全 文 ：第 12卷 第 4期
2 0 0 4年 1 0月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
V01．12 NO．4
Oct．． 2004
应用 RAPD技术研究 4种鲍的亲缘关系
黎中宝
(集美大学水产学院 厦f-j 361021)
摘 要 应用 RAPD技术研究4种鲍的亲缘关系结果表明，4种鲍群体中20个有效引物共扩增出538条 DNA带，
平均每个引物扩增的条带数为26．9；扩增的多态性条带数 136，平均每个 引物扩增的多态性条带数为 6．8；多态位
点百分数为 25．3％。盘鲍群体和皱纹盘鲍群体之间遗传距离与遗传一致度分别为 0．28和 0．72，杂色鲍群体和九
孔鲍群体之间遗传距离与遗传一致度分别为0．32和 0．68。聚类分析把盘鲍群体和皱纹盘鲍群体聚为 1组 ，二者
亲缘关系较近；杂色鲍群体和九孔鲍群体聚为 1组，二者亲缘关系也较近。
关键词 盘鲍 皱纹盘鲍 杂色鲍 九孔鲍 RAPD 亲缘关系
Study on genetic relationship among 4 kinds of abalone using RAPD technique．LI Zhong—Bao(School of Fisheries，Jimei
University，Xiamen 361021)，CJEA，2004，12(4)：60～63
Abstract RAPD technique is used tO study the genetic relationship among 4 kinds of aba~ne．The results show that total
538 DNA bands are scoped by 20 efective primers in 4 kinds of abalone，of which 136 DNA bands are reprod ucibly poly—
morphic，and the percentage of polymorphic products is 25．3％ ；the genetic distance and genetic identity between Z —
otis d~cus d~cus and H ．discus hannai are 0．28，0．72 respectivdy，those between H ．diversicolor diversicolor and
H ．diversicolor supertexta&re 0．32，0．68 respectively．In the results of cluster analysis，H ．discus discus and H ．discus
hannai&re pooled into one group，they bo th are geneticaly closer；H ．diversicolor diversicolor and H ．diversicolor SU—
pertexta &re pooled into another group，they both also&re genetically closer．
Key words Haliotis discus discus，H ．discus hannai，H ．diversicolor diversicolor，H ．diversicolor SUpertexta，Random
amplifed polymorphic DNA (RAPD)，Genetic relationship
盘鲍(Haliotis discus discus)、皱纹盘鲍(H．discus hannai)、杂色鲍(H．diversicolor diversicolor)和九孔
鲍(H．diversicolor supertexta)属软体动物门，腹足纲，前鳃亚纲，原始腹足目，鲍科 ，鲍属。这 4种鲍为我国
海珍品养殖重要种类 ，具有较高的经济价值 ，其养殖业发展迅速。杂色鲍和九孔鲍在形态和生态上非常相
似，盘鲍和皱纹盘鲍在形态和生态上也非常相似，它们的分类地位目前尚不清晰，这给其养殖学、遗传学和育
种学的研究带来一定困难，故研究它们的分类地位十分必要。RAPD标记不仅应用于海洋贝类杂种优势的
预测 ，且应用于其种内与种间不同群体间的种质鉴定 、系统进化和遗传多样性与分化 。·加·¨ 等方面研
究。目前有关应用 RAPD技术研究这 4种鲍的亲缘关系尚未见报道。笔者在对盘鲍、皱纹盘鲍、杂色鲍和
