全 文 ：植物生态学报 2009, 33 (3) 433~441
Chinese Journal of Plant Ecology
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收稿日期: 2008-08-15 接受日期: 2009-01-13
基金项目: 国家科技支撑项目珍稀濒危鸟类和植物繁育技术与示范(2008BAC39B05)和国家自然科学基金(30371190)
﹡通讯作者 Author for correspondence E-mail: luoyb@ ibcas. ac. cn
E-mail of the first author: comefine@ ibcas. ac. cn
铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养
过程中的相互作用
金 辉1, 2, 5 许忠祥3 陈金花1, 4 韩素芬2 葛 颂1 罗毅波1*
(1 中国科学院植物研究所系统与分子进化植物学国家重点实验室,北京 100093)
(2 南京林业大学森林资源与环境学院,南京 210037) (3 南京出入境检验检疫局,南京 210001)
(4 海南大学园艺园林学院,海南儋州 571737) (5 中国科学院研究生院,北京 100049)
摘 要 由于人为的滥采滥挖和野外生境的退化, 使得铁皮石斛(Dendrobium officinale)这种名贵的中药材一直处
于极度濒危的状态。为了从菌根真菌的角度给人工保育铁皮石斛提供理论指导, 对铁皮石斛的组织培养苗人工接
种‘GDB181’菌株(Epulorhiza sp.)。培养60 d后, 接菌苗平均鲜重增长率比对照苗高出了84.8%。在营养元素含量方
面, 接菌苗的B、Si、Fe、Cu和Mn元素含量的净增率分别为780%、533%、192%、191%和128%, 均在100%以上;
其他元素含量也有不同程度的增加(除Zn外), 结果证明两者有效地建立了共生关系。在显微和超微结构的观察中
发现: 真菌菌丝随机破坏铁皮石斛的根被入侵到外皮层, 并从外皮层细胞不断扩展延伸到皮层的大型细胞, 最后
在大型细胞中被分解消化。在真菌侵染过程中, 被侵染的皮层细胞的细胞壁严重扭曲变形, 菌丝在皮层细胞形成
菌丝结, 菌丝结常位于细胞核附近或包围细胞核。在皮层的大型细胞中, 菌丝细胞被植物的溶酶体包围, 部分或全
部被消解, 出现脱壁或失去细胞质甚至成为空腔等变化, 最终形成衰败的菌丝残骸, 溶酶体也随之消失。溶酶体分
布越多的部位, 菌丝细胞消解变形越严重。含有菌丝残骸的皮层细胞可被新侵染的菌丝重新定殖, 这一菌丝侵染
被消化再侵染的过程在铁皮石斛生长发育过程中可不断重复发生。
关键词 相互作用 共生 显微结构 铁皮石斛 瘤菌根菌属
INTERACTION BETWEEN TISSUE-CULTURED SEEDLINGS OF DEN-
DROBIUM OFFICINALE AND MYCORRHIZAL FUNGUS (EPULORHIZA SP.)
DURING SYMBIOTIC CULTURE
JIN Hui1,2,5, XU Zhong-Xiang3 , CHEN Jin-Hua1, 4, HAN Su-Fen2, GE Song1, and LUO Yi-Bo1*
1State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China, 2College of Forest Re-
sources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China, 3Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing,
210001, 4College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Danzhou, Hainan 571737, China, and 5Graduate University of
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract Aims Dendrobium officinale is an invaluable Chinese medicinal herb in China that has
been threatened by over-collection and habitat deterioration. Understanding the relationship between
orchids and mycorrhizae is important for the conservation of orchids. Our aim is to examine the rela-
tionship between seedling of D. officinale and mycorrhizae.
Methods The strain of GDB181 was identified by internal transcribed spacer (ITS) sequencing. We
inoculated tissue culture seedlings of D. officinale with GDB181 (Epulorhiza sp.) and used ICP-AES to
measure the mineral element content of the seedlings. We observed slices of the orchid mycorrhizae
under light and electron microscopes.
Important findings Seedlings of D. officinale and the inoculation strain formed symbiosis effectively.
