全 文 ：第 42卷　第 5期 河 南 农 业 大 学 学 报 Vol.42　No.5
2008年　　 10月 JournalofHenanAgriculturalUniversity Oct.　 2008
收稿日期:2008-05-15
基金项目:国家自然科学基金项目(30671201);河南省科技攻关项目(0624410090)
作者简介:王明道(1972-),男 ,河南南阳人 ,讲师 ,博士研究生 ,主要从事生物技术方面的方面的研究;通讯作者:贾新成.
文章编号:1000-2340(2008)05-0532-07
怀地黄连作对土壤微生物区系的影响
王明道 ,吴宗伟 ,原增艳 ,陈红歌 ,吴　坤 ,贾新成
(河南农业大学生命科学学院 ,河南 郑州 450002)
摘要:运用传统平板培养方法及变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析法对地黄的连作问题进行了研究.结果表明 , 地
黄连作引起土壤根际 、根外细菌数量减少;根际放线菌数量增加 , 根外数量变化不大;真菌种类和数量都有较大
变化.DGGE分析表明 ,头茬和重茬地黄生长过程中根际土壤微生物区系发生了明显变化 , 细菌数量减幅较大 ,
有些条带消失 , 说明种群数量减少;放线菌种群没有大的变化 ,数量有所上升;真菌数量有所增加 , 种群发生了明
显改变 , 表现为条带的缺失和增加.地黄连作后土壤微生物多样性发生了较大变化 ,细菌数量减少 , 木霉和黄曲
霉数量增加 , 土壤生态系统已开始失调 , 这可能是地黄连作障碍产生的原因.
关键词:地黄;连作;连作障碍;土壤微生物区系;变性梯度凝胶电泳
中图分类号:Q948.113　　　　文献标识码:A
EfectsofRehmanniaglutinosaLibosch.Continuous
CroppingonMicrobialCommunities
WANGMing-dao, WUZong-wei, YUANZeng-yan, CHENGHong-ge, WUKun, JIAXin-cheng
(ColegeofLifeScienceofHenanAgriculturalUniversity, Zhengzhou450002, China)
Abstract:Thevariationofrhizosphereandnon-rhizospheremicrobialpopulationwasanalyzedinre-
sponsetoRehmanniaglutinosacontinuouscroppingproblem.Analysisusingplatecountrevealedare-
ductiontrendinthenumberofculturablebacteriabothinrhizosphereandbulksoilasRehmanniaglu-
tinosacontinuouscroppingproblem.CulturableactinomycesincreasedwiththedevelopingofRehman-
niaglutinosa.Fungalspeciesandnumberchangedgreatly.DGGEanalysisaboutcontinuouscropping
soilrevealedagreatpopulationshiftinrhizospheremicroorganisms.Mostbacteriapopulationschanged
greatly.AndsomeDGGEstripdisappearanceshowedthatsomebacteriaspeciesdiminished.Actino-
mycesspeciesdidn tchangetoomuch.ButitsnumberroseduringRehmanniaglutinosagrowth.The
funginumberincreased.SomeDGGEstriplackorincreaseshowedthatfungusgrouphadchangeddif-
ferentlyinrhizosphereandnon-rhizospheresoil.Inshort, microbialdiversityinsoilchangedafterReh-
manniaglutinosacontinuouscropping.Soilecosystembegantoshowdisorderswhichmayresultin
continuouscroppingobstaclestoRehmanniaglutinosa.
Keywords:RehmanniaglutinosaLibosch;continuouscropping;continuouscroppingobstacles;soil
microbialcommunity;DGGE
　　地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)为玄参科
多年生草本植物 ,以干燥块根入药.怀地黄因主产
于古 “怀庆府”(今河南焦作)一带而得名 ,是中国
著名的 “四大怀药 ”之一 ,为传统大宗地道中药材 ,
一直被视为药材中的上品.怀地黄是已知块根类药
材中连作障碍最严重的药用植物 ,每茬收获后须隔
8 ～ 10 a方可再植 [ 1, 2] .导致连作障碍发生的原因
很多 ,以往的研究表明 ,主要原因来自土壤 ,其中微
DOI :10.16445/j.cnki.1000-2340.2008.05.014
第 5期 王明道等:怀地黄连作对土壤微生物区系的影响 533　
生物种群结构失衡是导致作物减产 、土壤质量下降
的主要原因之一 [ 3, 4] .如汪立刚[ 5] 、季尚宁[ 6]等研
究大豆连作障碍时发现 ,灭菌土壤能有效的解除连
作障碍的不良影响 ,并能显著提高重 、迎茬大豆产
量.吴凤芝 [ 7]等研究了土壤灭菌对大棚连作黄瓜
生长发育影响 ,结果表明 ,土壤灭菌后黄瓜的生长
发育得到了显著改善.另一些研究表明 [ 8 ～ 11] ,连作
障碍与土壤微生物种群结构组成与数量密切相关.
