全 文 ：植物生态学报 2013, 37 (8): 750–757 doi: 10.3724/SP.J.1258.2013.00078
Chinese Journal of Plant Ecology http://www.plant-ecology.com
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收稿日期Received: 2013-02-05 接受日期Accepted: 2013-05-15
* E-mail: sxz_li@126.com
应用磷脂脂肪酸和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶
电泳分析技术研究湿地植物根际微生物群落多样性
王爱丽*
德州学院化学与化工学院, 山东德州 253023
摘 要 以天津大学校内两个相邻的小型湖泊(青年湖和爱晚湖)为研究区域, 通过采样分析, 利用磷脂脂肪酸(PLFA)和聚合
酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析技术, 研究了湿地植物种类(芦苇(Phragmites australis)和东方香蒲(Typha
orientalis))和生长方式(单生和混生)对根际微生物生物量和群落结构的影响。PLFA分析结果表明, 植物根际微生物生物量大
于非根际(爱晚湖芦苇除外); 植物种间的差异较大, 东方香蒲根际沉积物中微生物生物量大于芦苇根际; 种内根际微生物受
植物的生长状况影响较大, 采样期间两个湖泊中东方香蒲的生长状况(株高)相似, 根际微生物生物量相差不大, 而爱晚湖芦
苇由于与东方香蒲共生, 受到东方香蒲的抑制, 使得根际微生物生物量明显低于单独生长的芦苇; 革兰氏阳性细菌数量小于
革兰氏阴性细菌的数量, 且根际的革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的比值小于非根际。沉积物中的细菌群落结构主要与植
物种类有关, 同一种植物的根际细菌群落结构差异较小(这些根际细菌聚为一类); 不同植物的根际细菌群落结构差异较大。
关键词 变性梯度凝胶电泳, 微生物多样性, 磷脂脂肪酸, 植物根际, 湿地
Microbial community diversity in the rhizosphere of wetland plants examined by phosphol-
ipid fatty acid and polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis
WANG Ai-Li*
College of Chemistry and Chemical Engineering, Dezhou University, Dezhou, Shandong 253023, China
Abstract
Aims Our objective was to investigate the effect of plant growth pattern (single or mixed) of two emergent
plants (i.e., Phragmites australis and Typha orientalis) on the microbial biomass and community structure of the
rhizosphere in two adjacent shallow lakes in Tianjin, China.
Methods The microbial biomass and community structure were assayed by using phospholipid fatty acid
(PLFA) and polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) techniques. Cluster
analysis of the microbial PLFA profiles was performed using hierarchical clustering according to the
between-groups linkage method using the software package SPSS 13.0 for Windows.
Important findings The PLFA results showed that microbial biomass in the plant rhizosphere was higher than
those in the non-rhizosphere, except for the P. australis rhizosphere in Aiwan Lake. The microbial biomass was
significantly higher in the T. orientalis rhizosphere sediments than that in the P. australis rhizosphere sediments in
both lakes. The microbial biomass of the same plant’s rhizosphere was influenced by pattern of plant growth (sin-
gle or mixed). As the growth condition (plant height) was similar in the two lakes, there was only minor difference
in the microbial biomass of the T. orientalis rhizosphere. When the two plants grew together, the growth of P. aus-
tralis was significantly inhibited, and significantly lower microbial biomass was assayed than that under the sepa-
rated growing condition. The gram-positive bacteria (G+) were less than that of the gram-negative bacteria (G–) in
all samples. Moreover, the ratio of G+ to G– in the plant rhizosphere was less than in the non-rhizosphere. Micro-
bial community structure was found to be related to the plant species. Little difference in microbial community
structure was observed in same plant rhizosphere sediments between the two lakes; however, apparent differences
in the bacterial community were detected between the two different plant species.
