全 文 ：双齿围沙蚕诱导型热休克蛋白 ７０基因的
克隆及 Ｃｕ胁迫下的表达分析
张倩茹１∗　 姜丽思１，２　 牟文燕１，２　 李斯雯１，３　 魏树和１
（ １中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室， 沈阳 １１００１６； ２中国科学院大学， 北京 １０００４９； ３辽宁大
学环境学院， 沈阳 １１００３６）
摘　 要　 本研究主要评估了双齿围沙蚕热休克蛋白 ７０（ＨＳＰ７０）基因的分子特征，记录了其对
于液态 Ｃｕ２＋胁迫的基因表达情况，并通过测序获得的 ＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ序列与其他沙蚕及无脊椎
动物 ＨＳＰ７０同源性比对来判定蛋白特性．结果表明： 该 ＨＳＰ７０ 基因全长 ｃＤＮＡ 序列共 ２１６１
ｂｐ，包括 ５′非翻译区 ４８ ｂｐ，３′非翻译区 １４２ ｂｐ，一个多聚腺苷酸信号序列（ＡＡＴＡＡＡ）和 Ｐｏｌｙ Ａ
尾巴以及开放阅读框 １９７１ ｂｐ．阅读框共编码 ６５６个氨基酸，总分子量为 ７１．４３ ｋＤ，理论等电点
为 ５．１５．该氨基酸序列中含有 ＨＳＰ７０ 家族的 ３ 个签名序列———ＩＤＬＧＴＴＹＳ、ＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ
和 ＩＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＩＱＫ，以及细胞质特异性调控基序 ＥＥＶＤ，Ｃ 端重复序列 ＧＧＭＰ．同源性分析
表明，本研究所获双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０氨基酸序列与已报道的序列相似性高达 ９４％，与其他无
脊椎生物的 ＨＳＰ７０ 相似性也高达 ７９％以上．荧光实时定量 ＰＣＲ 分析表明，Ｃｕ２＋ （０．２ ～ ５．０
ｍｇ·Ｌ－１）胁迫能够显著诱导沙蚕 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表达，并于 １ ｄ 后达到峰值．本研究系统描述
了双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０的分子特性，其可被液态 Ｃｕ２＋诱导表达，具备作为环境污染分子生物标
记物的潜力．
关键词　 双齿围沙蚕； 热休克蛋白 ７０； 生物信息学分析； 基因表达； 重金属胁迫
本文由国家自然科学基金项目 （４０８０１２０２，３１４７０５５２）、国家 “十二五”科技支撑计划项目 （ ２０１２ＢＡＣ１７Ｂ０４）、辽宁省自然科学基金项目
（２０１０２２３２）和教育部留学回国人员科研启动基金项目资助 Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ
（４０８０１２０２，３１４７０５５２ ）， ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｉｌｌａｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｗｅｌｆｔｈ Ｆｉｖｅ⁃ｙｅａｒ Ｐｌａｎ Ｐｅｒｉｏｄ
（２０１２ＢＡＣ１７Ｂ０４）， ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ （２０１０２２３２） ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｅｔｕｒｎｅｄ Ｏｖｅｒｓｅａｓ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｈｏｌａｒｓ， Ｓｔａｔｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ．
２０１５⁃０９⁃１２ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ， ２０１６⁃０２⁃２８ Ａｃｃｅｐｔｅｄ．
∗通讯作者 Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｈａｎｇｑｉａｎｒｕ＠ ｉａｅ．ａｃ．ｃｎ
Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ ｕｎｄｅｒ Ｃｕ２＋ ｓｔｒｅｓｓ． ＺＨＡＮＧ Ｑｉａｎ⁃ｒｕ１∗， ＪＩＡＮＧ Ｌｉ⁃ｓｉ， ＭＵ
Ｗｅｎ⁃ｙａｎ１，２， ＬＩ Ｓｉ⁃ｗｅｎ１，３， ＷＥＩ Ｓｈｕ⁃ｈｅ１ （ １Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００１６， Ｃｈｉｎａ；
２Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９， Ｃｈｉｎａ； ３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００３６， Ｃｈｉｎａ） ．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ
ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ （ＨＳＰ７０） ｇｅｎｅ， ａｎｄ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＨＳＰ７０ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｐｏｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ
Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ ｔｏ ａｑｕｅｏｕｓ Ｃｕ２＋ ． Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃ⁃
ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｏｔｈ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｒａｇｗｏｒｍｓ ｓｐｅｃｉｅｓ
ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｗａｓ ２１６１ ｂｐ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ａ ５′⁃ｔｅｒｍｉ⁃
ｎａｌ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ （ＵＴＲ） ｏｆ ４８ ｂｐ， ａ ３′⁃ｔｅｒｍｉａｎｌ ＵＴＲ ｏｆ １４２ ｂｐ ｗｉｔｈ ａ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐｏｌｙａｄｅｎｙ⁃
ｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＡＡＴＡＡＡ ａｎｄ ａ ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌ， ａｎｄ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ （ＯＲＦ） ｏｆ １９７１ ｂｐ．
Ｔｈｅ ＨＳＰ７０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ６５６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ａ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ７１．４３ ｋＤ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｅ⁃
