全 文 ：第32卷第4期 中　国　科　学　技　术　大　学　学　报 Vol.32 ,No.4
2 0 0 2年 8月 JOURNAL OF UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY OF CHINA Aug.2 0 0 2
文章编号:0253-2778(2002)04-0462-08
野生革耳菌组成型漆酶的
生成条件及性质研究
张　敏1 , 2 ,肖亚中2 ,王　芳1
张仁云2 ,刘　林2 ,龚为民1
(1.中国科学技术大学生命科学学院 ,中国科学院结构生物学开放实验室 ,安徽合肥 230026)
(2.安徽大学生命科学学院 ,安徽合肥 230031)
摘要:首次发现野生革耳菌(Panus rudis)在 39℃液体振荡培养条件下 ,不需诱导剂
的诱导 ,能持续产生漆酶.优化后培养基的碳氮源分别为 2%蔗糖和 26 mM酵母抽提
物 ,最高酶活达 1.6×104 U/L ,属于目前已知的组成型漆酶高产菌株.发酵液经硫酸
铵沉淀 ,DEAE-Sepharose ,Sephacryl S-200 ,Mono Q柱层析分离纯化后 ,可得电泳纯漆酶
蛋白.该酶为单体蛋白 ,分子量为 58 kDa.以愈创木酚为底物 ,该酶的最适作用 pH 为
4.5 ,最适反应温度为 50℃,Km 值为 0.21mM ,并表现出较好的热稳定性 ,具有良好的
基础研究和工业应用价值.
关键词:野生革耳菌;漆酶;产酶条件;酶学性质
中图分类号:Q936　　　文献标识码:A
0　引言
漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶 ,最早发现于漆树的分泌物中.后来发现漆
酶更广泛地存在于真菌尤其是担子菌中.漆酶与真菌的发育和形态发生过程相关 ,参与了孢
子的产生 、菌索和子实体的形成等[ 1-3] .
漆酶可氧化木素中的酚型单元形成苯氧自由基 ,从而导致木素相关结构的降解和转化.
在合适的氧化还原介体如 ABTS[ 2 ,2 -连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)] 、1-HBT(1-羟基苯
并三唑)存在时 ,漆酶还可催化氧化非酚型的木素模型化合物.同时 ,漆酶具有广泛的底物作
用范围 ,可催化多种酚类和芳香胺类化合物的氧化 ,降解多环芳烃[ 4] .因此 ,漆酶不仅在木素
的生物降解和制浆造纸中有重要应用前景 ,而且在废水处理 、生物漂白[ 5] 、环境污染物脱毒 、
土壤修复等方面也具有潜在的应用价值.由于真菌是自然界中漆酶的主要来源[ 6] ,因而有关
收稿日期:2001-11-06
　基金项目:中国科学院“百人计划” 、安徽省自然科学基金资助项目(98212411)和安徽省教育厅自然基金重点资助
项目(2000J1013)
　作者简介:张敏 ,女 , 1970年生 ,讲师 ,研究方向:生物化学和分子生物学.
真菌漆酶方面的研究受到人们越来越多的关注.
根据真菌漆酶生成方式的不同 ,可以将其分为诱导型和组成型两种.诱导型漆酶生成于
菌体次级生长阶段 ,酶活水平受某些特定化合物诱导 ,是真菌漆酶生成的主要方式.大多数
真菌漆酶均为诱导型 ,酶活水平易受营养条件和某些理化因素影响[ 7] .漆酶的诱导剂多为
酚类底物类似物 ,但不同菌株有各自产酶的最适诱导物.组成型漆酶在菌体初级生长阶段即
已生成 ,其生成量一般较少受诱导物影响 ,在工业生产应用中可能具有工艺简单和产酶稳定
的优点.Coll等曾报导担子菌PM1可在无诱导剂的条件下产漆酶[ 8] ,在培养基中添加没食子
酸 、甲苯胺 、愈创木酚 、藜芦醇等诱导剂 ,都不能明显增加漆酶的产量.J.Rogalski等报导过白
腐担子菌 Cerrena unicolor在非诱导培养基中的漆酶产量与Phelbia , Trametes , Pleurotus 在诱
导条件下的产酶量相当[ 9] .国内钞亚鹏等人也筛选到一株产组成型漆酶的担子菌
(Basidiomycete sp.)[ 2] .组成型漆酶的研究对深入了解其分子生物学特性 ,更好地进行工业
化生产应用 ,治理环境污染具有重要意义 ,但组成型漆酶的报导相对较少.为深入了解组成
型漆酶 ,我们从数十种真菌中筛选出一株产组成型漆酶的野生革耳菌(Panus rudis)进行研
究.本文首次发现野生革耳菌能在不加诱导剂的条件下较大量地产生漆酶 ,并就该菌在液体
振荡培养条件下漆酶的产生 、分离纯化及理化性质进行了研究.