The growth of seedlings was promoted by the mycorrhizal fungus. As compared with the control, in-
oculated seedlings had 84.8% greater average rate of increase of fresh weight. The mineral contents
were elevated except Zn; the contents of B, Si, Fe, Cu and Mn in inoculated seedlings were increased by
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780%, 533%, 192%, 191% and 128%, respectively. Fungal hyphae entered the exodermis by breaking
the velamen randomly and infected other cells continuously by means of penetrating the cell wall.
Lastly, the hyphae inhabited the large cells of the cortex and were digested. The cell wall of the cortical
cells were distorted and deformed by infection by the hyphae, and many pelotons formed in exodermis
and cortex. Pelotons were often found near or encircling the nucleus. The invaded fungal hyphae were
surrounded and dissolved by lysosomes partly or completely. With changes of the hyphae from losing
cell wall or cytoplasm to remaining cavum, the lysosomes disappeared gradually. More hyphae were
dissolved and deformed if there were more lysosomes near them. The cortex cells containing degener-
ated hyphae were frequently recolonized by hyphae, and the hyphal digestion and the reinfection of
cortex cells occurred repeatedly throughout all growing stage of D. officinale.
Key words interaction, symbiosis, microstructure, Dendrobium officinale, Epulorhiza sp.
DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2009.03.002
兰科植物是典型的内生菌根植物。目前发现,
几乎所有的兰科植物在生长发育的过程中, 都能
与相应的菌根真菌建立共生关系。甚至有超过100
种的兰科植物完全没有叶绿体(Leake, 2005), 它
们的整个生长发育都依靠与其共生的菌根真菌提
供营养。真菌以菌丝结(Pelotons)的形式存在于兰
科植物的皮层细胞内(Burgeff, 1936)。现在普遍认
为, 兰科植物通过消解皮层细胞中的真菌菌丝来
获得营养(Burgeff, 1936; Rasmussen, 1995)。Smith
(1966)发现Rhizoc- tonia solani 能为兰科植物幼
苗的生长提供充足的营养。许多公认的兰科植物
菌 根 真 菌 属 于 Rhizoctonia 类 , 其 中 包 括
Thanaephorus、Ceratob- asidium、Serendipita、
Tulasnella 和 Oliveonia (Roberts, 1999; Moore,
1987)。
铁皮石斛(Dendrobium officianle)为兰科石斛
属植物, 不仅是中国的特有种, 也是传统的名贵
中药材(吉占和等, 1999)。铁皮石斛种子自然繁殖
系数低, 野生资源稀少。近几十年来, 人们在高额
利润的驱动下, 常年毫无节制地采挖, 不仅使野
