
_T#% 在 ‘9: Y1; 重组漆酶 !**# 的纯化
发酵液经 ‘e离心 !3 ::: L d N><&9: N><弃沉淀 &上清用
:1‘; NN 微孔滤膜过滤后准备上样$
%FWBLIBV 9:: 柱层析!91: HN l [m HN(层析柱用平衡液
和洗脱液均为 mjm; N/0 n ! 的磷酸盐缓冲液 !W+fjm& 流速为 9
N! nN><$ 收集合并有酶活的组分$
U_A%BWD6L/?B PP 柱层析 !Y HN l Y4 HN( 层析柱用
mjm; N/0 n ! 磷酸盐缓冲液!W+fjm平衡&用相同缓冲液进行梯度
!’6b0 浓度为 mhYjm N/0 n !洗脱&流速为 9 N ! nN><$ 收集合并
有酶活的组分$
b5A%BWD6L/?B PP 柱层析!Y HN l 99 HN(层析柱用 mjm;
N/0 n !柠檬酸A磷酸氢二钠缓冲液!W+4jm平衡&用相同缓冲液进
行梯度!’6b0 浓度为 mhYjm N/0 n !洗脱&流速为 9 N! n N><$收集
漆酶 序列比对
/.345 6475
8.57*09(1:1 O5Y
;.6.5045 416(*<$&45
=43.&. :6*>
P_..5_,&’o#o__’O#OU_p’o!bO#bU_!AAAAA
P_..5_U&OU.__#’O.Oo_p%U!bO#-U_!%OUUo
P_..5_U&OU.__#’O.Oo_p%U!bO#-U_!%OUUo
P_..5_U&O.__#’O.Oo_p%U!bO#-U_!%OUUo
表 Y 野生革耳漆酶其他 4 种漆酶蛋白序列比对
图 Y 重组质粒 WO&bJ_ n 0HH# 的构建
!#
合并有酶活的组分!
! 结果
!# 改构的革耳漆酶基因 !#的 $%&扩增
扩增产物 !# 经琼脂糖电泳在约 ’ ()) *+ 处有
’ 条明显的扩增条带图 !#! 用 ,-. 回收试剂盒回收
该片段$经 $%&!和 ’()!双酶切$克隆至用相同酶切
的表达载体 +$/%0.$ 转化大肠杆菌感受态 ,1(2!
345培养 ’6 7 后$ 挑单克隆培养提质粒做酶切鉴定$
双酶切结果显示$有 ’条约 ’ ()) *+的片段图 3#!
!! 重组转化子 +$/%0. 8 9::;<=<33的 $%& 鉴定
将重组质粒 +$/%0. > 9::; 用 *+,!酶切线性化
后$ 通过电击转化毕赤酵母 =<33 菌株$ 在含有 ’?)
@A > @B 0CD:EF;G的 H$,I 平板 3?5培养 3 J 后有单菌
落出现!挑单克隆进行菌落 $%&鉴定$扩增得到目的条
带图 K#$证明野生革耳漆酶的重组表达质粒整合入酵
母基因组 ,-.中!
!L3 重组漆酶 B%%;在摇瓶中的活性表达
经菌落 $%& 鉴定的转化子 +$/%0. > 9::;<=<33
和 +$/%0. > =<33 对照在摇瓶中用 MGNH > MGGH 培
养基培养$ 在 !?5培养条件下经甲醇诱导 !K 7 后$转
化子 +$/%0. > 9::;<=<33 发酵液中出现漆酶活性$而
在 +$/%0. > =<33 对照的上清中未检测到漆酶活性$
同时在没有缓冲液的培养基中诱导表达相同的转化子
+$/%0. > 9::;<=<33 时表达上清中亦未检测到漆酶活
性! 在 MGNH > MGGH 中培养的转化子 +$/%0. > 9::;<
=<33 表达的漆酶活性在 !( J 时达到峰值$为 #O! P >
B! 由图 (可看出$在培养液 +1值保持不变的情况下$
随着培养时间的加长$酵母细胞的生物量逐渐增加$漆
酶的活性也逐渐增加! 但当 +1 值出现大的下降时$漆
酶活性也随之下降$说明培养基的 +1 值对漆酶活性有
较大影响!
!LK 重组漆酶 B%%;在发酵罐中的活性表达
整个发酵周期约持续了 6? 7$其中前 #Q 7 以甘油
为碳源在 3?5进行高密度培养! 至-6??F@为 #!? 开始以
甲醇为碳源在 !?5下进行诱导$诱导时间约 K! 7! 整
个发酵过程中 +1 控制在 (L? 左右$溶氧保持在 !?R以
上! 每 6 7取样 ’次$测定菌密度及表达产物漆酶的活
性$结果见图 6! 转化子 +$/%0. > 9::;<=<33 在发酵罐
中诱导培养 6 7即可检测到漆酶活性! 诱导培养 36 7
后达到峰值$为 ’(? P > B$之后活性开始下降! 而细胞
培养液浓度一直增加$在培养 6? 7后-6??F@达到了 (’4!
!L( 重组漆酶 B%%;的纯化与鉴定
粗 酶 液 经 过 IS+CTJCU !?? 分 子 筛 %,V.V <
IC+72TDWC XX 和 %G纯化的重组革耳漆酶 B%%;! I,I<$.NV分析表明约在
相对分子质量 (Q ??? 处有单一蛋白条带出现$与野生
革耳漆酶的相对分子质量相符图 4#!纯化的重组漆酶
B%%; 的活性通过 -2YEZC<$.NV 胶与 .M;I 的显色反
应进行检测$结果在胶上出现一条绿色条带图 Q#!