ｔｉｃａｌ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ５．１５． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＨＳＰ７０ ｏｆ Ｐ． ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ
ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｅｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＩＤＬＧＴＴＹＳ， ＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ ａｎｄ ＩＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＩＱＫ ａｌｌ
ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＨＳＰ７０ ｆａｍｉｌｙ， ａ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｍｏｔｉｆ ｏｆ ＥＥＶＤ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｃ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅ⁃
ｐｅａｔｓ ｏｆ ＧＧＭＰ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｐ． ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ ｓｈａｒｅｄ ９４％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｒａｇ⁃
应 用 生 态 学 报　 ２０１６年 ５月　 第 ２７卷　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｃｊａｅ．ｎｅｔ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ ２０１６， ２７（５）： １６２８－１６３８　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ： １０．１３２８７ ／ ｊ．１００１－９３３２．２０１６０５．０２１
ｗｏｒｍｓ ａｎｄ ７９％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ． Ｉｎ ｒａｇｗｏｒｍｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ Ｃｕ２＋， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｉｔｈ Ｃｕ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （０．２－５．０ ｍｇ·Ｌ－１）， ａｎｄ ｉｔ ｒｅａｃｈｅｄ
ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｎ １⁃ｄａｙ ｅｘｐｏｓｕｒｅ． Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙ， ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｏｆ Ｐ． ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ
ｗｅｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ， ａｎｄ ｉｔｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｂｙ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ａｑｕｅｏｕｓ Ｃｕ２＋， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ
ＨＳＰ７０ ｈａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ； ＨＳＰ７０； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ
ｓｔｒｅｓｓ．
　 　 长期以来，对水体的安全评价一直以化学分析
为主要手段，但有限的化学分析数据很难直观地反
映出受试水体的生物毒性．因此，如何灵敏、快速地
检测和评价环境污染成为迫切需要解决的现实问
题．基于污染物对生态系统影响的最早期作用发生
于分子水平的原理，研究污染物与生物体内有关生
化成分（特别是蛋白质和核酸）的反应，利用生物标
记物来评估污染物的生态毒性，进而做出污染物的
早期预警及诊断是目前生态毒理学的研究热点．研
究发现，热、重金属、氧化损伤及病源侵染会诱导细
胞表达和分泌热休克蛋白 （ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，
ＨＳＰｓ），且当生物体受到胁迫时，热休克蛋白比基于
生长速率、死亡率或繁殖率等而建立的生物标记物，
变化更迅速，更能被较早检测出来［１－２］ ．
热休克蛋白 ７０（ＨＳＰ７０）是进化最为保守、研究
最为广泛和功能上至关重要的一类热休克蛋白家
族，具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能、参与
免疫反应、抗细胞凋亡功能、抗氧化功能、提高细胞
的应激耐受性、促进细胞增殖、参与细胞骨架的形成
和修复等［２－３］ ．普遍存在于绝大多数生物（一些古细
菌除外）体内［４］ ．ＨＳＰ７０ 可分为两种类型，即组成型
ＨＳＣ７０ （ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｃｏｇｎａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ） 和诱导型
ＨＳＰ７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０） ［５－６］ ．正常生理条件下，
ＨＳＣ７０ 在所有细胞内均能稳定表达，而诱导型
ＨＳＰ７０不表达或表达量极低；在外界刺激下，ＨＳＣ７０
在细胞内表达量维持不变或少量增加，而诱导型
ＨＳＰ７０表达量显著上升［７－９］ ．这两种基因所编码的
热休克蛋白在细胞内作为分子伴侣均发挥着重要作
用，组成型 ＨＳＣ７０主要与细胞的分裂、增殖、发育等
生理过程相关［１０］；而诱导型 ＨＳＰ７０ 主要参与应激
保护、改善细胞的生存能力以及提高对环境胁迫或
伤害的耐受性［２，１１］ ．大量研究证实，ＨＳＰ７０ 可被重金
属、氧化剂、过氧化物、化学杀虫剂、类固醇、硝基苯
酚等无机和有机污染物诱导表达［６－７，１２］，与生物的
环境适应能力密切相关，因此许多学者认为 ＨＳＰ７０
是一种潜在的环境污染早期综合预警的生物标
志物［１，６，１３］ ．目前，有关水生生物 ＨＳＰ７０ 被污染物
诱导表达的相关研究多集中在鱼类［３，１４－１５］、贝
类［６－７，１３，１６］、螺类［１７］、甲壳类［１８］等． Ｒａｄｌｏｗｓｋａ 等［１９］
研究表明，高浓度重金属污染可导致紫贻贝（Ｍｙｔｉｌｕｓ
ｅｄｕｌｉｓ）体内 ＨＳＰ７０表达水平升高，在一定浓度范围
内，其表达量随着镉和铜浓度的升高而升高．中国学
者的研究也表明，在一定浓度范围内牡蛎 （Ｃｒａｓ⁃
ｓｏｓｔｒｅａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）体内 ＨＳＰ７０ 基因的表达量随