1　材料与方法
1.1　实验材料和仪器
野生革耳菌 5.34(Panus rudis)来自中科院微生物研究所菌种保藏中心.蛋白纯化在
AKTA-FPLC(Amersham-Pharmacia)上进行.分光光度计为 UV-VIS TU-1800(北京普析通用仪器
有限公司).
斜面培养基为土豆综合培养基:20%土豆汁 1 000 mL ,葡萄糖 20 g ,MgSO4 1.5 g ,KH2PO4
3 g ,VB1 2 mg ,琼脂粉 15 g;
初始发酵培养基(/L):0.01 M HAc-NaAc 缓冲液(pH4.5), 葡萄糖 10 g , CaCl2 0.1 g ,
KH2PO4 2 g ,MgSO4 0.25 g ,酒石酸铵 0.5 g ,微量元素溶液 10 mL[ 10] ;
优化发酵培养基(/L):0.01 M HAc-NaAc(pH4.5)缓冲液 ,蔗糖 20 g ,CaCl2 0.1 g ,KH2PO4
2 g ,MgSO4 0.25 g ,酵母抽提物 4 g ,微量元素溶液 10 mL
1.2　培养方法
取保藏菌株斜面 ,挑取适当大小菌丝块接种于 150 mL 三角烧瓶中(内装 50ml初始发酵
培养基),于 28℃,150 rpm振荡培养 3天.培养物匀浆成菌悬液 ,按 15%接种量接入发酵培
养基中 ,进行扩大培养.检测漆酶活性时 ,取适量培养液于 4℃, 12 000 rpm 离心 20 min.上清
液适当稀释后用于酶活测定.
1.3　酶活测定
酶活测定采用愈创木酚法和ABTS法.愈创木酚法为:取 4 mL琥珀酸缓冲液(含 0.8 mM
愈创木酚)和 1 mL适当稀释的发酵上清液 ,混合均匀后于 25℃水浴反应 30 min ,测OD465值.
酶活单位定义为每分钟氧化 1μmol底物所需酶量.愈创木酚在 465 nm处的摩尔消光系数为
12 000 M-1cm-1[ 8] .ABTS法为:以 ABTS为底物 ,测定反应前 3 min内反应液在 420 nm处吸
光值的增加.定义每分钟氧化 1μmol ABTS所需的酶量为一个酶活单位.ABTS 在 420 nm 处
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的摩尔消光系数为 36 000M-1cm-1[ 11] .测量值取三次平行实验的平均值.
1.4　漆酶生成条件的优化
分别在 28℃和 39℃条件下 ,7种化合物(藜芦醇 、邻甲苯胺 、阿魏酸 、木质素 、香草酸 、香
兰素 、二苯胺)被用来诱导野生革耳菌漆酶的产生.其中木素终浓度为 1 g/L ,其余 6种化合
物终浓度为0.2 mM ,均在扩大培养 24 h后添加进培养基.选用7种不同碳源(葡萄糖 、蔗糖 、
纤维二糖 、乳糖 、麦芽糖 、甘油 、木糖)和 8种不同的氮源(甘氨酸 、组氨酸 、天冬酰胺 、酵母抽
提物 、胰蛋白胨 、酒石酸铵 、氯化铵 、硝酸铵),分别以不同浓度及其组合 ,考察漆酶的产生情
况.