Key words denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), microbial diversity, phospholipid fatty acid
(PLFA), plant rhizosphere, wetland
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由于湿地植物具有发达的根系, 可利用其根
际修复受污染的水体和沉积物。许多研究表明湿
地植物可去除富营养化水体中的氮磷营养盐(赵
旭光, 2011; 徐秀玲等, 2012), 湿地植物的根可富
集沉积物中的有机污染物 (Miglioranza et al.,
2004; Liu et al., 2006)。也有研究表明湿地植物根
际微生物能明显地促进有机污染物的降解
(Tawney et al., 2008; Toyama et al., 2009)。因此,
湿地微生物的群落结构及其多样性对污染物的处
理效率和生态系统的稳定性至关重要(Hallberg &
Johnson, 2005; Sirivedhim & Gray, 2006)。目前,
国内外的研究大多集中在人工湿地对有机污染物
和营养元素去除效果方面, 而对于湿地中微生物
种群结构的研究报道较少(Ruiz-Rueda et al., 2009;
Dong & Reddy, 2010; Li et al., 2010)。了解微生物
群落结构及其多样性和动态性等信息, 对研究污
染物降解和转化途径具有重要的学术价值。
芦苇(Phragmites australis)和东方香蒲(Typha
orientalis)是两种典型的湿地植物, 遍布于世界各
地, 生长在灌溉沟渠旁、河堤沼泽地等, 它们是人
工湿地和河岸缓冲带常用的植物(Haberl et al.,
2003)。在自然生态系统, 芦苇和东方香蒲通常独
自生长或共生。近年来, 通常采用混合植物群落
修复受污染的水体(李睿华等, 2006)。
青年湖和爱晚湖是天津大学校内的两个相邻
的小型湖泊, 两个湖中均生长着大量的挺水植物
芦苇和东方香蒲, 湖中的主要污染物为氮磷营养
盐和酞酸酯类化合物(PAEs)。本文以芦苇和东方
香蒲为研究对象, 分析和比较了两个湖中挺水植
物种类和生长方式对植物根际微生物群落结构和
多样性的影响, 以期为水体和沉积物中污染物的
植物修复提供数据支持。为保证结果的可靠性 ,
本研究采用磷脂脂肪酸 (PLFA)和聚合酶链式反
应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)两种技术相结
合的方法。
1 材料和方法
1.1 样品采集
样地位于天津大学校内的两个相邻的小型湖
泊——青年湖和爱晚湖, 两个湖中均生长着大量
的挺水植物芦苇和东方香蒲。青年湖中东方香蒲
和芦苇各自形成单一优势群落(即单生); 爱晚湖
中东方香蒲和芦苇交错生长(即混生), 其中东方
香蒲生长情况与青年湖相似, 而芦苇生长受到明
显抑制, 平均株高约为青年湖芦苇的1/2。于2010
年5月18日在两个湖中采集芦苇和东方香蒲的根、
根际和非根际沉积物。根际沉积物采用抖根法采
集, 具体做法是将根上大量的沉积物抖掉, 附着
在根表面且不脱落的沉积物作为根际沉积物。青
年湖中设3个采样区(芦苇区、东方香蒲区、无植
物区), 爱晚湖中选取两个采样区(芦苇和东方香
蒲混生区、无植物区)。在每个采样区内每种样品
(即东方香蒲和芦苇根及根际沉积物、非根际沉积
物)采用五点取样法取样, 按梅花形取5个样方(50
cm × 50 cm)。采集的样品(沉积物)装在干净密封
的聚四氟乙烯塑料袋中, 于0–4 ℃下保存并及时
送回实验室 , 等量混合后最终成为一个样品(杨
瑞, 2011; 迟杰等, 2012)。沉积物样品分为两份:
一份真空冷冻干燥后, 用于PLFA分析; 另一份于
–20 ℃冰箱保存, 用于PCR-DGGE分析。
1.2 磷脂脂肪酸的提取、测定和分析
采用Xue等(2008)改进的方法提取磷脂脂肪
酸, 以十九烷脂肪酸甲酯C19:0为内标。PLFA提
取液用气质联用仪(6890 N/5975 C, Agilent, Santa
Clara, USA)测定(配石英毛细管柱HP-5MS)。升温
程序为: 初始温度80 ℃, 以30 ℃·min–1升到150
℃ , 再从3 ℃ ·min–1升至230 ℃ , 保持1 min, 再
从10 ℃·min–1升至280 ℃, 保持2 min。载气He,
流量1.0 mL·min–1, 不分流进样, 进样量1 µL, 进