Ｃｕ２＋浓度的升高而升高［６］，这可能是由于铜在牡蛎
体内逐渐富集后超过了生物体对其吸收的临界值，
导致体内某些蛋白质失活，进而诱导 ＨＳＰ７０ 基因的
表达［８］ ．此外，还发现特定浓度 Ｃｕ２＋在一定时间范围
内可显著诱导牡蛎 ＨＳＰ７０的表达，存在先升高后降
低至起始水平的时间效应关系［６］ ．
沙蚕作为潮间带地区的常见物种，是各种鱼类、
甲壳类和海鸟的重要食饵．由于沙蚕位于水陆生态
食物链的底部，对重金属和有机污染物具有积累和
消化作用，这些被积累的化学物质在一定浓度水平
范围内可能并不对沙蚕造成严重的伤害，却可能影
响食物链中更高级的生物，进而直接影响水生生态
系统食物链的长度及生物多样性和数量．由于这种
关系及其生活环境的特殊性，沙蚕经常被作为海陆
交错带生态监测的指示生物，特别是重金属污染下
有关沙蚕生态毒理学的研究进行得最为广泛［２０］ ．尽
管目前有大量关于海洋生物 ＨＳＰ７０ 基因及蛋白功
能的研究，但对于海陆交错带模式生物多毛纲沙蚕
ＨＳＰ７０基因的研究还鲜有报道［２１］，更未见有关重金
属铜胁迫条件下该基因表达模式的相关报道，这无
疑给应用沙蚕作为区域环境污染监测的模式物种带
来了障碍．
鉴于从分子生物学水平开展沙蚕热休克蛋白
７０研究的必要性，本研究以在我国广泛分布的双齿
围沙蚕 （ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ）为生物材料，通过
５′⁃ＲＡＣＥ和 ＲＴ⁃ＰＣＲ 技术克隆得到 ＨＳＰ７０ 的 ｃＤＮＡ
完整编码序列，并通过相关生物信息学分析，确定其
为一种诱导型 ＨＳＰ７０ 基因；并利用荧光实时定量
ＰＣＲ技术对其在 Ｃｕ 胁迫条件下，不同浓度和时间
ｍＲＮＡ表达模式进行了考察和分析．
９２６１５期　 　 　 　 　 　 　 　 张倩茹等： 双齿围沙蚕诱导型热休克蛋白 ７０基因的克隆及 Ｃｕ胁迫下的表达分析　 　 　 　
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １供试动物　 用于 ＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ 克隆及组织表
达分析的双齿围沙蚕取自江苏省赣榆县沙蚕养殖
场，置于装有底泥的冰盒中运至实验室，用采自其生
活区的海水清洗．活体样品采回后，取少量沙蚕进行
总 ＲＮＡ 提取；其余沙蚕挑选健康完整、大小相近的
３条置于 ２５０ ｍＬ烧杯中，加入 １００ ｍＬ盐度为 １６ 的
人造海水，在（１５±１） ℃下恒温培养．２ ｄ 后，将健康
沙蚕转至含不同浓度污染物的人造海水中，每天换
一次相同溶液，保证足够氧气及恒定的污染物浓度，
不投喂饵料．人造海水成分见文献［２０］．
１􀆰 １􀆰 ２ 试验试剂 　 ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司， ５′⁃Ｆｕｌｌ Ｒａｃｅ Ｋｉｔ、 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ⁃
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＴａｋａＲａ Ｔａｑ、Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ５α、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ
ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 购自宝生物工程（大连）有限公司；
ｐＧＥＭ􀅹⁃Ｔ Ｅａｓｙ 载体和 ｄＮＴＰ 购自 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司；
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ） ２０ Ｐｒｉｍｅｒ 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司， ＬｉｇｈｔＣｙ⁃
ｃｌｅｒ􀅹４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ 购自 Ｒｏｃｈｅ 公司；其
他试剂均为国产分析纯．
１􀆰 ２　 研究方法
１􀆰 ２􀆰 １引物设计　 根据已构建的双齿围沙蚕 ｃＤＮＡ
文库得到该物种的 ＨＳＰ７０ 和 β⁃ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ 部分序
列，设计并合成引物 ＨＳＰ７０⁃Ｏｕｔｅｒ⁃Ｒ、ＨＳＰ７０⁃Ｉｎｎｅｒ⁃Ｒ
和 ＨＳＰ７０⁃Ｆ用于双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０基因的扩增；设
计引物 β⁃ａｃｔｉｎ⁃Ｆ 和 β⁃ａｃｔｉｎ⁃Ｒ 用于双齿围沙蚕
β⁃ａｃｔｉｎ内参基因的扩增，具体序列信息见表 １．
１􀆰 ２􀆰 ２总 ＲＮＡ 的提取 　 将清洗干净的整条沙蚕用
液氮速冻处死，于－８０ ℃保存备用．取保存的沙蚕样
品置于预冷研钵中，加入适量液氮研磨至粉末状；取
大约１．５ ｇ组织至离心管中，并加入１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ，充
表 １　 试验用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列（５′⁃３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ
用途
Ｐｕｒｐｏｓｅ
ＨＳＰ７０⁃Ｏｕｔｅｒ⁃Ｒ ５′⁃ＡＧＴＣＴＴＧＣＣＧＡＴＧＴＡＡＧＣＣＴ⁃３′ ５′ＲＡＣＥ第一轮
ＨＳＰ７０⁃Ｉｎｎｅｒ⁃Ｒ ５′⁃ＴＴＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴ⁃３′ ５′ＲＡＣＥ第二轮
ＨＳＰ７０⁃Ｆ ５′⁃ＧＧＴＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＧ⁃３′ ３′ＲＡＣＥ反转录 ＰＣＲ
ＨＳＰ７０⁃ＲＴ⁃Ｆ ５′⁃ＴＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＣ⁃３′ 半定量 ＰＣＲ
ＨＳＰ７０⁃ＲＴ⁃Ｒ ５′⁃ＡＧＧＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧ⁃３′ 半定量 ＰＣＲ
β⁃ａｃｔｉｎ⁃Ｆ ５′⁃ＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣ⁃３′ 半定量 ＰＣＲ
β⁃ａｃｔｉｎ⁃Ｒ ５′⁃ＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴＴ⁃３′ 半定量 ＰＣＲ
分匀浆；室温放置 ５ ｍｉｎ，使其充分裂解；加入 ２００
μＬ 氯仿，涡旋 １ ｍｉｎ，冰浴 ２０ ｍｉｎ； ４ ℃ １２０００
ｒ·ｍｉｎ－１离心 ２０ ｍｉｎ；吸取上清至另一 １．５ ｍＬ 离心
管中，加入等体积－２０ ℃预冷的异丙醇，混匀后－８０
℃沉淀过夜，使 ＲＮＡ沉淀．次日，４ ℃１３０００ ｒ·ｍｉｎ－１
离心 ２０ ｍｉｎ，弃上清；加入 ４ ℃预冷的 ７５％乙醇 １０
ｍＬ，洗涤沉淀及离心管壁；４ ℃１３０００ ｒ·ｍｉｎ－１离心
５ ｍｉｎ，弃上清；加入适量无 ＲＮＡ酶去离子水（ＲＮａｓｅ
Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ），至完全溶解．经琼脂糖凝胶电泳检测
ＲＮＡ完整性，紫外分光光度计测定浓度．将提取的总
ＲＮＡ置于－８０ ℃冰箱保存备用．
１􀆰 ２􀆰 ３ ５′端 ＲＡＣＥ扩增　 根据 ５′⁃Ｆｕｌｌ Ｒａｃｅ Ｋｉｔ 试剂