九孔鲍等位酶的生化遗传分析研究基础上 ，又系统研究了它们的遗传多样性和遗传分化、杂合体缺乏及
其过量状况以及九孔鲍的遗传结构(2003年)。本实验采用随机扩增多态 DNA(RAPD)方法，研究了4种鲍
的亲缘关系，为其种质资源的可持续利用及其保护提供科学依据。
1 实验材料与方法 ．
实验于 2002年在厦门大学海洋与环境学院实验室进行 ，皱纹盘鲍养殖群体取 自山东省荣成，共 36个，
长 3～5cm；盘鲍养殖群体取 自福建省东山，共 36个 ，长 3～5cm；杂色鲍 自然群体取 白海南省，共 32个，长
4-8cm；九孔鲍养殖群体取自福建省东山(1个群体)和漳浦(3个群体)，每群体各取 32个，共 128个，长 4～
8cm。所有样品活体(充 02)当天带回实验室于一80"C保存。实验药品为提取缓冲液、20mg／mL蛋白酶 K、
十二烷基硫酸钠(SDS)、20tg／mLRNA酶、饱和酚、氯仿、异戊醇、3mol／L NaAc、无水乙醇、70％乙醇和盐酸三
羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸缓冲液(TE)。
*国家自然科学基金项目(30231013)和福建省 自然科学基金项 目(130110036)共同资助
收稿 日期：2003-12-O1 改回日期：2003-12-31
第 4期 黎中宝 ：应用 RAPD技术研究 4种鲍的亲缘关系 61
基因组 DNA的提取。每群体分别提取 12个样品，每个体取足部肌肉约 300mg液 N研磨后称取 50mg
于 1．5mL离心管中，再加入 600／~L提取缓冲液(10mmol／L Tris—C1，pH8．0；0．1mol／L乙二胺四乙酸，pH8．0；
0．5％十二烷基硫酸钠；20~．g／mL RNaseA)，37*(3水浴 1h后加入 25／~L蛋白酶 K(20mg／mL)，50"C消化过夜，
然后以等体积的平衡酚抽提 2次，再用等体积的酚 ：氯仿 ：异戊醇(25：24：1)抽提 1次，加入 1／10体积的
3mo1／L NaAc和2倍体积的冰无水乙醇置一20℃30min，于 1万 r／min离心 5min，用 70％乙醇洗 DNA沉淀 2
次，待乙醇挥发干后加入 60 L盐酸三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸缓冲液(TE)使 DNA溶解 ，置 一20*(2
保存备用。
RAPD扩增。RAPD反应条件按 Wiliams J．G．K．等方法 进行，扩增反应总体积为 25／~L，其中包括
10mmol／L Tris—C1(pH8．0)、50mmol／L KC1、2mmol／L MgC12和 0．2／~mol／L引物，4种核苷酸 dCTP、dGTP、
dATP和 d1vrP各 0．2mmol／L，40ng基因组 DNA，1U(1个酶活力单位)的Tag酶，于 PCR扩增仪进行反应 ，
其中前 2个循环为 94℃变性 3min，36℃复性 3min，72℃延伸 3min；后 38个循环为 94℃变性 1min，36℃复性
1min，72℃延伸 2min；最后 72℃保温 10min。所用 20个有效引物及其碱基序列见表 1。扩增产物在 1．4％
琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭染色，紫外检测并记录。
表 1 4种鲍群体 中20个有效引物 PCR扩增结果
Tab．1 Amplification of 20 effective primers among 4 kinds of abalone
引物号 碱基序列(5’一3’) 扩增条带数 多态性条带数 多态性条带数占／％ 引物号 碱基序列(5-3’) 扩增条带数 多态性条带数 多态性条带数占／％
Primer Sequence Number of Number of poly-Percentage of poly- Primer Sequence Number of Number of poly—Percentage of poly—
number DNA bands morphic bands morphic bands number DNA bands morphic bands morphic bands
S8 GTCCACACGG 24 6 25．0 S24 AATCGGGCTG 16 4 25 0
S11 GTAGACCCGT 22 6 27．2 $58 GAGAGCCAAC 22 6 27 3
S12 CC丌 CACGCA 31 11 35．5 S68 TGGACCGGTG 26 7 26．9