生状态的铁皮石斛数量急剧减少, 而且严重破坏
了铁皮石斛的野外生境, 致使其处于濒临灭绝的
边缘。因此, 在采用法律手段, 加强管理的同时,
发展有效的铁皮石斛扩繁和保育技术刻不容缓。
随着组织培养技术的发展和应用, 铁皮石斛的组
培技术已基本成熟; 但是 , 组培苗移栽后 , 成活
率低、生长缓慢, 这些都和缺少与之共生的菌根
真菌有关。目前, 国内对于石斛属菌根的研究还
处于形态和结构的描述(范黎等, 2000; 陈连庆等,
2002b), 以及对菌根真菌的常规分离、形态鉴定
和代谢产物的简单测定等方面(高微微和郭顺星,
2001; 宋经元和郭顺星, 2001; 吴静萍和郑师章,
1994; 范黎等, 1998; Guo et al., 1999; 王春兰等,
2001; 郭顺星等, 2000; 陈连庆等, 2002a; 陈瑞蕊
等, 2004)。本研究拟通过对铁皮石斛组培苗接种
菌根真菌 , 通过苗的生长情况及菌根解剖结构 ,
探讨铁皮石斛幼苗生长过程中与菌根真菌之间的
相互作用, 为铁皮石斛无菌苗人工接种菌根真菌,
提高移栽成活率, 促进其快速生长发育提供技术
基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
2003年在浙江富阳采集野生铁皮石斛蒴果样
品, 实验室内利用种子无菌萌发获得幼苗。供接
种的菌株由安徽岳西野生蕙兰(Cymbidium faberi)
新鲜营养根中分离纯化得到, 编号为GDB181(现
保存于中国科学院植物研究所系统与分子进化植
物学国家重点实验室)。铁皮石斛与菌根真菌共培
养于DE培养基, 配方为: 1.0 mmol·L–1 CaCl2, 0.5
mmol·L–1 MgSO4, 1.0 mmol·L–1 K2SO4, 0.4
mmol·L–1 KH2PO4, 100 μmol·L–1 FeSO4, 25
μmol·L–1 H3BO4, 33 μmol·L–1 MnCl2, 2.8 μmol·L–1
ZnSO4, 1.0 μmol·L–1 NaMoO4, 140 μmol·L–1
Na2EDTA, 1.0 g ·L–1 酵母汁, 8.0 g ·L–1 琼脂(Dijk
& Eck, 1995)。
1.2 方 法
1.2.1 GDB181菌株鉴定
DNA提取 : 在PDA平板培养基上活化菌株
后 , 取菌块置于PDA液体培养基中 , 25 , 180℃
r ·min–1振荡培养。待有大量菌球产生时, 无菌条
件下, 挑取4~5个直径约为5 mm的菌球于1.5 ml
3 期 金 辉等: 铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用 DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2009.03.002 435
的离心管中。采用天根生化科技(北京)有限公司
提供的新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱
型)提取菌根真菌的DNA。
DNA扩增 : 利用引物ITS1/ITS4和ITS4/ITS5
分别通过PCR(Polymerase chain reaction)对核糖
体 DNA 上 的 ITS 区 域 进行 扩增 (White et al.,
1990)。PCR的反应体系(20 μl)包括: 2 μl 10×PCR
buffer, 2 μl (5 mmol·L–1)的各种引物, 2 μl (2.5
mmol·L–1) dNTP, 0.15 μl Taq polymerase, 0.5 μl
DNA, 11.35 μl ddH2O。PCR的反应条件依据
Gardes和Bruns (1993)。
序列测定: PCR产物利用北京赛百盛基因技
术有限公司提供的硅胶膜型TMPCR产物(DNA片
段)纯化试剂盒进行纯化回收。DNA用50 μl无菌
ddH2O 洗提。用引物ITS1/ITS4和ITS4/ITS5分别
进行测序。测序反应体系为10 μl, 内含0.5 μl
BigDye, 1.75 μl BigDye buffer, 0.64 μl (5
mmol·L–1)引物, 60~120 ng DNA。在MegaBACE-
1000 (Amershanm Pharmacia Biotech) DNA测序
仪上进行序列测定。
序 列 分 析 : 得 到 的 序 列 文 件 用 软 件
ContigExpress(Informax Inc., North Bethesda, MD)
进行校对, 然后通过BLAST搜索在GenBank中进
行ITS序列比对(NCBI网址: http:// www.ncbi.nlm.
nih.gov)。
1.2.2 铁皮石斛组培苗的接种
铁皮石斛组培苗经生根培养后, 选择根长在