盒说明书对总 ＲＮＡ进行去磷酸化处理和“去帽子”
反应，并与 ５′ＲＡＣＥ Ａｄａｐｔｏｒ 连接后，反转录合成 ５′
ＲＡＣＥ的 ｃＤＮＡ．采用巢式 ＰＣＲ 方法扩增目的基因，
Ｏｕｔｅｒ ＰＣＲ反应使用引物为 ＨＳＰ９０⁃Ｏｕｔｅｒ⁃Ｒ（表 １）和
试剂盒提供引物 ５′ＲＡＣＥ Ｏｕｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｉｎｎｅｒ ＰＣＲ反
应使用引物为 ＨＳＰ７０⁃Ｉｎｎｅｒ⁃Ｒ（表 １）和试剂盒提供
引物 ５′ＲＡＣＥ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ；Ｏｕｔｅｒ ＰＣＲ 和 Ｉｎｎｅｒ ＰＣＲ
反应条件与试剂盒说明书建议条件一致．所得到的
ＰＣＲ产物在 １．２％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检
测后，使用 Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 试剂盒
纯化回收 ＰＣＲ 产物，将回收片段与 ｐＧＥＭ􀅹⁃Ｔ Ｅａｓｙ
载体连接；将全部连接产物转化到大肠杆菌 ＤＨ５α
感受态细胞，在含有氨苄青霉素（１００ μｇ·Ｌ－１）和
５⁃溴⁃４⁃氯⁃３⁃吲哚⁃Ｄ⁃半乳糖苷（Ｘ⁃ｇａｌ ０． ２ μｇ·Ｌ－１）
的平板过夜，挑取阳性克隆，并送测序公司测序．
１􀆰 ２􀆰 ４ ３′端 ＲＴ⁃ＰＣＲ 反应 　 根据 ５′ＲＡＣＥ 扩增的测
序结果设计反向引物 ＨＳＰ７０⁃Ｆ（表 １），并利用 Ｏｌｉｇｏ
（ｄＴ） ２０引物反转录 ＰＣＲ 扩增 ３′端 ｃＤＮＡ 序列．按下
列组份配置反转录反应液：５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ 缓冲液 ２
μＬ， ｄＮＴＰ （１０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１） １ μＬ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ） ２０引物 １
μＬ，沙蚕总 ＲＮＡ １ μＬ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ 逆转录酶 １ μＬ，
无 ＲＮＡ酶去离子水 ４ μＬ．将上述反应液 ４２ ℃反应
１ ｈ 后，加入 ＰＣＲ 反应体系：１０ ×ＰＣＲ 缓冲液 （含
Ｍｇ２＋）２􀆰 ５ μＬ，ｄＮＴＰ （１０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．５ μＬ，ＨＳＰ７０⁃
Ｆ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ μｍｏｌ·Ｌ－１ ） ０． ５ μＬ，ＴａｋａＲａ Ｔａｑ （ ５
Ｕ·μＬ－１） ０．５ μＬ，反转录反应液 ０．２５ μＬ，无 ＲＮＡ
酶去离子水 ２０．７５ μＬ．ＰＣＲ 反应条件：１ 个循环，９４
℃变性 ２ ｍｉｎ； ４０个循环，９４ ℃变性 ３０ ｓ；５０ ℃退火
３０ ｓ；７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ；１ 个循环，７２ ℃延伸 ５ ｍｉｎ，４
℃保温．切胶回收及 ＰＣＲ 产物克隆、质粒纯化及测
序方法同 ５′端 ＲＡＣＥ扩增，序列测定由 ＴＡＫＡＲＡ公
司完成．
０３６１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２７卷
１􀆰 ２􀆰 ５序列分析　 应用 Ｃｈｒｏｍａｓ Ｐｒｏ ２．３３ 软件将得
到的 ５′端和 ３′端序列拼接得到双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０
的全长 ｃＤＮＡ 序列．运用 ＢＬＡＳＴ（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ ／ ＢＬＡＳＴ） 进行序列同源性分析．运用
ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ ／ ｇｏｒｆ ／ ｏｒｆｉｇ．
ｃｇｉ）寻找开放阅读框；运用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｅｂ．
ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ ／ ｐｒｏｔｐａｒａｍ ／ ）对所推测的蛋白质基本物理
化学参数进行分析；利用 ＤＮＡＳｔａｒ 和 ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ
（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ ／ ）对蛋白质的功能区及结
构进行分析；利用 ＳＷＩＳＳ⁃ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｓｗｉｓｓｍｏｄ⁃
ｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ ／ ｗｏｒｋｓｐａｃｅ ／ ）对蛋白质的三维结构进行
预测．将双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 的氨基酸与其他物种
ＨＳＰ７０氨基酸进行 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ 比对，利用 ＭＥＧＡ ４．０
软件中邻接法构建 ＨＳＰ７０分子系统发育树，并进行
１０００次的 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｓ值验证．
１􀆰 ３　 Ｃｕ胁迫对 ＨＳＰ７０基因表达影响试验
取已适应实验室人造海水环境的健康沙蚕，体
质量大约在 （ ０． ８０ ± ０． ２３） ｇ，放入含有不同浓度
ＣｕＳＯ４人造海水溶液（盐度为 １６）处理，２４ ｈ 后分别
取对照和处理组沙蚕按上述方法提取沙蚕组织总
ＲＮＡ．试验设置 ３ 个处理组，分别为空白对照组、１
ｍｇ·Ｌ－１ＣｕＳＯ４处理组和 ５ ｍｇ·Ｌ
－１ＣｕＳＯ４处理组，每
组 ３个平行，每个平行随机取 ３ 条双齿围沙蚕提取
组织总 ＲＮＡ．
提取沙蚕组织总 ＲＮＡ 后，按照 ＴａＫａＲａ Ｐｒｉｍｅ⁃
ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 方法，合成 ｃＤＮＡ 第一链．
ｃＤＮＡ稀释 １０ 倍后，以 ＨＳＰ７０⁃ＲＴ⁃Ｆ 和 ＨＳＰ７０⁃ＲＴ⁃Ｒ
（表 １）为特异性引物进行荧光定量 ＰＣＲ （Ｒｏｃｈｅ
Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ⅡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）．ＰＣＲ
反应液：ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ １０ μＬ，ＨＳＰ７０⁃Ｆ（１０
μｍｏｌ·Ｌ－１） ０．５ μＬ，ＨＳＰ７０⁃Ｒ（１０ μｍｏｌ·Ｌ－１） ０．５
μＬ，ｃＤＮＡ ２ μＬ，去离子水 ７ μＬ．用三步法 ＰＣＲ 程
序：９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎ，１个循环；９５ ℃变性 １５ ｓ，６０
℃退火及延伸 ６０ ｓ，共 ４０ 个循环；每个循环第三步
进行荧光采集，融解曲线反应条件为：６５ ℃ ５ ｍｉｎ
不采集，９５ ℃ ５ ｓ 不采集，从 ６０ ℃缓慢升高至 ９７
℃，每升高 １ ℃采集 ５次．每个模板重复 ３次，数据采
用 ２－ΔΔＣｔ法计算目的基因相对表达量，并利用软件