样口和检测器温度均为250 ℃, 接口温度280 ℃,
EI源70 eV。用i15:0、a15:0、i16:0、i17:0和a17:0
估算革兰氏阳性细菌含量 , 用cy17:0、cy19:0、
16:1ω7、16:1ω9、18:1ω7和18:1ω9估算革兰氏阴
性细菌含量, 两者之比可代表革兰氏阳性细菌和
革兰氏阴性细菌生物量的比值 , 用15:0、17:0、
G+和G–估算细菌生物量, 用所有脂肪酸总和估算
微生物生物量 , 用 18:2ω6,9 估算真菌生物量
(Zelles, 1997; Xue et al., 2008)。
根据所测得的PLFA数据计算多样性指数
(H):
1
ln
s
i
H pi pi
=
= −∑
式中, pi为样品中某一种PLFA的摩尔百分含量; S
为某一土壤样品中所有PLFA种类数。
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使用SPSS (version 13.0)对不同样品的PLFAs
数据进行聚类分析 , 聚类方法为分层聚类分析 ,
采用组间平均距离法。
1.3 DNA的提取及PCR扩增
采用Omega公司土壤试剂盒提取沉积物样品
中的总DNA。以提取到的DNA作为模板, 采用对
大多数细菌的16S rRNA基因V6–V8区具有特异
性 的 引 物 对 EUBf933 和 EUBr1387 进 行 扩 增 ,
EUBf933的5′端连接一个40 bp富含GC的序列, 扩
增产物片段长约430 bp (Iwamoto et al., 2000)。50
µL反应体系组成为: 10–100 ng模板(5 µL), 25 µL
Taq酶mix (包括buffer、dNTPs), 0.5 µmol·L–1每种
引物(0.5 µL), 其余用无菌超纯水补足50 µL。采
用降落式PCR反应策略: 94 ℃下预变性5 min, 前
20个循环为94 ℃ 1 min, 65–55 ℃ 1 min, 72 ℃
3 min (其中每个循环后退火温度下降0.5 ℃), 后
15个循环为94 ℃ 1 min, 55 ℃ 2 min, 72 ℃ 3
min, 最后在72 ℃下延伸7 min。
1.4 PCR产物的DGGE分析
采用DGGE-2001 (C.B.S. Scientific, San Diego,
USA)电泳系统, 制备含有变性剂的8%的聚丙烯
酰胺凝胶 , 其中变性剂的浓度从 3 0 %到 6 0 %
(100%变性剂为7 mol·L–1尿素和40%去离子的甲
酰胺的混合物), 每个加样孔加入20 µL PCR产
物。在150 V的电压下, 60 ℃电泳6 h。电泳完毕,
将凝胶用硝酸银染色 , 凝胶晾干后用扫描仪
扫描。
DGGE图片采用Quantity One (4.25版)进行条
带检测及聚类分析(采用UPGMA方法), 采用下列
公式计算沉积物细菌多样性:
1
ln
n
i
S pi pi
=
= −∑
式中, S为Shannon-Weaver多样性指数, pi为条带
峰面积占该样本中所有条带峰面积的百分数, n为
该样本DGGE所检测到的条带总数。
2 结果和讨论
2.1 根际沉积物中微生物的种类与数量
沉积物中获得的PLFA经气质联用仪测定 ,
可得到6–19种脂肪酸及其含量(图1), 包括饱和脂
肪酸、支链脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和
脂肪酸, 未检测到环丙烷脂肪酸和带羟基的脂肪
酸。其中i15:0、a15:0、i16:0、i17:0和a17:0等5种
革兰氏阳性细菌磷脂脂肪酸, 16:1ω7和16:1ω9两
种革兰氏阴性细菌磷脂脂肪酸。样品中革兰氏阳
性细菌生物量与革兰氏阴性细菌生物量相差不
大。在所有检测的样品中, 16:0的检测值均为最
大。偶数碳饱和脂肪酸的相对含量为40.92%–
67.39%, 是沉积物中含量最丰富的脂肪酸种类 ,
其次是单不饱和脂肪酸 , 相对含量为17.47%–



图1 沉积物样品中磷脂脂肪酸组成。A, 爱晚湖; N, 非根际; PR, 芦苇根际; Q, 青年湖; TR, 东方香蒲根际。
Fig. 1 Composition of phospholipid fatty acid in sediment samples. A, Aiwan Lake; N, non-rhizosphere; PR, Phragmites
australis rhizosphere; Q, Qingnian Lake; TR, Typha orientalis rhizosphere.