在生产实践中也发现 ,微生物种群多样性减少和有
害微生物数量增加是连作中的普遍现象.因此 ,研
究作物连作对土壤微生物区系的影响 ,不但有益于
探明连作障碍机理 ,亦有助于特殊功能菌群和有益
土壤微生物种群的引入 ,促进原有微生物群落的恢
复 ,进而降解自毒物质 ,消减连作障碍.但迄今为
止 ,对地黄连作土壤微生物区系随连作茬次变化的
跟踪研究尚未见报道 ,地黄连作条件下根部微生物
区系的动态变化与演替规律尚不清楚.作者运用传
统平板培养方法及现代分子生物学方法对地黄连
作根系微生物种群连续性变化进行跟踪研究 ,从而
探讨怀地黄连作障碍的成因.
1　材料与方法
1.1　供试品种及试验地概况
地黄品种为 “温 85-5”.试验地选在河南省温
县地黄种植试验基地 ,土壤类型为沙土.重茬地为
2006年种过地黄的空闲地 , 头茬地前茬作物为
花生.
1.2　试验方法
1.2.1　样品采集　2007-04-20开始种植 ,分别
于地黄种植前 ,地黄种植后 30(苗期)、50(大根拉
长前期)、70(大根拉长后期)、115(块根快速膨大
Ⅰ期)、 150d(块根快速膨大Ⅱ期)采集样品 ,按 5
点取样法采集地黄根际土和根外土 [ 12] .
1.2.2　可培养微生物的培养　采用牛肉膏蛋白胨
培养基混菌法培养细菌 ,马丁氏(Martin)培养基混
菌法培养真菌 ,改良高氏一号培养基混菌法培养放
线菌.计数及鉴定按常规方法进行.
1.2.3　DNA的提取　土壤微生物基因组 DNA的
提取方法参照文献 [ 13] ;基因组 DNA粗提物和
DNA粗提物采用 Vitagen公司凝胶试剂盒纯化
(productcode:110610-05 VitageneBiotechnology
Co., Ltd.).该试剂盒用凝胶融化体系融化凝胶 ,结
合 Silica膜选择性吸附 DNA的原理 , 从凝胶中回
收 100 ～ 30 000 bp的 DNA片断.
1.2.4　PCR扩增　以纯化后的基因组 DNA为模
板进行 PCR扩增.
1.2.4.1　细菌 16 SrDNA基因 V3区的扩增　扩
增用通用引物对 F341 /R51.PCR反应体系:10倍
PCR缓冲液 5μL(含 20mmol·L-1 MgCl2),引物
F341-GC和 R518各 2×10-8 mmol· L-1 , dNTPs
5mmol·L-1 4 μL,模板约 50 ng, Taq酶 2.5 U·
μL-1(Promega公司), 3 μg的 BSA(牛血清白蛋
白),加超纯水至 50μL.PCR反应参数:94 ℃预变
性 5min;10个循环的 94 ℃ 1min, 65 ℃ 1 min, 72
℃ 1min,退火温度每个循环降低 1℃.再在退火温
度为 56 ℃时循环 15次;72℃延伸 5min.
1.2.4.2　放线菌 16SrDNA基因保守区扩增　扩
增采用特异性引物对为 F243 /R513.PCR反应体
系:10倍 PCR缓冲液 5 μL(含 20 mmol· L-1
MgCl2),引物 F243和 R513各 20 ×10-8 mmol·
L-1 , 5 mmol· L-1 dNTPs4 μL,模板 50 ng, Taq酶
3.0 U·μL-1(Promega公司), 2.5 μg的 BSA, 2.5
μLDMSO(二甲基亚砜),加水至 50 μL.PCR反应
参数:95℃预变性 4min;35个循环的 94℃ 1min,
63℃ 1 min, 72 ℃ 2min;最后 72℃延伸 10min.