S13 TTCCCCCGCT 29 9 31．0 $78 TGAGTGGGTG 35 9 25 7
S14 TCCGCTCTGG 21 7 33．3 S88 TCACGTCCAC 31 12 38．7
S15 GGAGGGTGTT 14 3 21．4 S168 TTTGCCCGGT 32 8 25．0
S16 TTTGCCCGCA 23 4 17．4 S178 TGCCCAGCCT 34 7 20 6
S17 AGGGAACGAG 24 5 20．8 S188 TTCAGGGTGG 46 8 17 4
S18 CCACAGCAGT 22 5 22．7 S198 CTGGCGAACT 32 8 25 0
S20 GGACCC丌 AC 26 5 19．2 总 计 538 136
$22 TGCCGAGCTG 28 6 21．4 平 均 26．9 6．8 25．3
扩增图谱的数据处理。记录电泳后清晰的扩增带，在同一迁移位置按有或无记录，有带的计为 1，无带
则记为0，列出0、1矩阵进行统计分析。多态位点百分数是反映群体内遗传多样性水平的重要指标之一，根
据下式计算多态位点百分数：
P = (k )×100％ (1)
式中，k为多态位点数目， 为所测定位点的总数。根据 Nei M．等n 公式计算遗传距离和遗传一致度：
J=2N v／( +Ny)×100％ (2)
式中， 和N 指个体或种群X和 y分别具有的扩增区带数 目， 指X和 y共有的扩增区带数 目，计算出
种群间遗传一致度(J)和遗传距离(D=1一J)，根据种群间遗传距离，用 UPGMAl1 程序对 4个鲍群体进行
聚类分析。
2 结果与分析
引物筛选及扩增结果。从 50个 10一mer随机引物中筛选出 20个有效引物，即 S8、S11、S12、$13、S14、
$15、S16、$17、S18、$20、$22、$24、$58、$68、$78、$88、$168、S178、S188和S198(见表 1)。4种鲍群体中20个
有效引物经过 2～3次重复共扩增出 538条 DNA带，平均每个引物扩增的条带数为 26．9；扩增的多态性条
带数 136，平均每个引物扩增的多态性条带数为6．8；多态位点百分数为25．3％。引物扩增所得 PCR指纹图
谱见图 1。
遗传一致度与遗传距离及聚类分析。4种鲍群体之间遗传一致度和遗传距离见表 2。遗传距离变化范
围为 0．28～0．46，盘鲍群体和皱纹盘鲍群体之间遗传距离为 0．28，杂色鲍群体和九孔鲍群体之间遗传距离
中 国 生 态 农 业 学 报 第 12卷
为0．32 遗传一致度变化范围为0．54～0 72，盘鲍群体和皱纹盘鲍群体之间遗传一致度为I)72．杂色鲍群
体和九孔鲍群体之问遗传一致度为 (I 68=
M 1 2 3 4 ’
2 4
与遗传距离{下三角)
表 种鲍群体之间遗传一致度c上三角
图 I 4种鲍 DNA指纹图谱
Fig I ( nI)：!llL】)NA finger1)Nnt~an~mg 4 kinds-、I abalone
* 中M 句怀 ．I灯丸扎鲍辑 ^ 2匈赶鲍拌品，
3勺啵垃监鲍佯品．4 邑蛔样
rab 2 Genetic identity(above diagona1)and getletic
dislaⅢ (below diagona1)among 4 【uts of abalane
+一一- +-一一一+一一一一+一一一一+一一一一+
0 50 O42 0 34
盘 龅
皱纹盘鲍
九 孔 自邑
杂 也 鲍
4种鲍形态与，皂态的相似陛．蕊鲍和皱纹蕊鲍在形 值传距冉
态和生态上非常相似、杂色鲍和 L孔鲍在形态和生态 卜 圈2 4种鲍群体之间聚类图
也非常相似．且盘鲍和皱纹盘鲍生化遗传非常相似 。’、杂 2 Th clus1⋯n ⋯ 4 kind 。 ne
色鲍和九孔鲍生化遗传电非常相似。” 本实验研究表明盘鲍群体和皱纹盘鲍群体之间遗传距离与遗传一
九孔鲍 致度分别为0 28和0 72，杂色鲍群体和九孔鲍群体之同遗传距
离与遗传一致眭分别为 0．32和 0．68． 固鲍鱼或 贝类 RAI D遗传
杂色胞 距离的分类标准尚未建立，故本研究尚不能根据 RAPD研究结果
来划断 4种鲍群体之间差异是否达到种或亚种水平．这将在获得
盘 鲍 鲍忸或贝类 RAPD遗传距离的分类标准后方可进行 根据群体
第 4期 黎中宝：应用 RAPD技术研究 4种鲍的亲缘关系 63
遗传多样性的相对量。根据种群间遗传一致度和遗传距离，用 UPGMA程序对 4种鲍群体进行聚类分析，
其结果为盘鲍群体和皱纹盘鲍群体聚为 1组，杂色鲍群体和九孑L鲍群体聚为 1组。
参 考 文 献