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表1 沉积物中磷脂脂肪酸含量(nmol·g–1干重)
Table 1 Contents of phospholipid fatty acids in sediments (nmol·g–1 dry weight)
青年湖 Qingnian Lake 爱晚湖 Aiwan Lake
东方香蒲根际
Typha orientalis
rhizosphere
芦苇根际
Phragmites
australis
rhizosphere
非根际
Non-
rhizosphere
东方香蒲根际
Typha orientalis
rhizosphere
芦苇根际
Phragmites
australis
rhizosphere
非根际
Non-
rhizosphere
微生物生物量
Microbial biomass
44.17B (2.19) 12.35C (1.48) 5.99D (0.79) 51.17A (3.19) 3.52E (0.25) 3.93E (0.27)
革兰氏阳性细菌
Gram-positive bacteria
8.65A (0.85) 2.17B (0.12) 2.10C (0.08) 26.40A (2.30) 1.86C (0.06) 1.78C (0.05)
革兰氏阴性细菌
Gram-negative bacteria
14.21B (0.13) 3.81C (0.05) – 2.35A (0.22) – –
阳性菌与阴性菌的比值
Ratio of gram-positive bacteria
to gram-negative bacteria
0.61B (0.05) 0.57B (0.03) 0.83C (0.02) 8.11A (0.75) 0.46E (0.01) 0.70D (0.01)
细菌生物量
Bacterial biomass
24.91A (2.15) 6.20B (0.52) 1.12E (0.03) 17.39A (1.45) 1.30D (0.04) 0.93F (0.02)
真菌生物量
Fungal biomass
2.99A (0.25) 0.77B (0.05) 0.74A (0.0.2) 0.47C (0.01) 0.35D (0.01) 0.75A (0.03)
–, 未检出。括号中的值表示标准偏差。每一行中不同的大写字母(A、B、C、D、E、F)表示差异显著(p < 0.05)。
–, not detected. The values in parentheses are standard deviation. Different capital letters (A, B, C, D, E, F) in each row indicate significant
differences (p < 0.05).



34.48%。其中, 饱和脂肪酸16:0、单不饱和脂肪
酸16:1ω7为优势脂肪酸。支链脂肪酸和奇数碳饱
和脂肪酸的相对含量较低 , 而双不饱和脂肪酸
18:2ω6,9t的相对含量最低, 有些沉积物中未检出
(王爱丽, 2011; 杨瑞, 2011)。
沉积物中微生物生物量、细菌生物量、真菌
生物量以及革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌含
量见表1。由表1可知, 两个湖中植物根际沉积物
中的微生物生物量、细菌生物量、革兰氏阳性细
菌和革兰氏阴性细菌含量高于非根际沉积物(爱
晚湖芦苇除外, 其数值与非根际相差不大)。影响
根际微生物生物量的因素较复杂, 主要包括根系
分泌物的作用、根对微生物的流动性的影响。众
所周知, 根际环境中由于根系分泌的氨基酸、有
机酸和糖类能为微生物提供碳源和能源, 使得根
际环境中的微生物数量远大于非根际(项学敏等,
2004; Zhang et al., 2006; Fan et al., 2008)。根系分
泌物对微生物还具有趋化作用, 使微生物在根际
聚集 (Heinrich & Hess, 1985)。 Jenkins 和 Lion
(1993)研究发现 , 细菌可看作是一种胶体 , 在孔
隙水中是流动的, 植物根吸收土壤中水分的同时,
细菌可以向根迁移。
由表1还可以看出 , 两个湖中东方香蒲根际
沉积物中的微生物生物量、细菌生物量、G+和G–
明显高于芦苇根际沉积物, 植物种间的数值差异
较大。例如, 东方香蒲的根际细菌与非根际细菌
比值为8.2–9.7, 芦苇的根际细菌与非根际细菌比
值为0.6–2.1, 东方香蒲的根际效应明显大于芦
苇。项学敏等(2004)采用稀释平板法研究了芦苇