1.0~1.5 cm左右的健壮幼苗, 在无菌环境中准确
称重(精确到0.01 g)后, 以“品字形”接入圆形玻
璃组培瓶(容积500 ml,瓶口内径6 cm)中的定量
(125 ml/瓶)共生培养基中, 每瓶3株幼苗。5 d后,
选取10瓶无污染的苗, 用打孔器(直径0.5 cm)打
取在PDA平板培养基上活化的‘GDB181’菌株琼
脂块, 每瓶接入一个染菌的琼脂小块, 置于“品字
形”的中心 , 使染菌琼脂块离3株幼苗的距离相
同; 另取10瓶无污染苗在相同位置接入同等量的
无菌琼脂块做为对照。所有接菌处理苗和对照苗
均置于温度为(25±1) ℃, 湿度保持在75%~80%,
光照强度为1 000~1 500 lx,每天的光照时间比为
16:8 (h:h)的组培室内培养。
1.2.3 平均鲜重增长率的计算
与菌根真菌共培养60 d后, 取出接菌苗和对
照苗 , 洗净根部残留的琼脂 , 用滤纸吸干水分 ,
分别准确称取接菌苗与对照苗的重量, 结合处理
前的重量, 计算平均鲜重增长率。计算公式为:
平均鲜重增长率(%)*=
接菌60 d后的重量–接菌前的重量
接菌前的重量 ×100%
*: 计算公式中苗的重量均为30株苗的总重量
1.2.4 接菌苗矿质元素含量测定
随机抽取铁皮石斛菌根苗和对照苗各15株置
于80 ℃的烘箱中烘干, 粉碎后过60目筛。将粉末
在105 ℃下烘至恒重, 准确称取0.500 0 g (精确至
0.000 1)样品 , 采用混合酸 (HNO3:HClO4=5:1)消
煮法提取苗内的矿质元素, 用ICP-AES(电感耦合
等离子体原子发射光谱仪)测定苗内各元素含量。
1.2.5 石蜡切片的制备与观察
在铁皮石斛菌根苗和对照苗中随机选取5株,
每株截取2~3 mm长的新生营养根2段, 迅速固定
于FAA固定液中, 常规石蜡切片法, 包埋, 切片,
厚度8 μm, 番红固绿对染, 加拿大树胶封片。选
取完整的、染色效果理想的切片于光学显微镜下
观察并拍照。
1.2.6 超薄切片的制备与观察
在与制备石蜡切片相同的铁皮石斛根的部
位, 切取约1 mm3的根块, 在0.1 mol·L–1磷酸缓冲
液配置的3.5％戊二醛中固定2~8 h, 经缓冲液清
洗后于1％锇酸溶液中后固定2 h, 清洗后, 丙酮
系列脱水, 环氧丙烷过渡, 环氧树脂Epon 812渗
透、包埋, LKB-V型超薄切片机切片, 厚度50 nm ,
醋酸铀柠檬酸铅双重染色 , H-600型透射电镜观
察拍照。
2 结 果
2.1 菌株鉴定结果
两 对 引 物 ITS1/ITS4 和 ITS4/ITS5 均 能 对
GDB181菌株核糖体DNA上的ITS区域扩增出690
bp左右的特异条带, 根据1.0%的琼脂糖凝胶电泳
检测结果粗略估计, 扩增产物的DNA浓度约为17
ng·μl–1, 所用Marker为天根生化科技(北京)有限
公司提供的D2000(图1A)。测序结果校对后 , 在
Genbank中BLAST结果为Epulorhiza sp.(瘤菌根菌
属的一种), 最大相似度(Max identical rate)达到
100%, 目录号(Accession no.)为: EF393626。
2.2 铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养结果
铁皮石斛组培苗接菌20 d后, 生长势比对照
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旺盛 , 已开始长新根; 随着时间的推移 , 接菌苗
和对照苗的差异更显著。60 d后, 接菌苗叶色浓
绿, 茎粗壮红紫色, 高生长明显, 新生根发达(图
1B); 而对照苗基部已出现发黄叶片 , 基本无新
根产生, 生长势较差(图1C)。接菌苗的平均鲜重
净增率高达107.02%, 而对照苗只有22.22%, 比
对照苗高出了84.8%。在营养元素含量方面, 接菌
苗的B、Si、Fe、Cu和Mn元素含量的净增率分别
为780%、533%、192%、191%和128%, 均在100%
以上; 其他元素含量也有不同程度的增加, P元素
含量的净增率最低的为7.36%; 只有Zn元素含量
净增率为负值, 说明接种菌根真菌之后, 铁皮石
斛苗Zn元素的含量降低了(表1); 对接菌苗的根
进行重分离获得了原接种菌株‘GDB181’。由此可
见, 铁皮石斛组培苗与菌根真菌‘GDB181’之间建
立了共生关系, 菌根真菌对铁皮石斛幼苗的生长
和营养元素的吸收, 特别是B、Si、Fe、Cu和Mn
等微量元素的吸收起到了极大的促进作用。
图1 GDB181菌株的DNA ITS PCR扩增图谱及培养60 d后的接菌苗和对照苗