图 ! 扩增产物 !.的酶切鉴定图谱
G&,B!??? ,-.标准’#&$%&产物
图 3 重组质粒 +$/%0. > 9::; 的酶切鉴定图谱
G&,B!???[,B’(???’
’&*+,!单酶切’!&$%&! >$()!双酶切
图 K 转化子 +$/%0. > 9::;<=<33的菌落 $%&鉴定
G&,B!???[,B’(???’’$!&转化子 +$/%0. > 9::;<=<33
单克隆’3&转化子 +$/%0. >=<33 对照
图 ( 重组漆酶 B%%; 在摇瓶中的活性表达 图 6 重组漆酶 B%%; 在发酵罐中的活性表达
杨建强等&改构的野生革耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定 !#
生 物 技 术 通 讯
!##$% &’ (&)#*+’)!),- ./0123 ’/14 5678 9::;
4 讨论
真菌漆酶一般为 ;9:<;;= 个氨基酸残基的多肽序
列! 漆酶的成熟需经 ’端和 *端的加工以及糖基化过
程! ’端加工和糖基化过程可能与蛋白质分泌有关而
*端加工则可能对酶的活性有影响!*端加工位点突变
或 *端被截短都会影响漆酶的活性>??8?9@! 本研究利用基
因重组技术在野生革耳漆酶 * 端添加了 ?; 个氨基酸
残基得到该漆酶的一个突变体并在毕赤酵母中实现
了活性表达!表达产物的最大酶活#?A9 B C !$与未加此
段序列的野生革耳漆酶的活性#D4 B C !$>E@相比有了一
定的提高%上述结果表明野生革耳漆酶的 F端序列对
其活性有一定影响F 端加工位点突变或 F 端被截短
对漆酶的活性影响的可能原因是碱性氨基酸偏多的 F
端与活性中心相互作用阻碍了铜离子的结合而截短
的 F端影响了电子的传递!
培养基的 G+ 值是影响毕赤酵母细胞表达的外源
蛋白的重要因素! 毕赤酵母在无缓冲液的培养基中培
养时培养液的 G+值会逐渐下降! 控制和保持培养基
合适的 G+ 值对漆酶的活性表达很重要!以前的报道也
证明过低的 G+ 值对天然漆酶和重组漆酶的活性都会
产生不良影响>98H8?98?4@!其可能的原因一是漆酶对酸性蛋
白酶较敏感易被酸性蛋白酶降解当用蛋白酶突变型
&!!#$ 菌株 %5I??3D 表达漆酶时得到的表达产物活
性较高>9@’二是过低的 G+可能会使酶的空间结构改变
引起酶的活性丧失%在培养基中添加 =JDK的丙氨酸可
维持所需的 G+值 E L以上且表达的漆酶活性较高>4@%
本文所报道的结果表明通过每天补加一定量的 G+3J:
的磷酸缓冲液至 M55-培养基 可有效维持发酵液的
G+ 值但仍有波动影响了重组漆酶的活性% 而发酵罐
可较精确地控制发酵液 G+ 值保持恒定 则可降低 G+
值对重组漆酶活性的影响%
志谢! 本工作得到了中国科学院生物物理研究所龚为民研
究员安徽大学肖亚中教授和中国科技大学张敏李旭博士的热
情支持和帮助#特此致谢$
参考文献
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34]?EH
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表达>Z@J 中国科学技术大学学报8 9::H84Hj3k]E;E
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X^GP/‘UL NURUP/0/Y/OQ UeGPUQQX/S /W 06VV6QU XS /+,0+& !&)(-%+) >Z@J
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O06P VN6P6VRUPXi6RX/S /W 6 06VV6QU WP/^ <&%&)’+6) =6%,-!0+.6) >Z@J
dGG0 S‘XP/S 5XVP/\X/08 9===833j4m]A9;
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QRPOVROP60 6S607QXQ /W RNU 06VV6QU & YUSU WP/^ RNU SUb07 XQ/06RUL
0XYSXS/07RXV \6QXLX/^7VURU a52 jFF# 9AE2m>Z@J dGG0 S‘XP/S 5X[
VP/\X/08 2AA48;Aj29m]H29A
>22@ (O0RUP #8 d0V60LU 58 %XU\UP .8 ( &.2 TOSVRX/S60 UeGPUQQX/S /W 6
WOSY60 06VV6QU XS >&,,0&%-’4,) ,%*+)+& \7 LXPUVRUL U‘/0ORX/S>Z@J
dGG0 S‘XP/S 5XVP/\X/08 9==483A]ADE
>29@ ,U0/cGOoXV 58 gX^ ++8 (OR0XS ’,8 ( &.? 0UVRP/VNU^XV60 QROLXUQ
/W 6 RPOSV6RUL 06VV6QU GP/LOVUL XS /+,0+& !&)(-%+)>Z@J dGG0 S‘XP/S
5XVP/\X/08 2AAA83;];;2;
>24@ !6PQQ/S %8 FpQQ06SL a8Z/SQQ/S !ZJ IU‘U0/G^USR /W 6 >&,,0&%-’4,)
,%*+)+& QRP6XS bXRN USN6SVUL PUQXQR6SVU R/ GNUS/0XV WUP^USR6RX/S
XSNX\XR/PQ XS 0XYS/VU00O0/QU N7LP/07Q6RUQ \7 NURUP/0/Y/OQ UeGPUQQX/S
/W 06VV6QU>Z@J dGG0 S‘XP/S 5XVP/\X/08 9==283E]2234
图 E %I%cad,检测纯化后的漆酶 !FF#
29(纯化后的 !FF#样品’5(蛋白低分子量标准
图 D ’6RX‘Ucad, 检测漆酶 !FF# 活性
29(用 d(#d 检测的纯化 !FF#样品
!#