和东方香蒲根际微生物的数量, 结果表明东方香
蒲的根际效应明显大于芦苇, 其研究结果与本研
究一致。此外, 种内植物根际微生物生物量受生
长状况的影响较大。具体表现为采样期间东方香
蒲的生长状况(株高)相似, 微生物生物量相差不
大; 而爱晚湖的芦苇由于与东方香蒲共生, 受到
东方香蒲生长的抑制, 使得微生物生物量明显低
于单独生长的芦苇(王爱丽, 2011; 杨瑞, 2011)。
2.2 根际沉积物中细菌的16S rDNA片段的变性
梯度凝胶电泳分离
沉积物样品总DNA的PCR-DGGE结果如图2
所示。爱晚湖非根际样品中共检测到条带8条, 可
代表爱晚湖中非根际的微生物群落结构, 其中条
带1、2、3、4在爱晚湖东方香蒲和芦苇根际中也
存在 , 说明这4个条带是爱晚湖各沉积物中共有
的菌群。爱晚湖东方香蒲根际样品中共检测到条
带23条, 较非根际多187.5%, 出现了非根际中没
有的条带(如条带5、6、7), 还有部分条带亮度增
强(如条带2、3), 这表明它们所代表的微生物在植
物根际有所增强。爱晚湖芦苇根际样品中共检测
到条带17条, 较非根际多112.5%, 较东方香蒲根
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图2 不同沉积物样品的变性梯度凝胶电泳分离图。从左
到右分别为青年湖东方香蒲根际、青年湖芦苇根际、青
年湖非根际、爱晚湖东方香蒲根际、爱晚湖非根际、爱
晚湖芦苇根际。图中的数字是条带的编号。
Fig. 2 Denaturing gradient gel electrophoresis separation
of different sediment samples. From left to right are Typha
orientalis rhizosphere in Qingnian Lake, Phragmites aus-
tralis rhizosphere in Qingnian Lake, non-rhizosphere in
Qingnian Lake, Typha orientalis rhizosphere in Aiwan
Lake, non-rhizosphere in Aiwan Lake, Phragmites australis
rhizosphere in Aiwan Lake, respectively. The numbers in
figure refer to the number of bands.


际少26.1%。青年湖非根际样品中共检测到条带
11条, 条带1和4是两个湖中共有的菌群, 且根际
沉积物中的条带亮度强于非根际 , 条带8是青年
湖特有的菌群。青年湖芦苇根际样品中共检测到
条带13条 , 较非根际多18.2%, 青年湖东方香蒲
根际样品中共检测到条带 15条 , 较非根际多
36.4%, 出现了非根际中没有的条带(如条带9)。
2.3 根际沉积物中微生物群落多样性分析
分别利用PLFA和PCR-DGGE数据计算微生
物群落多样性指数, 结果见表2。由表2可知, 两种
方法的计算结果基本一致, 均为根际沉积物中微
生物群落多样性指数明显高于非根际; 植物的生
长方式对其影响不大, 无论是单生还是混生均为
东方香蒲根际沉积物中群落多样性高于芦苇根
际。这说明根系分泌物的刺激作用不仅影响了根
际微生物生物量, 还影响了根际微生物群落的多
样性。
2.4 根际沉积物微生物聚类分析
用SPSS软件对不同沉积物样品PLFA数据进
行聚类分析。结果如图3所示, 两个湖中非根际沉
积物和芦苇根际沉积物的群落结构相似, 以较短
的欧式距离聚在一起, 而两个湖中东方香蒲根际
沉积物在较远的欧式距离处聚在一起。聚类分析
结果显示芦苇根际沉积物中微生物群落结构与非
根际沉积物相似, 但明显不同于东方香蒲根际沉
积物。这表明微生物生物量的变化不一定伴随微
生物群落结构的变化, 植物种类比植物生长方式
更容易影响微生物群落结构。这与前人的研究结
果是一致的 (Smalla et al., 2001; Berg et al.,
2002)。
用Quantity One软件对不同沉积物中细菌
DGGE所表现出的微生物种群结构进行聚类分析,
结果如图4所示。不同沉积物中细菌的DGGE图共
分为3类: 两个湖中东方香蒲根际的指纹图谱最
为相近, 聚为一类; 两个湖中芦苇根际的指纹图
谱最为相近, 聚为一类; 两个湖中非根际的指纹
图谱最为相近, 聚为一类。相对于东方香蒲, 芦苇
根际和非根际的差异较小。DGGE结果与PLFA分
析结果基本一致。通过聚类图可以看出, 无论是
单生还是混生, 同一植物根际沉积物中细菌样本