1.5　酶蛋白的分离纯化
(1)硫酸铵沉淀:发酵物经八层纱布过滤 、5 000 rpm离心 20 min得到上清液用 100%饱
和硫酸铵于 4℃沉淀过夜 ,6 800 rpm离心 30 min ,弃上清 ,沉淀溶于 20 mM Tris-HCl(pH7.5)
缓冲液中.(2)DEAE-Sepharose FastFlow 柱层析(2 cm ×25 cm):层析柱用 0.02 M Tris-HCl
(pH7.5)平衡 ,用相同缓冲液进行梯度(NaCl浓度:0 M ～ 0.5 M)洗脱 ,流速为 2 mL/min.收集
合并有酶活部分 ,超滤浓缩;(3)HiPrep Sephacryl S-200柱层析(柱体积 120 mL):平衡液和洗
脱液均为 0.02M Tris-HCl(pH7.5),0.15 M NaCl ,流速 0.5 mL/min ,收集合并有酶活部分;
(4)Mono Q HR 5/5柱层析(柱体积1mL):0.02M Tris-HCl(pH7.5 ,含 0.05M NaCl)平衡 ,用相
同缓冲液梯度洗脱(NaCl浓度:0.05 M ～ 0.6 M),流速 1 mL/min ,收集酶活部分.280 nm 检
测.
酶的纯度用 SDS-PAGE电泳检测 ,分离胶浓度为 12%,取 10 μL 样品加 10μL 上样缓冲
液 ,沸水浴 3 min ～ 5 min ,上样电泳后用考马斯亮兰 R-250染色.
1.6　酶的性质研究
在25℃时测定蛋白在 pH2.0 ～ pH6.5琥珀酸缓冲液中的漆酶活力 ,以确定酶的最适反
应pH.根据最适 pH条件下酶在 20℃～ 75℃温度范围内的活力测定最适反应温度.分别在
45℃和 70℃下将纯酶溶液水浴保温不同时间后考查酶的热稳定性.以上反应均以愈创木酚
为底物.
用双倒数法测定该酶对愈创木酚的 Km 值 ,底物浓度为 0.1 mM ～ 0.8 mM.向反应体系
中加入10 mM 的不同离子 ,考察金属离子及硫酸根离子 、氯离子对酶活的影响.
2　结果和讨论
2.1　野生革耳菌漆酶的生成条件
野生革耳菌漆酶的产生期约 10天 ～ 12天 ,酶活峰值出现在第 4天和第 8天左右 ,且第
二个峰值大于第一个峰值.
2.1.1　温度及诱导剂对产酶的影响
结果表明(图 1),该菌在不加诱导剂的情况下 ,也可产生较大量的漆酶.各种常见的漆
酶诱导剂(除藜芦醇外)对野生革耳菌漆酶的产生无诱导作用 ,有的甚至有抑制作用 ,这可能
是由于芳香类小分子诱导剂大多具有一定毒性 ,影响菌体生长 ,由于生物量的减少 ,从而使
漆酶的产量也减少.由于漆酶在该菌中的产生不需诱导 ,可认为是组成型漆酶.实验结果还
表明野生革耳菌是一种高温型产酶菌 , 39℃比 28℃更利于漆酶的产生.
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2.1.2　碳 、氮源及其组合对产酶的影响
培养基中的碳 、氮源不同 ,对产酶的影响也不同.研究表明该菌株在 7种单一碳源的培
养基上都能产生漆酶 ,其中 1%的葡萄糖 , 2%的蔗糖和 2%的甘油较利于该菌漆酶的产生
(图 2).同时 ,有机氮优于无机氮 ,其中有效氮含量 26 mM的 酵母抽提物为氮源时的漆酶活
性最高.无机氮中以 2.6 mM酒石酸铵较利于漆酶的产生(图 3).通过考察了不同碳氮源组
合的产酶情况 ,发现以蔗糖和酵母抽提物为碳氮源时的漆酶活性最高(图 4).所以优化后培
养基的碳氮源分别为 2%蔗糖和有效氮含量为 26 mM酵母抽提物.优化后的酶活为 1.6×
104 U/L(ABTS 法),是初始酶活的 1.43倍.Coll等曾报导担子菌PM1可在无诱导剂的条件下
产漆酶[ 8] .在相同条件下与其相比 ,野生革耳菌组成型漆酶活性是担子菌 PM1的 2倍.与钞
亚鹏等人发现的一株产组成型漆酶的担子菌[ 2]相比 ,野生革耳菌组成型漆酶活性是其 6.6
倍.