Fig. 1 The electrophoretic picture of ITS PCR and seedlings of Dendrobium officianle
A:示接种菌株DNA上的ITS区域的大小 The length of ITS reigon of the mycorrhizal fungus M: Marker I: 引物
ITS1/ITS4扩增的片段 Amplified by ITS1/ITS4 II: 引物ITS4/ITS5扩增的片段 Amplified by ITS4/ITS5 B: 示接菌60
d后的菌根苗(黑色箭头示接种菌) Seedlings of Dendrobium officinale cultured symbiotically on DE with mycobionts
‘GDB181’ after 60 d (black arrow shows the mycorrhizal fugus) C: 培养60 d后未接菌的对照苗 The control seedlings
表1 与菌根真菌共培养60 d后铁皮石斛苗营养元素含量
Table 1 Nutrition elements content of the inoculated seedlings
营养元素种类与含量 Nutrition elements types and contents (mg·g–1)
B Si Mn Cu Fe P Zn Mg S Na Ca K
CK 0.005 0.003 0.115 0.178 0.196 1.985 2.293 2.606 3.060 4.898 5.037 12.82
GDB181 0.044 0.019 0.262 0.518 0.572 2.131 0.946 3.12 3.705 7.130 6.381 20.10
净增率 Net increasing rate (%) 780 533 128 191 192 7.36 -58.7 19.7 21.1 45.6 26.7 56.8
2.3 菌根真菌侵染铁皮石斛的过程
铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养的过程
中, 菌根真菌由接种点向铁皮石斛根系生长蔓延,
菌丝首先接触到铁皮石斛的根被, 并在根被外积
聚(图2A、2B)。菌丝通过破坏根被进入外皮层细
胞(图2B)。在外皮层细胞内, 有一部分真菌以一
条或多条菌丝弯曲聚集, 形成环状或簇状的成股
菌丝, 也叫菌丝结, 菌丝结占据了细胞的大部分
空间, 有的甚至充满整个细胞(图2B、2D); 另一
部分真菌由外皮层细胞向皮层细胞扩展, 可见到
菌丝由一个细胞进入相邻细胞(图2C、2D), 皮层
细胞是菌根真菌栖息的主要场所。被真菌侵染的
皮层细胞的细胞壁严重扭曲变形 , 细胞内含物 ,
如质体、多糖颗粒等分解消失, 细胞核异常膨大,
菌丝常位于细胞核附近(图2E、2F), 细胞核异常
膨大可能与调控皮层细胞对菌丝的消解有关。菌
丝结与细胞核在光学显微镜下极易区分, 前者大,
形状不规则, 根据活力的不同呈墨绿色、深紫到
3 期 金 辉等: 铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用 DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2009.03.002 437
图2 菌根真菌侵染铁皮石斛的过程
Fig. 2 The course of mycorrhizal fungus infect Dendrobium officinale
AF: 有活力的菌丝 Active fungus CW: 细胞壁 Cell wall P: 菌丝结 Peloton F: 真菌菌丝 Fungus N: 细胞核
Nucleus DF: 消解衰败菌丝 Degenerate fungus Pl: 质体 Plastid VE: 根被 Velamina CO: 皮层 Cortex VB: 髓
Vascular Bundle
A: 根被外的菌丝细胞 The fungi lie in the out of velamina, ×20 000 B: 菌丝随机破坏根被入侵并在皮层中形成
菌丝结(箭头示破损的根被) Shows the hyphae infected randomly and formed pelotons in the cortex cells (black arrow shows
the destructed cell wall), ×200 C: 菌丝破坏皮层细胞的细胞壁从一个细胞进入另一个细胞 The hyphae infected by
breaking the cell wall, ×10 000 D: 皮层细胞菌丝结及具菌丝由一个细胞进入另一个细胞(箭头示菌丝穿壁) The pelo-