聚在同一族群, 而不同种类的植物根际沉积物中


表2 不同沉积物中微生物群落的多样性指数
Table 2 Diversity index of microbial community in different sediments
青年湖 Qingnian Lake 爱晚湖 Aiwan Lake
东方香蒲根际
Typha orientalis
rhizosphere
芦苇根际
Phragmites aus-
tralis rhizosphere
非根际
Non-
rhizosphere
东方香蒲根际
Typha orientalis
rhizosphere
芦苇根际
Phragmites aus-
tralis rhizosphere
非根际
Non-
rhizosphere
磷脂脂肪酸
Phospholipid fatty acids
2.39A (0.20) 2.20A (0.18) 1.72B (0.15) 2.25A (0.18) 1.79B (0.12) 1.35C (0.09)
变性梯度凝胶电泳
Denaturing gradient gel
electrophoresis
2.46A (0.21) 2.32A (0.19) 1.68B (0.15) 2.87A (0.22) 2.61A (0.20) 1.66B (0.13)
括号中的值表示标准偏差; 每一行中不同的大写字母(A、B、C)表示差异显著(p < 0.05)。
Values in parentheses are standard deviation. Different capital letters (A, B, C) in each row indicate significant differences (p < 0.05).
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图3 沉积物样品中微生物群落磷脂脂肪酸数据聚类分析。图中的数字指聚类分析中的组间平均距离, 单位为cm。
Fig. 3 Cluster analysis of phospholipid fatty acid data of microbial community from sediment samples. The numbers in
figure refer to average distance between the groups in cluster analysis and the unit of the number is centimeter.



图4 沉积物样品中微生物群落变性梯度凝胶电泳条带聚类分析。图中的数字指聚类分析中的组间变性梯度凝胶电泳
条带的相似程度, 例如0.81代表相似度为81%。
Fig. 4 Cluster analysis of denaturing gradient gel electrophoresis bands of microbial community from sediment samples.
The numbers in figure refer to the similarity among denaturing gradient gel electrophoresis bands between the groups in
cluster analysis. For example, 0.81 refers to 81% of similarity.


细菌样品聚在不同的族群, 说明根际沉积物中细
菌群落结构主要与植物种类有关, 植物的生长方
式对其影响不大。
3 结论
采用PLFA和PCR-DGGE两种技术对天津大
学校内的两个相邻湖泊(青年湖和爱晚湖)中湿地
植物根际微生物群落结构及其多样性进行了调
查, 得到的结果基本一致:
(1)植物根际沉积物中微生物生物量高于非
根际(爱晚湖芦苇除外 , 其数值与非根际相差不
大)。
(2)植物种间的微生物生物量差异较大, 东方
香蒲根际沉积物中微生物生物量大于芦苇根际。
(3)植物种内的微生物生物量受生长状况的
影响较大, 采样期间, 青年湖和爱晚湖中东方香
蒲的生长状况(株高)相似, 微生物生物量相差不
大; 而爱晚湖芦苇由于与东方香蒲共生, 受到东
方香蒲的抑制, 使得微生物生物量明显低于青年
湖中单独生长的芦苇。
(4)沉积物中微生物群落结构主要与植物种
类有关, 植物种类不同, 则其根际沉积物群落结
构及其多样性差异就较大。
参考文献
Berg G, Roskot N, Steidle A, Eberl L, Zock A, Smalla K
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