1 、藜芦醇 , 2 、邻甲苯胺, 3 、阿魏酸 , 4、木质素 ,
5 、香草酸 , 6 、香兰素, 7 、二苯胺 , 8、无诱导剂
图 1　诱导剂和温度对产酶的影响
Fig.1　The effects of inducers and temperature
on the enzyme production
1 、葡萄糖 , 2、蔗糖 , 3 、纤维二糖 ,4 、乳糖 ,
5 、麦芽糖, 6 、甘油 , 7 、木糖
图 2　碳源对产酶的影响
Fig.2　The effects of C source on the
enzyme production
1 、甘氨酸 , 2 、组氨酸 , 3、天冬酰胺 , 4 、酵母抽提物 ,
5 、胰蛋白胨 , 6 、酒石酸铵 , 7 、氯化铵 , 8、硝酸铵
图 3　氮源对产酶的影响
Fig.3　The effects of N source on the
enzyme production
1 、1%葡萄糖+2.6mM酒石酸铵 , 2 、1%葡萄糖+26mM 酵
母抽提物 , 3 、2%甘油+2.6mM 酒石酸铵 , 4 、2%甘油+
26mM 酵母抽提物 , 5 、2%蔗糖+2.6mM酒石酸铵 , 6 、2%蔗
糖+26mM酵母抽提物
图 4　碳氮组合对产酶的影响
Fig.4　The effects of C source and N source
on the enzyme production
465第 4 期　　　　　　　　　　野生革耳菌组成型漆酶的生成条件及性质研究　　　　　　　　　　
2.2　酶蛋白的纯化
培养上清液经硫酸铵沉淀浓缩了约 100倍 ,沉淀溶解后呈深棕色.经 DEAE柱层析可除
图 5　野生革耳菌漆酶的
DEAE-Sepharose FastFlow 柱层析图
Fig.5　DEAE-Sepharose FastFlow chromatography
of Panus rudis laccase
去部分色素 ,漆酶活性存在于第一个透
过峰里(图 5).S-200柱层析后 ,色素全部
除去 ,漆酶活性存在于第三个峰里(图
6).Mono Q柱层析后 ,漆酶活性存在于第
二个峰里(图 7),经 SDS-PAGE 电泳检测
为一条带(图 8).每升培养液可得到纯化
的漆酶约 3 mg.
2.3　野生革耳菌漆酶的性质
野生革耳菌漆酶的分子量用 SDS-
PAGE 检测为 58kDa , 用 HiPrep Sephacryl
S-200分子筛柱层析测定约为 60 kDa.这
一结果表明该酶为单体蛋白.大多数真
菌漆酶都为单体蛋白 ,分子量在 50 kD ～
80 kD之间.但有一些例外 , 如 Podospora anserina 的漆酶 I 由四个亚基组成;Agaricus
bisporus 和 Trametes villosa 的漆酶有两个亚基组成[ 4] .
图 6　野生革耳菌漆酶的 HiPrep Sephacryl S-200 柱层析图
Fig.6　HiPrep Sephacryl S-200 chromatography of Panus rudis laccase
图 9表明以愈创木酚为底物 ,酶的最适反应 pH为 4.5 ,与大多数已经报道的漆酶类似.
酶的最适反应温度为 50℃(图 10).热稳定性研究表明(图 11),野生革耳菌漆酶在 70℃时的
半衰期为 10 min ,45℃时保温 50 min 酶的活性还保持 50%以上 ,并且在此之后基本保持稳
定.已报道的真菌漆酶多在 50℃以下稳定.只有两例真菌漆酶具有较高的热稳定性 ,一是来
自地中海雨林植物栎树(Quercus i lex L.)树叶的担子菌Marasmius Quercophi lus漆酶在 75℃
条件下半衰期为 10分钟[ 12] ;另一是分离自西班牙造纸厂废水未鉴定的担子菌 PM1漆酶[ 8] .
466　　　　　　　　　　　　　　　　中国科学技术大学学报　　　　　　　　　　　　　　第 32 卷
现已知道这两个漆酶的氨基酸序列同源性为 99%.野生革耳菌漆酶的热稳定性与之相当 ,
同属较高热稳定型漆酶.
以愈创木酚为底物 ,测得野生革耳菌漆酶的Km值为0.21 mM ,也与担子菌PM1[ 9]的Km
值(0.5 mM)接近.