1.2.4.3　真核微生物 18 SrDNA/5.8 SrDNA间隔
区(ITS)扩增　所用引物为 ITS1和 ITS2.ITS1:
5 TCCgTAggTgAACCTgCgg3 ;ITS2:5 gCTgCgT-
TCTTCATCgATgC3 .PCR反应体系同细菌 16 SrD-
NA基因 V3区扩增反应体系.PCR反应参数:94℃
预变性 5min;94 ℃ 30 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 40s,
35个循环;72℃延伸 10min.
1.2.5　变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析　DGGE
参数为:变性剂(尿素及甲酰胺)梯度 35%到 55%
(细菌和真核微生物 DGGE用), 40%到 60%(放线
菌 DGGE用).聚丙烯酰胺凝胶浓度 100 g· L-1 ,
胶厚度 1.0 mm,点样量 30 μL已浓缩 PCR产物.
电泳在 62℃, 1倍 TAE缓冲液 , 120 V电压下进行
5.5h(细菌 DGGE用), 6h(放线菌及真核微生物
DGGE用).电泳结束后在 SYBRGreenⅠDNA染色
液中染色 20 ～ 30 min,将染色后的凝胶用 BioCapt-
Wm成像系统拍照.DGGE分析用仪器为 DcodeTM
UniversalMutationSystem(Bio-Rad公司).
2结果与分析
2.1　地黄连作对土壤微生物数量的影响
2.1.1　土壤细菌数量分析　地黄不同生育时期及
种植茬次根际根外细菌数量分布如图 1所示.从图
1可以看出 ,根际 、根外细菌数量都随地黄的生长
发育而明显减少 ,头茬 、重茬细菌数量下降的趋势
534　 河　南　农　业　大　学　学　报 第 42卷
一致.地黄连作造成根际 、根外细菌数量不仅在基
础水平上较低 ,而且在地黄整个生长发育过程中 ,
连作地黄土壤细菌数量始终低于头茬 ,而从未种植
过地黄的空白对照地细菌数量则保持稳定.
图 1　地黄连作后土壤细菌数量变化
Fig.1　Bacterialnumberchangesincontinuous
croppingsoil
2.1.2　土壤放线菌数量分析　放线菌数量变化见
图 2.从图 2可看出 ,种植过地黄的土壤中根际放
线菌数量明显上升 ,且在种植后 70 d(大根拉长后
期)重茬根际放线菌数量有 1个高峰 ,显著高于头
茬根际土壤.与空白对照地放线菌数量相比较 ,头
茬与重茬根外变化不大 ,均呈先升高而后降趋势 ,
最后在数量上重茬略低于对照 ,头茬等同于对照.
图 2　地黄连作后土壤放线菌数量变化
Fig.2　Actinomycetesnumberchangesincontinuous
croppingsoil
2.1.3　土壤真菌数量分析　真菌数量变化见图
3.由图 3可以看出 ,在地黄生长过程中 ,重茬地与
头茬地根际真菌数量均高于对照地 ,头茬根际真菌
数量的变化趋势持续升高 ,重茬根际真菌数量则是
下降的趋势 ,最后略有上升.重茬根际真菌数量在
种植后 70d(大根拉长后期)以前均高于头茬 ,地
黄连作刺激根际真菌增殖.头茬根外土壤真菌数量
与对照地接近而且变化趋势也一致;重茬根外土壤
真菌数量在种植后 50 d(大根拉长前期)前高于对
照 ,此后数量及变化趋势与对照一致.
图 3　地黄连作后土壤真菌数量变化
Fig.3　Funginumberchangesincontinuouscroppingsoil
2.2　地黄连作对根系土壤微生物区系的影响
通过对细菌的革兰氏染色和芽孢染色检测 ,结
果表明 ,无论根际或根外均以革兰氏阴性菌为主 ,
少见芽孢杆菌 ,重茬地细菌数量减少的也是革兰氏
阴性.真菌水浸片结果显示 ,头茬地黄土壤中可培
养真菌种群主要有 6种:木霉(Trichodermasp.),
青霉 (Penicilium sp.), 毛霉 (Mucorsp.), 根霉
(Rhizopussp.), 镰刀菌 (Fusariumsp.), 黄曲霉
(Aspflavus).各种真菌数量的变化如图 4 ,由图 4
可以看出 ,木霉 、黄曲霉数量变化较明显 ,地黄连作
造成木霉 、黄曲霉数量明显增加 ,毛霉数目明显下
降.其它 3种真菌数量没有明显的变化.