Ｏｒｉｇｉｎ ８．０进行分析，以平均值±标准差表示，α＝０．０５．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 总 ＲＮＡ提取和 ＨＳＰ７０基因 ｃＤＮＡ序列克隆
用 １％琼脂糖凝胶电泳可以清晰显示 ２８Ｓ 和
１８Ｓ ｒＲＮＡ条带（图 １），说明提取的 ＲＮＡ 完整性较
好；用紫外分光光度计测得各样品总 ＲＮＡ 的
ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２８０值为 ２．０３～ １．９０，说明提取的总 ＲＮＡ 质
量较好，具有较高的完整性和均一性，无降解现象，
符合基因克隆及荧光定量 ＰＣＲ 的要求． ５′ ＲＡＣＥ
ＰＣＲ和 ３′ＲＴ⁃ＰＣＲ结果如图 ２，扩增片段大小分别在
６５０、１１００和 ４００ ｂｐ 左右，与预期扩增片段大小相
近．经 ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．３３ 软件进行序列拼接，得到全
长为 ２１６１ ｂｐ的双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０基因 ｃＤＮＡ全序
列，提交至 ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为 ＫＵ２５５７８３．
２􀆰 ２　 核苷酸序列分析及同源性比较
序列分析显示：该序列全长 ２１６１ ｂｐ，５′非翻译
区（５′⁃ＵＴＲ） ４８ ｂｐ，３′非翻译区（３′⁃ＵＴＲ） １４２ ｂｐ，开
图 １　 双齿围沙蚕肌肉总 ＲＮＡ电泳图
Ｆｉｇ．１　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉ⁃
ｔｅｎｓｉｓ．
１） ５′ＲＡＣＥ 扩增产物 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ５′ＲＡＣＥ； ２） Ｍ⁃ＭＬＶ（－）对照
Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍ⁃ＭＬＶ（－）． 下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
图 ２　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０基因 ｃＤＮＡ片段扩增产物电泳图
Ｆｉｇ． ２ 　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ
ｆｒｏｍ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ．
Ｍ： ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ） ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｍａｒｋｅｒ
（ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ）； ３） ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增产物 ＲＴ⁃ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ．
１３６１５期　 　 　 　 　 　 　 　 张倩茹等： 双齿围沙蚕诱导型热休克蛋白 ７０基因的克隆及 Ｃｕ胁迫下的表达分析　 　 　 　
放阅读框（ＯＲＦ）位于 ４９ ～ ２０１９ 位核苷酸，共 １９７１
ｂｐ，编码 ６５６个氨基酸（图 ３）．以起始密码子 ＡＴＧ为
１、２、３位，则第 ４ 位为 Ｇ，第－３ 位为 Ａ，ＡＴＧ 的 ５′端
约 １５ ｂｐ 范围的侧翼序列内不含 Ｔ，符合 Ｋｏｚａｋ 规
则；在 Ｐｏｌｙ（Ａ）尾上游有典型的真核细胞加尾信号
（ＡＡＴＡＡＡ）．
利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 分析显示：双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０
的相对分子质量为７１４３０．５道尔顿（Ｄａ），理论等电
图 ３　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ核苷酸序列及其推测的氨基
酸序列
Ｆｉｇ． ３ 　 ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｉｎ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ．
单下划线表示起始密码子，∗表示终止密码子，ＨＳＰ７０家族特征区域
用方框表示，胞质 Ｃ端特征基序用虚线表示，ＧＧＭＰ 四肽简单重复序
列用双下划线表示 Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓ⁃
ｌａｔｉｏｎ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ａｓｔｅｒｉｓｋ （∗）． ＨＳＰ７０ ｆａｍｉｌｙ
ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｅｎｃｌｏｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｘｅｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｔ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｃ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｔｔｅｄ ｌｉｎｅ （－－－） ａｎｄ
ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ ＧＧＭＰ ｗｅｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅ
ｌｉｎｅｓ （ 　 　 ） ．
点（ｐＩ）为 ５．１５，负电荷残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）总数 １００，正
电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）总数 ８２．氨基酸序列分析显示：
该蛋白质含有 Ｄｎａｋ特征基序和两个 ＨＳＰ７０ 家族标
签序列，分别位于氨基酸序列的 ＩＤＬＧＴＴＹＳ（８⁃１５ 残
基）、 ＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ （ １９６⁃２０９ 残基）、 ＩＶＬＶＧＧ⁃
ＳＴＲＩＰＫＩＱＫ（３３３⁃３４７ 残基）；根据该 ＨＳＰ７０ 氨基酸
序列无原核生物热休克蛋白特征序列（ＧＰＫＨ），并
存在靠近 Ｃ 端有 ３ 个 ＧＧＭＰ 四肽简单重复序列
（６１８⁃６２９残基）和由 ＧＰＴＩＥＥＶＤ（６４９⁃６５６ 残基）组
成的胞质 Ｃ 端特征基序，因此推断该基因为真核生
物 ＨＳＰ７０家族的一种胞质 ＨＳＰ７０成员．
根据两个序列间用 ＢＬＡＳＴ软件比对后 Ｅ⁃Ｖａｌｕｅ
值小于 ０．００５，则两个序列之间具有显著相似性，即
证明序列为同一种基因序列．利用 ＢＬＡＳＴｎ 软件进
行同源性比对，从 Ｅ⁃ｖａｌｕｅ 值为 ０．０ 的序列中发现：
与双齿围沙蚕（Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ，ＨＱ４４９１８６）基
因序列同源性最为接近，达到 ９４％；与多齿围沙蚕
（ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ｎｕｎｔｉａ， ＨＭ６２５７１８ ）、 沙蚕 （ Ｐｌａｔｙｎｅｒｅｉｓ