图 7　野生革耳菌漆酶的Mono Q HR 5/5
柱层析图
Fig.7　Mono Q HR 5/5 chromatography of
Panus rudis laccase
图 8　纯化的野生革耳菌漆
酶 SDS 聚丙烯酰胺电泳图
Fig.8　SDS-PAGE of puri-
fied laccase from Panus rudis
图 9　酶的最适反应 pH
Fig.9　The optimal pH of the enzyme activity
图 10　酶的最适反应温度
Fig.10　The optimal temperature of the enzyme activity
绝大部分真菌漆酶均含多个铜离子.其 Ⅰ型铜离子在 600 nm 有明显吸收峰 ,而其 Ⅱ型
铜离子在 340 nm 有吸收.紫外光谱扫描表明野生革耳菌漆酶具有以上特征 ,可推断其也含
有Ⅰ型和 Ⅱ型铜离子.
EDTA作为金属鏊合剂常常可去除蛋白中的金属离子从而使蛋白失活.为考查 EDTA对
野生革耳菌漆酶的影响 ,我们测定了不同EDTA浓度下的漆酶活性.实验表明 ,20 mM的 ED-
TA条件下该酶仍可保持 84%的活性 ,而这时 EDTA与酶的摩尔比超过 1 000.EDTA的弱抑
制作用在其它真菌漆酶中也有类似报导[ 4 ,9 ,13 ,14] .在实验中还发现 ,不同的金属离子及硫酸
根离子对野生革耳菌漆酶的活性没有明显影响 ,而氯离子对酶活有显著的抑制作用(图
12),10 mM氯离子使野生革耳菌漆酶的活性下降 50%左右.值得注意的是不同的真菌漆酶
受氯离子抑制的程度显著不同.在 Botryosphaeria sp.中可纯化出两种漆酶 PRO-Ⅰ和 PRO-
467第 4 期　　　　　　　　　　野生革耳菌组成型漆酶的生成条件及性质研究　　　　　　　　　　
Ⅱ[ 15] ,其中 PRO-Ⅰ受氯离子的强烈抑制 ,10 mM氯离子使 PRO-Ⅰ活性下降 80%,而 PRO-Ⅱ
在10 mM氯离子中的漆酶活性仅下降 10%.氯离子抑制漆酶活性的原因尚有待于进一步研
究.
图 11　酶的热稳定性
Fig.11　The enzyme thermostability
1.无金属离子加入 , 2.ZnSO4 , 3.(NH4)2SO4 , 4.Cu SO4 , 5.Ni2 SO4 , 6.Li2 SO4 ,
7.NaCl , 8.KCl , 9.CuCl2 , 10.CaCl2 , 11.CoCl2 ,12.MnCl2 , 13.MgCl2
图 12　不同离子对漆酶活性的影响
Fig.12　The effects of ions on enzyme activity
参 考 文 献
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Production and Enzyme Activities of Constitutive Laccase
from Panus rudis
ZHANG Min1 , 2 , XIAO Ya-zhong2 , WANG Fang1
ZHANG Ren-yun2 , LIU Lin2 , GONG Wei-min1
(1.School of Life Sciences , USTC , Hefei 230026 , P.R.China)
(2.School of Life Science , Anhui University , Hefei 230039, P.R.China)
Abstract:The laccase of Panus rudis was produced constitutively in shaking flask culture without in-
duction.The optimum carbon source and nitrogen source were 2%sucrose and 26mM yeast extract re-
spectively .The maximum enzyme activity obtained was 1.6×104U/L.The enzyme was purified to ho-
mogeneity by ammonium sulphate precipitation , DEAE-Sephrose , Sephacryl S-200 and Mono Q chro-
matography.The enzyme is a monomer with the molecular mass of 58kDa on SDS-PAGE.With guaia-
col as the substrate , the enzyme optimal pH is 4.5 , the optimal temperature is 50°C , and the Km is
0.21mM.Panus rudis laccase show good thermostability and is valuable for further studies on laccase
catalytic mechanisms and industry applications.
Key words:Panus rudis;Laccase;conditions for enzyme production;enzymatic property
469第 4 期　　　　　　　　　　野生革耳菌组成型漆酶的生成条件及性质研究