tons (black arrows show the penetrating hyphae), ×400 E: 染菌细胞的细胞壁严重扭曲变形 The deformed and dis-
torted cell wall, ×4 000 F: 菌丝细胞在细胞核附近被消解, 细胞核变形膨大 The degenerated fungus and deformed
nucleus, ×6 000 G: 边缘松散并开始消解的菌丝结及部分消解的细胞核 The degenerated hyphae and nucleus, ×1 000
H: 未染菌的皮层细胞, 示正常完整的细胞核及其他细胞器 The normal root cell, shows the intact nucleus and other cell
organelle, ×3 500 I: 未染菌的根 The normal root slice, ×100
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图3 菌根真菌的消解过程
Fig. 3 The ultrastructure of mycorrhizal fungi in the course of being digestd
FCW: 菌丝细胞壁 Fungal cell wall G: 菌丝细胞的淀粉粒 Granulose V: 液泡 Vacuole DS: 桶孔隔膜 Doli-
pore septum M: 细胞膜 Membrane L: 溶酶体 Lysosome H: 菌丝 Hypha
A: 结构完整, 有活力的菌丝细胞 Active fungus, ×25 000 B: 逐渐开始消解的菌丝细胞 Degenerating hypha cell,
×20 000 C: 细胞壁及质膜已消失, 原生质体开始释放的菌丝细胞 Degenerated hypha cell, ×35 000 D: 有溶酶体积
聚的菌丝细胞(纵切) The hypha cell was encircled with lysosomes,×6 000 E: 菌丝细胞崩解, 溶酶体包围并进入内部空
腔中 The lysosomes encircled and entered the degenerated fungus, ×10 000 F: 新入侵菌丝细胞及开始消解的菌丝细胞
Active and degenerate hypha in one cortex cell, ×15 000 G: 处于不同消解阶段的菌丝细胞 Active and degenerate hy-
pha in one cortex cell, ×15 000 H: 上张方框区域的放大 Active and degenerate hypha in one cortex cell, ×40 000 I:
菌丝细胞消解后留下的残骸 The degenerated fungus, ×15 000
3 期 金 辉等: 铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用 DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2009.03.002 439
浅紫色等染色反应 ; 后者相对小 , 一般近圆形 ,
边缘光滑, 染色反应呈红色(图2G)。真菌菌丝入
侵是随机的, 菌丝和菌丝结在皮层组织中分布也
是不均匀的 , 并定位在一定的皮层细胞群中(图
2B)。失去活力的菌丝结着色较浅, 边缘较松散,
已开始被分解消化成衰败的菌丝(图2B, 2G); 也
有一些处于分解阶段的菌丝结呈现凝胶状(图2B,
2G), 可能是寄主细胞限制真菌菌丝继续扩展的
一种反应或者是真菌自身的酶系进行酶解自溶的
过程。
在未接菌的对照铁皮石斛根中, 均未见到上
述染菌结构, 切片反映出正常的根结构, 可以观
察到皮层细胞壁完整且未扭曲变形, 细胞内有大
量的细胞器, 细胞核正常(图2H); 对照苗的根被
完整, 在皮层细胞中未出现菌丝结(图2I)。
2.4 菌根真菌消解过程中超微结构的变化
刚侵入皮层细胞的真菌菌丝, 细胞壁和质膜
完整 , 内含物丰富 , 细胞器清晰可见(图3A), 具
有进一步再侵染的能力。随后, 有些菌丝细胞壁
部分或全部消解, 仅剩质膜包围的原生质体; 或
者甚至部分质膜也消失, 这时菌丝的细胞物质也
被降解, 出现部分中空, 但仍可见部分内含物和
明显的桶孔隔膜(图3B, 3C)。另有部分菌丝细胞周
围积聚了大量溶酶体, 其中部分溶酶体已进入菌
丝细胞中, 菌丝细胞内含物消失, 仅保留菌丝外
形或已被消解成残败的碎片(图3D, 3E)。中空的菌
丝细胞和溶酶体在外观上极易区分, 前者保留菌
丝细胞的大小, 壁较厚而色深, 有的腔内仍保留