张国范，王继红 ，赵洪恩等．皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交 Fl的RAPD标记．海洋与湖沼，2002，33(5)：484～491
万俊芬，汪小龙 ，潘 洁等．日本盘鲍×皱纹盘鲍子代杂种优势的 RAPD分析．青岛海洋大学学报，2001，31(4)：506～512
李红蕾，宋林生 ，刘保忠等．栉孔扇贝不同种群的遗传结构及其杂种优势．海洋与湖沼，2002，33(2)：188～195
孙 博，刘 晓，张国范．一个皱纹盘鲍人工群体内个体大小遗传变异的RAPD分析．海洋科学 ，2003，27(5)：27～30
李太武，李成华，宋林生等．5个泥蚶群体遗传多样性的 RAPD分析．生物多样性，2003，l1(2)：1l8～124
刘必谦，戴继勋 ，喻子牛．RAPD标记在大连湾牡蛎种群研究中的应用．青岛海洋大学学报，1998，28(1)：82～88
王爱民，阎 冰，叶 力等．三个野生种群马氏珠母贝遗传多样性的 RAPD分析．农业生物技术学报，2003，11(2)：163～168
黎中宝，邓书林 ，丁 洋等．盘鲍和皱纹盘鲍等位酶的生化遗传分析．海洋科学，2004，28(4)：43～49
黎中宝，田 柱 ，朱冬蕊等．九孔鲍和杂色鲍等位酶的生化遗传分析．海洋科学，2004，28(2)：27～31
Heipel D．A．，Bishop J．D．D．，Brand A R．，et a1．Population genetic differentiation of the great scalop pecten maxmius in Western Britain
investigated by randomly amplified polymorphic DNA Mar．Eco1．Prog．Ser．，1998，162：163～ 171
Orbacz E．A．，Wilbur A．E．，Gafney P．M．，et a1．RFLP analysis 0{genetic diversity in a siberian population 0{the Japane~scalop(Pati．
nopecten Nessoensis)．J．Shelfish Res．，1996，15(2)：529
Wiliams J．G．K．，Kubelik A．R．，Livak J ，et a1．DNA polymorphisms identified by arbitrary primers are useful as genetic markers．Nucleic
Acids Res．，1990，18(22)：6531～6535
Nei M．，Li W ．H．Mathematial mode for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases．Proc．Natl Acad Sci．USA，1979，
76(10)：5269～5273
Sneath P．H．A ，Sokal R．R．In Numerical Taxonomy．Freeman，San Francisco，1973
欢 迎 订 阅 2005年 《应 用 与 环 境 生 物 学 报 》
<应用与环境生物学报》是由中国科学院成都生物研究所主办、中国科学院科学 出版基金资助、科学出版社出版、国内外
公开发行的全国性学术期刊，是我国应用生物学和环境生物学的核心刊物。主要报道我国应用生物学、环境生物学及相关科
学领域的基础研究、应用基础研究和应用研究的成果 ，包括研究论文、研究简报和本 刊特邀的综述或述评。读者对象主要为
本学科的科研人员、大专院校师生和科研管理干部。《应用与环境生物学报》为双月刊，大 16开本 ，128页，全铜版纸印刷 ，逢
双月25日出版。国际刊号：ISSN 1006—687X，国内刊号：CN 51—1482／Q，邮发代号：62—15，每期定价 11．00元，全年 66．00元 ．全
国各地邮局(所)均可订阅。新订户可直接向本刊编辑部补购 1995、1996、1997、1998、1999、2000、2001年各卷(卷价分别为
32．00元、44．00元、44．o0元、44．00元、66．00元 、66．00元和 66．o0元)以及 1999年增刊(环境微生物学研究 ，每册22．00元)，
地址：(610041)成都市人民南路 4段 9号中国科学院成都生物研究所《应用与环境生物学报》编辑部，电话：(028)85229903．
85237341。
● 2 3 4 5 6 7 8 9
m ¨ M