图 4　地黄连作后土壤中可培养真菌数量变化
Fig.4　Changesoffunginumberaftercontinuouscropping
2.3　地黄连作土壤中微生物区系的 DGGE分析
2.3.1　微生物基因组总 DNA的提取　在 PCR扩
第 5期 王明道等:怀地黄连作对土壤微生物区系的影响 535　
增之前首先进行纯化 ,纯化后得到较整齐均一的基
因组 DNA(图 5).以各茬次根际和非根际土样纯
化后总 DNA为模板 ,用 3种特异性引物均能扩增
出相应的 DNA片段 ,其中 F341-GC/R518扩增产
物长度约 230 bp(图 6), F243 /R513-GC和 ITS1 /
ITS2-GC扩增产物长度都约为 250 bp(图 7、图
8).
1.DL2000 DNAmarker;2 ～ 9.真菌 PCR扩增片段
SomePCRamplifiedfragmentsofmolds
图 8　PCR扩增真核微生物 18S/5.8 S间隔区部分片段
Fig.8　PCRamplificationof18S/5.8Sspacer
domainofmolds
2.3.2　地黄连作土壤中微生物区系的 DGGE分析
2.3.2.1　细菌种群 DGGE分析　不同种植茬次 、
不同生育时期地黄根际根外土壤细菌种群的
DGGE图谱见图 9、图 10.由图 9、图 10可见 ,土壤
中细菌种群组成较稳定 ,表现为条带数量大体一
致 ,说明头茬与重茬地黄生长过程中并未造成细菌
种群的大量丢失.但各茬次根际土壤中细菌种群的
数量却发生了明显的变化 ,有的条带明显变暗 ,如
A1, A2, A3, A4在头茬及重茬中变化比较稳定 ,
A5在地黄生长过程中条带消失.A6, A7, A8开
始在头茬根际中存在 ,随着地黄生长消失;在重茬
根际中 ,开始没有 ,然后出现 ,最后又消失.比较根
际与根外 DGGE图 ,根际与根外细菌变化比较一
致 ,这一结果与前面用平板培养方法得到的结果
相符.
1 ～ 5和 6 ～ 10分别为种植后 30, 50, 70, 115, 150 d的头茬
根际土和重茬根际土
1 ～ 5and6～ 10 standfor30, 50, 70, 115, 150 doffirststubble
rhizosphereandcontinuouscroppingrhizosphererespectively
图 9　地黄根际土壤细菌种群 DGGE图谱
Fig.9　DGGEprofilesofbacteriainrhizospheresoil
536　 河　南　农　业　大　学　学　报 第 42卷
1 ～ 5和 6 ～ 10分别为种植后 30, 50, 70, 115, 150 d的头茬
根外土和重茬根外土
1 ～ 5 and6 ～ 10standfor30, 50, 70, 115, 150doffirststubble
Non-rhizosphereandcontinuouscroppingNon-rhizospherere-
spectively
图 10　地黄根外土壤细菌种群 DGGE图谱
Fig.10　DGGEprofilesofbacteriain
non-rhizospheresoil
2.3.2.2　放线菌种群 DGGE分析　不同茬次地黄
根际与根外土壤中放线菌种群的 DGGE分析见图
11、图 12.从图 11, 12可看出 , 头茬地黄和重茬地黄
1 ～ 5和 6 ～ 10分别为种植后 30, 50, 70, 115, 150 d的头茬
根际土和重茬根际土
1 ～ 5 and6 ～ 10standfor30, 50, 70, 115, 150doffirststubble
rhizosphereandcontinuouscroppingrhizosphererespectively
图 11　地黄根际土壤放线菌种群 DGGE图谱
Fig.11　DGGEprofilesofActinomycetein
rhizospheresoil
1 ～ 5和 6 ～ 10分别为种植后 30, 50, 70, 115, 150 d的头茬
根外土和重茬根外土
1 ～ 5and6～ 10 standfor30, 50, 70, 115, 150 doffirststubble
non-rhizosphereandcontinuouscroppingnon-rhizospherere-
spectively
图 12　地黄根外土壤放线菌种群 DGGE图谱
Fig.12　DGGEprofilesofActinomycetein
non-rhizospheresoil
根际土壤表现出来的 DGGE条带数目没有太大的
差异 ,都有 12条较明显的条带 ,但是从亮度上看 ,
重茬的 A1 ～ A5条带明显较亮 ,说明地黄连作后
根际放线菌种群数量变化不大 ,但有些类群的数量
增加 ,地黄连作对根际放线菌具有增殖作用.根外
土壤无论头茬或重茬都有 9条较明显的条带 ,亮度
也没有明显差别;地黄连作对根外放线菌没有明显
影响.这一结果与前面用平板培养方法得到的结果
相符.