核的残迹及少量的原生质体 ; 后者大小差别较
大, 仅有一层膜, 为中空的囊状结构(图3D, 3E)。
溶酶体分布越多的部位 , 菌丝消解变形越严重
(图3D, 3E)。最终菌丝被消解吸收, 只留残骸, 溶
酶体也随之消失(图3I)。
在铁皮石斛皮层细胞中, 可同时出现有活力
的完整菌丝细胞、刚开始脱壁消解的菌丝细胞和
已被消解出现中空的菌丝细胞(图3F, 3G, 3H), 含
有衰败菌丝的细胞中可被新的菌丝重新定殖, 然
后新的菌丝又被细胞消化吸收, 菌丝被消化及菌
丝的重新定殖在铁皮石斛整个生长发育过程中可
不断重复, 从而源源不断地为铁皮石斛提供营养。
3 讨 论
菌根真菌(Epulorhiza sp.)能促进铁皮石斛幼
苗的生长, 接菌的铁皮石斛苗生长势旺盛, 苗色
浓绿, 茎粗壮呈红紫色, 产生新根多, 根系发达,
在生物量和各营养元素含量上也明显比未接菌的
苗高; 营养根中重分离获得原接菌菌株。这些都
表明Epulorhiza sp.菌株已与铁皮石斛组培苗有效
共生并形成了菌根。接菌苗的各营养元素含量都
有不同程度的增加(除Zn外), 其中大量元素K的
含量升高明显; 微量元素中B、Si、Fe、Cu和Mn
元素的净增率尤为惊人。这与赵杨景等(1999)用
从开唇兰(Anoectochiuro xburghit)、墨兰(Cymbi-
dium sinense)中分离的3个内生真菌菌株接种盆
栽大花蕙兰(Cymbidium sp.)组培苗, 能促进植株
吸收P和K养分的结论相同 ; 而各微量元素的增
加更明显, 与陈连庆等(陈连庆等, 2002b)研究野
生石斛菌根微量元素(除Zn外)含量高于组培苗的
结论一致。另外, Richardson等(1992)在处于消解
阶段的菌丝结中发现了高浓度的磷脂聚合物, 并
检测到Mg2+、K+和Ca2+等离子, 也进一步证实了
菌根真菌对兰科植物吸收营养元素的促进作用。
在本实验中, 还观察到接菌苗新生根的数目远远
多于对照苗, 故认为菌根真菌的入侵刺激铁皮石
斛产生大量新根, 产生的新根可供菌根真菌入侵
形成菌根, 源源不断地提供营养, 从而大大促进
了铁皮石斛幼苗生长。
根据我们的观察, 位于大型消化细胞中的菌
根真菌菌丝结的消解主要有两种方式: 一种是菌
丝细胞自身的酶系进行酶解, 使细胞壁和质膜消
解破损, 原生质从细胞中扩散并被消化; 另一种
是被铁皮石斛细胞内的溶酶体消解, 溶酶体通过
膜的内陷把菌丝细胞的物质吞噬消化; 或者溶酶
体膜破损后, 释放各种水解酶消解菌丝组织。这
两种方式可以同时进行, 达到消解入侵菌丝的共
同目的, 但是后者是消解入侵菌丝并转化成营养
物质的主要形式。Hadly和Pegg (1989)认为, 当处
于消解过程的菌丝空腔内出现酸性磷酸酶时, 意
味着在衰败菌丝中产生了自我分解的物质, 但也
有可能是植物细胞分泌的酶进入了衰败菌丝的空
腔, 因此可以看出, 两种消解方式是密不可分的。
同 样 , 郭 顺 星 和 徐 锦 堂 (1990) 推 测 在 天 麻
(Gastrodia elata)胚细胞中的紫萁小菇 (Mycena
osmundicola)菌丝细胞的细胞质消失 , 也是上述
两种消化方式导致, 但他认为前者更合理。同一
个细胞可被菌根真菌重复侵染、定殖并被消解多
440 植 物 生 态 学 报 www. plant-ecology.com 33 卷
次 , 这一过程贯穿于铁皮石斛幼苗生长的始终 ,
在天麻种子萌发成原球茎的过程中 , 范黎等
(1999)也发现含有衰败菌丝的原球茎细胞会被新
入侵菌丝重新定殖的现象。
入侵的菌根真菌在皮层细胞的细胞核附近形
成菌丝结, 有的甚至包围细胞核; 并且在菌丝结
消解过程中, 同时伴随着细胞核异常膨大变形直
到分解消失的过程, 这些都说明了入侵的菌丝与
植物细胞核间存在着紧密的联系, 并且也反映了
植物细胞旺盛的新陈代谢活性。植物细胞消解菌
丝的过程中需要多种酶的参与, 而酶的合成需要
细胞核产生的大量RNA, 因此细胞核的异常膨大
可能是信使RNA在核内的暂时积累, 而后随着核
的破裂变形, 信使RNA也被释放到细胞质中, 来
参与酶的合成(Barroso & Pais, 1990)。
在铁皮石斛的皮层细胞中, 并不是所有的细
胞都能被菌根真菌侵染并定殖, 未被侵染的细胞
是通过何种方式阻止菌丝入侵的, 或者菌根真菌
是如何选择侵入的目标细胞的, 二者之间是否存
在信号物质的引导和交流？另外, 菌丝在消解过
程中产生的营养物质是通过何种方式和途径输出
到输导组织的, 消解产生的菌丝残渣的成分及去
向？以上疑问的解开有待进一步的深入研究。
参 考 文 献
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责任编委: 李晓林 责任编辑: 李 敏