2.3.2.3　真菌种群 DGGE分析　土壤真菌扩增产
物经 DGGE检测后 ,根际有 13条亮带(图 13),其
中大多条带亮度发生显著变化 ,说明土壤中真核微
生物种群组成不稳定 ,对地黄连作反映明显.其中 ,
A2, A4在地黄生长后期出现 ,并且条带非常亮.A
3在根际根外中都存在 ,且亮度没有多大变化 ,说
明组成比较稳定.A1在头茬前期有 ,随着地黄生
长消失.但是根外变化比根际明显(图 14),变化的
条带比根际多 , A1, A2, A3 , A4变化同根际相一
致 ,除此之外 , A5, A6 , A7条带变化明显 , A5受
地黄的生长影响比较大 ,只在根外头茬地黄苗期出
现 ,而后消失;A6在地黄块根膨大期才出现;A7
只在头茬与重茬根外某一时期出现.
第 5期 王明道等:怀地黄连作对土壤微生物区系的影响 537　
3　小结与讨论
通过平板计数法测定微生物数量 ,发现头茬与
重茬地黄生长引起了根际与根外细菌数量减少;根
际放线菌数量有所增加 ,根外变化不大;真菌种类
和数量都有较大变化.空白对照地各种微生物数量
都始终比较稳定 ,没有太大变化.
从影响部位看 ,根际与根外细菌数量减少幅度
较大 ,表明地黄生长造成根际 、根外细菌群落变化 ,
是由根系分泌物造成的.虽然可培养微生物占土壤
微生物总量的比例不足 1%[ 14] ,但土壤中可培养
细菌可能是对土壤生态系统贡献最大的类群.它们
比整个微生物群体更容易遭受土壤生态系统变化
的影响 ,可作为与污染影响有关的指示剂[ 15] .从数
量上看 ,种植地黄后 ,土壤中木霉的数量增加 ,重茬
地数量最多 ,木霉具有较强的氨化作用和分解纤维
素的能力 ,是土壤有机质矿化的积极参与者 ,而且
木霉还具有抑制病原菌繁殖的作用 [ 16] .从地黄连
作障碍来看 ,木霉数量在种植地黄后增加 ,其作用
可能是转化地黄根系分泌物及残渣 ,其转化物是否
是化感自毒物质 ,有待进一步研究.黄曲霉在种植
过地黄后从无到有 ,在重茬地中数量最多 ,已知黄
曲霉产生的黄曲霉毒素对作物以及微生物的影响
是负面的 ,黄曲霉数目的增加对地黄的生长是不利
的.种植过地黄的土壤中毛霉数量高于对照地 ,毛
霉是土壤中一种很重要的产生蛋白酶的真菌 ,测量
土壤的蛋白酶活性重茬地明显较低 ,可能与毛霉的
数量减少有关 ,但与地黄连作障碍的关系尚需要进
一步研究.镰刀菌是引起地黄根腐病的病原菌 ,在
空白 、头茬及重茬地数量没有明显变化 ,与地黄连
作后并没有明显的根腐病增多现象相一致.胡元森
等[ 17]研究得出 ,黄瓜连作使真菌各种群数目发生
较大波动 ,造成木霉等有益真菌数目下降 ,黄曲霉
等有害菌数目上升.本研究与胡元森的研究结果不
一致 ,可能与各种微生物类群在不同作物生长中起
的作用有所不同有关.
总体看来 ,地黄连作后 ,真菌的多样性增加 ,但
毛霉等有些真菌的相对数量降低 ,木霉 、黄曲霉等
真菌相对数量增加 ,尤其是明显有害的黄曲霉数量
增加对于土壤环境来说是一种畸形的多样性增加 ,
对于植株的生长有害 ,土壤生态系统已开始失调 ,
根际微生态平衡状态被破坏.
根系分泌物导致根际微生物种群 、土壤酶活
性 、植物营养状态等多种微生态因子的变化.因此 ,
根系分泌物可能是引发土壤物理 、化学及生物学性
质恶化的最初动力.连作土壤中根分泌物的累积会
对土壤生态造成复杂影响 ,因此 ,在连作障碍成因
研究中 ,应加强根分泌物 ,特别是根分泌物中化感
物质的生态效应研究 ,分析连作障碍其它因子与根
分泌物间的作用关系.
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(责任编辑:蒋国良)