ｄｕｍｅｒｉｌｉｉ， ＤＱ２０６４６５ ）、 西 伯 利 亚 鲟 （ Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ
ｂａｅｒｉｉ，ＨＭ３４８７７７） 和牙鲆 （ Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ，
ＡＦ０５３０５９）基因序列同源性分别为 ９１％、８３％、８０％
和 ７９％．
　 　 进一步分析本研究双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 与其他
物种 ＨＳＰ７０ 氨基酸序列之间的进化关系，利用
ＢＬＡＳＴｘ 软件在 ＧｅｎｅＢａｎｋ 中搜索得到多条与本研
究双齿围沙蚕热休克蛋白相似性较高的动物氨基酸
序列，利用 ＭＥＧＡ ４．０ 软件，采用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ 法
构建双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 系统发育树（图 ４）．结果表
明，本研究所获得的 ＨＳＰ７０氨基酸序列与已报道的
双齿围沙蚕 （ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ， ＡＤＲ６６５１４． １）
ＨＳＰ７０ 氨基酸序列非常接近［ ２１ ］，和庞贝蠕虫
（ Ａｌｖｉｎｅｌｌａ ｐｏｍｐｅｊａｎａ， ＣＢＭ４２０４８． １ ）、 革 囊 星 虫
（Ｐｈａｓｃｏｌｏｓｏｍａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ， ＡＣＢ４７４８３． １ ） ＨＳＰ７０ 的
亲缘 关 系 也 较 近； 而 黄 鳝 （ Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ，
ＡＧＯ０１９８８． １ ）、 小 体 鲟 （ Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ ｒｕｔｈｅｎｕｓ，
ＡＥＫ８１５２９． １ ）、 非 洲 爪 蟾 （ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ， ＮＰ －
００１０８００６８ ）、 白 鲢 （ Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ，
ＡＣＪ０３５９５． １ ） 和 草 鱼 （ Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌａ，
ＡＣＪ０３５９６．１）等淡水生物聚为一簇；文蛤（Ｍｅｒｅｔｒｉｘ
ｍｅｒｅｔｒｉｘ， ＡＤＴ７８４７６．１）、波纹巴飞蛤（Ｐａｐｈｉａ ｕｎｄｕ⁃
ｌａｔｅ， ＡＦＺ９３０９４． １ ）、缢蛭 （ Ｓｉｎｏｎｏｖａｃｕｌａ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔａ，
ＡＥＰ２６３５０． １ ） 和 厚 壳 贻 贝 （ Ｍｙｔｉｌｕｓ ｃｏｒｕｓｃｕｓ，
ＡＧＹ５６１１９．１）等软体动物聚为一簇．
２３６１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２７卷
图 ４　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０与其他物种 ＨＳＰ７０ 氨基酸序列系
统进化树
Ｆｉｇ． ４ 　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｆｒｏｍ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｍｉｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
图 ５　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 亲水性、柔韧性、表面可能性及抗
原性的预测结果
Ｆｉｇ．５ 　 Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ， ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ， ｓｕｒｆａｃｅ
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｉｎ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ．
ａ） 标尺 Ｓｃａｌｅ； ｂ） 亲水性区域Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｐｌｏｔ－Ｋｙｔｅ⁃Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ； ｃ） 柔韧
性区域 Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ－Ｋａｒｐｌｕｓ⁃Ｓｃｈｕｌｚ； ｄ） 抗原性区域 Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ－
Ｊａｍｅｓｏｎ⁃Ｗｏｌｆ； ｅ） 表面可能性区域 Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ－Ｅｍｉｎｉ．
２􀆰 ３　 蛋白质结构和功能预测
用 ＤＮＡＳｔａｒ 软件的子程序 Ｐｒｏｔｅａｎ 预测双齿围
沙蚕 ＨＳＰ７０的亲水性、柔韧性、表面可能性及抗原
性，结果如图 ５ 所示．Ｋｙｔｅ⁃Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ 方案预测的亲水
性区域大致为 ３０ ～ ３９ 残基、４３ ～ ６８ 残基、７１⁃９２ 残
基、９５⁃１１８ 残基、１２７⁃１３３ 残基、１４８⁃１６１ 残基、１８５⁃
１９１ 残基、２２０⁃２３９ 残基、２４１⁃２７６ 残基、２８４⁃２８９ 残
基、２９５⁃３０４ 残基、３１３⁃３２９ 残基、３４０⁃３４５ 残基、３５０⁃
３６８ 残基、３８１⁃３８７ 残基、４１３⁃４３６ 残基、４４２⁃４５６ 残
基、４６７⁃４７２ 残基、４８９⁃５４７ 残基、５４９⁃５７２ 残基、５７４⁃
６００ 残基、６１０⁃６１２ 残基、６２５⁃６２７ 残基、６２９⁃６３１ 残
基、６３７⁃６４７残基和６４９⁃６５６残基，可见亲水性残基
图 ６　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０信号肽（Ａ）和跨膜区域（Ｂ）的预测
Ｆｉｇ．６ 　 Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ （ Ａ） ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｒｅｇｉｏｎ （Ｂ） ｏｆ ＨＳＰ７０ ｉｎ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ．
Ｃ⁃ｓｃｏｒｅ： 剪切位点分值 Ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｓｃｏｒｅ； Ｓ⁃ｓｃｏｒｅ： 信号肽分值 Ｓｉｇ⁃
ｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃｏｒｅ； Ｙ⁃ｓｃｏｒｅ： 综合剪切位点分值 Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ
ｓｃｏｒｅ． ａ） 跨膜段 Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ； ｂ） 内段 Ｉｎｓｉｄｅ； ｃ） 外段 Ｏｕｔｓｉｄｅ．
所占比例远大于疏水性残基，因此推测该蛋白是亲水
性的．Ｊａｍｅｓｏｎ⁃Ｗｏｌｆ方案预测抗原性显示，该蛋白具有
丰富的 Ｂ细胞抗原位点，特别是在 ５８⁃９０残基、９３⁃１１９
残基、２１４⁃２３６ 残基、２４３⁃２８９ 残基、４８９⁃５４７ 残基、５４９⁃
５７２残基和 ５７４⁃６００ 残基这 ７ 个区域，为优势抗原表
位，均存在很好的抗原结合位点．从图 ５还可以看出，
抗原表位区域与 Ｋａｒｐｌｕｓ⁃Ｓｃｈｕｌｚ方案预测的柔韧性区
域和 Ｅｍｉｎｉ方案预测的表面可能性区域出现了较多
的重叠区，这些区域相对易于形变，便于抗原、抗体的
自由结合，可能是抗原位点的富集区．
利用 ＳｉｇｎａｌＩＰ 对双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 蛋白序列
在线搜索，寻找信号肽序列，发现该蛋白存在信号肽
的概率极低，说明该蛋白不存在信号肽酶切位点，无
信号肽，是一种非分泌型蛋白（图 ６Ａ）．用 ＴＭＨＭＭ
在线进行跨膜性分析，结果显示双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０
蛋白序列无明显跨膜区域（图 ６Ｂ）．
利用 ＰＲＯＳＩＴＥ ｓｃａｎ 在线分析双齿围沙蚕
ＨＳＰ７０潜在的蛋白修饰位点，发现有 ６ 个 Ｎ⁃糖基化
位点（３４⁃３７ 残基、１５０⁃１５３ 残基、３５９⁃３６２ 残基、４１６⁃
４１９残基、４８６⁃４８９ 残基、５８３⁃５８６ 残基），１ 个依赖
ｃＡＭＰ 和 ｃＧＭＰ 的蛋白激酶磷酸化位点（４１４⁃４１７ 残
基），８个蛋白激酶 Ｃ磷酸化位点（４６⁃４８ 残基、８４⁃８６
残基、１５２⁃１５４ 残基、３１９⁃３２１ 残基、 ３３９⁃３４１ 残基、
４９４⁃４９６残基、５３６⁃５３８残基、５７０⁃５７２残基），１５ 个酪
蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（４４⁃４７残基、６５⁃６８残基、
３３６１５期　 　 　 　 　 　 　 　 张倩茹等： 双齿围沙蚕诱导型热休克蛋白 ７０基因的克隆及 Ｃｕ胁迫下的表达分析　 　 　 　
图 ７　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０二级结构预测
Ｆｉｇ．７　 Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｉｎ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ．
ｈ）： α⁃螺旋 α⁃ｈｅｌｉｘ； ｅ） β⁃折叠 β⁃ｓｈｅｅｔ； ｔ） β⁃转角 β⁃ｔｕｒｎ； ｃ） 无规则卷曲 Ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ．
２１０⁃２１３残基、２２１⁃２２４ 残基、２６４⁃２６７ 残基、２８５⁃２８８
残基、３１９⁃３２２ 残基、４２９⁃４３２ 残基、 ４８８⁃４９１ 残基、
４９４⁃４９７残基、５１０⁃５１３ 残基、５５０⁃５５３ 残基、５５１⁃５５４
残基、５６２⁃５６５ 残基、６５１⁃６５４ 残基），２０ 个 Ｎ⁃肉豆蔻
酰化位点（７⁃１２残基、１１⁃１６残基、１６１⁃１６６残基、１８９⁃
１９４ 残基、４０１⁃４０６ 残基、４０６⁃４１１ 残基、４０７⁃４１２ 残
基、６１３⁃６１８ 残基、６１４⁃６１９ 残基、６１８⁃６２３ 残基、６１９⁃
６２４ 残基、６２２⁃６２７ 残基、６２３⁃６２８ 残基、６２６⁃６３１ 残
基、６２７⁃６３２ 残基、６３０⁃６３５ 残基、６３５⁃６４０ 残基、６３９⁃
６４４残基、６４３⁃６４８ 残基、６４７⁃６５２ 残基），１ 个酰胺化
位点（７３⁃７６）． １ 个 ＡＴＰ ／ ＧＴＰ 结合位点基序 Ａ（ Ｐ
环）（１３０⁃１３７残基）．
利用 ＳＯＰＭＡ对双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０二级结构进
行预测．如图 ７ 所示， α⁃螺旋 （ ２４８ 个氨基酸）占
３７．８％，β⁃折叠（１２８个氨基酸）占 １９．５％，β⁃转角（７２
个氨基酸）占 １１．０％，无规则卷曲（２０８个氨基酸）占
３１．７％，说明双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 基因编码的蛋白以
α⁃螺旋和无规则卷曲为主，含少量的 β⁃折叠，间或
有 β⁃转角．
使用 ＳＷＩＳＳ⁃ＭＯＤＥＬ同源建模数据库对双齿围
沙蚕 ＨＳＰ７０空间结构进行预测［２２］，找到了与其有
较高同源性的 ３ 个已知结构 （ １ｈｘ１Ａ、 １ｙｕｗＡ、
４ｐｏ２Ａ）的蛋白序列，范围相当于双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０
序列中的 ４⁃３７９ 残基、３⁃５５３ 残基和 ３８５⁃６１２ 残基，
取前 ２ 个作为模板，参照 Ｈａｒｔｌ 等［２３］的方法构建双
齿围沙蚕 ＨＳＰ７０空间结构图（图 ８）．ＨＳＰ７０ 包括两
个功能单元： Ｎ 端供 ＡＴＰ 结合的核苷酸结构域
（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）和 Ｃ端多肽底物结合域
（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）．多肽底物结
合域由一个 β⁃三明治亚功能域（ｂｅｔａ⁃ｓａｎｄｗｉｃｈ ｓｕｂ⁃
ｄｏｍａｉｎ）和紧跟其后的 α⁃螺旋片段组成［２４］ ．
２􀆰 ４　 Ｃｕ２＋胁迫对 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ表达的影响
采用荧光定量 ＰＣＲ 对不同处理时间和不同浓
度 Ｃｕ２＋胁迫对双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 基因的表达研究
表明，不同浓度 Ｃｕ２＋胁迫 １ ｄ，双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０
ｍＲＮＡ表达量呈现出明显的剂量⁃效应关系（图 ９）．
当较低浓度 Ｃｕ２＋胁迫 （ ０． ２ 和 ０． ５ ｍｇ·Ｌ－１ ）时，
ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表达量相对较低，几乎不表达 （ Ｐ
＞０．０５）；当 Ｃｕ２＋浓度升高至 １ ｍｇ·Ｌ－１时，表达量显
著增加，为对照组（０ ｍｇ·Ｌ－１）的 ３８倍；当 Ｃｕ２＋浓度
升高至５ ｍｇ·Ｌ－１时，表达量显著增加，高达对照组
图 ８　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０的空间结构示意图
Ｆｉｇ．８　 Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｉｎ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ
ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ．
４３６１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２７卷
图 ９　 不同浓度 Ｃｕ２＋胁迫 １ ｄ双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ的相
对表达量
Ｆｉｇ．９　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｉｎ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕ⁃
ｈｉｔｅｎｓｉｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｕ２＋ ａｔ １ ｄ
（ｎ＝ ６）．
∗Ｐ＜０．０５； ∗∗Ｐ＜０．０１． 下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
图 １０　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 在 ５ ｍｇ·Ｌ－１ Ｃｕ２＋胁迫下
不同时间的相对表达量
Ｆｉｇ．１０　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＨＳＰ７０ ｉｎ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕ⁃
ｈｉｔｅｎｓｉｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ５ ｍｇ·Ｌ－１ Ｃｕ２＋ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅｓ （ｎ＝ ６）．
的 ５２６ 倍．这表明该基因可以在短时间内被较高浓
度 Ｃｕ２＋诱导表达．
在 ５ ｍｇ·Ｌ－１ Ｃｕ２＋胁迫条件下，双齿围沙蚕
ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ表达量随时间延长呈波动性变化（图
１０）．在 Ｃｕ２＋胁迫 １ ｄ，ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ表达量急速上升
至峰值，为胁迫前（０ ｄ）ｍＲＮＡ 表达量的 ２９．４８ 倍；
然后其表达量开始下降，至 ２ ｄ时表达量仍然为 ０ ｄ
时 ５．４１倍；至 ３和 ４ ｄ时 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ表达量下降
至与胁迫前（０ ｄ）水平相当，且基本维持不变．这表
明 Ｃｕ２＋的胁迫作用对 ＨＳＰ７０ 基因的表达具有时间
效应．
３　 讨　 　 论
沙蚕作为海陆交错带的关键物种，常被作为生
态监测的指示生物，针对其生态毒理学方面的研究
也在日益兴起［２０，２５］ ．然而，这些研究多针对生物富集
特性及细胞水平生物标志物（酶 ／蛋白）的分泌状
况，与生态毒理学污染早期预警的初衷还存在一定
差距．因此，为了从基因水平阐明生物对污染物的响
应机制，从根本上解决生物标志物早期预警的应用
问题，我们开展了沙蚕基因组及其对污染响应机制
的研究，特别瞄准了与应激、免疫及抗病相关的基因
研究．双齿围沙蚕是广泛分布于我国海陆交错带的
常见物种，通过其差异表达基因文库构建、筛选及测
序，得到了双齿围沙蚕热休克蛋白家族成员基因
ＥＳＴ序列信息，其中属于 ＨＳＰ７０家族的 ＥＳＴ 序列显
示出对 Ｃｕ２＋具有较高水平表达的特征，因此决定对
该基因进行深入研究．
３􀆰 １　 双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ的克隆及序列分析
本研究采用 ５′ＲＡＣＥ 和 ＲＴ⁃ＰＣＲ 方法，经分离
克隆获得了双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ 全序列，该序
列长 ２１６１ ｂｐ，其中包括 ３′和 ５′非翻译区及完整开放
阅读框编码区，共编码 ６５６个氨基酸，总分子量约为
７１．４３ ｋＤ，理论等电点为 ５．１５．根据大部分诱导型
ＨＳＰ７０基因不含内含子的特征［７，２６］，本次克隆到的
双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０基因编码区不含内含子，转录后
不必经过 ｍＲＮＡ剪切拼接的加工过程，该基因可能
属于诱导型 ＨＳＰ７０基因．
氨基酸序列分析发现，该基因具有 ＨＳＰ７０ 家族
的 ３ 个签名序列： ＩＤＬＧＴＴＹＳ、 ＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ、
ＩＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＩＱＫ［２，６，２７］以及靠近 Ｃ 末端的 ＧＧＭＰ
四肽重复序列和 Ｃ 端 ＥＥＶＤ 特征基序［２８］ ． Ｄｅａｎｅ
等［２９］认为，在 ＨＳＰ７０家族中，组成型 ＨＳＣ７０ 有多个
ＧＧＸＰ 四肽重复序列和九肽基序 ＳＧＰＴＩＥＥＶＤ，而诱
导型 ＨＳＰ７０多数情况只出现一次 ＧＧＸＰ，九肽结构
也不同于组成型的九肽基序．这个结论与明建华
等［３０］对团头鲂（Ｍｅｇａｌｏｂｒａｍａ ａｍｂｌｙｃｅｐｈａｌａ）和 Ｃｕｉ
等［３１］对三疣梭子蟹（Ｐｏｒｔｕｎｕｓ ｔｒｉｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）的热休
克蛋白基因克隆结果相同．本研究获得的 ＨＳＰ７０ 氨
基酸序列中 ＧＧＭＰ 重复出现 ３ 次，并含有九肽基
序 ＳＧＰＴＩＥＥＶＤ，按照 Ｄｅａｎｅ 等［２９］的观点应该为组
成型 ＨＳＣ７０．但非洲爪蛙蟾 （ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ， ＮＰ －
００１０９１２３８．１）诱导型 ＨＳＰ７０１Ｂ 和西伯利亚鲟（Ａｃｉ⁃
ｐｅｎｓｅｒ ｂａｅｒｉｉ， ＨＭ３４８７７７．１）中都含有九肽基序 ＳＧＰ⁃
ＴＩＥＥＶＤ和重复的 ＧＧＭＰ ［３２－３３］；而食用牡蛎（Ｃｒａｓ⁃
ｓｏｓｔｒｅａｇｉｇａｓ， ＡＪ３０５３１６．１）的诱导型 ＨＳＰ７０ 和组成
型 ＨＳＣ７０ 均含有 ＧＧＭＰ 重复序列［２７］ ．目前，有关
ＨＳＰ７０基因 Ｃ 端 ＧＧＭＰ 重复序列的具体功能还不
清楚，认为其可能是分子伴侣因子的结合位点［２８］ ．Ｃ
端 ＥＥＶＤ是具有高度保守的细胞质特异性调控基
序［２８］，说明双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０主要存在于细胞质中．
５３６１５期　 　 　 　 　 　 　 　 张倩茹等： 双齿围沙蚕诱导型热休克蛋白 ７０基因的克隆及 Ｃｕ胁迫下的表达分析　 　 　 　
同源性分析表明，双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 与其他无
脊椎动物 ＨＳＰ７０ 的氨基酸序列相似性高达 ７９％以
上，与多毛纲沙蚕的相似性更高达 ８３％以上，其中
与已报道双齿围沙蚕的亲缘关系最近，相似性达
９４％．从 ＨＳＰ７０系统进化树分析，双齿围沙蚕与多毛
纲生物在一个分支上，这与传统的分类结果相一致，
这证实了本研究结果的真实性及 ＨＳＰ７０ 在进化上
的保守性．生物信息学分析结果表明，双齿围沙蚕
ＨＳＰ７０基因编码的蛋白质以亲水性区域为主，具有
丰富的 Ｂ细胞抗原位点，抗原表位区域、柔韧性区
域和表面可能性区域出现了较多的重叠区，这些区
域相对易于形变，有利于抗原、抗体的自由结合，可
能是抗原位点的富集区；该蛋白无信号肽，为非分泌
型蛋白，无明显的跨膜区域．对潜在的蛋白修饰位点
分析发现，该蛋白有众多的 Ｎ⁃糖基化位点、蛋白激
酶 Ｃ 磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、Ｎ⁃肉
豆蔻酰化位点，蛋白质的磷酸化和脱磷酸化在细胞
信号传导中起重要作用，提示这些位点可能是
ＨＳＰ７０完成其生理功能的结构基础．
双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 的二级结构以 α⁃螺旋和无
规则卷曲为主， 空间结构包括 Ｎ 端供 ＡＴＰ 结合的
核苷酸结构域和 Ｃ 端多肽底物结合域．核酸结构域
主要由两个球形亚结构域组成，多肽底物结合域由
一个 β⁃三明治亚功能域和紧跟其后的 α⁃螺旋片段
组成［２４］ ．
３􀆰 ２　 重金属 Ｃｕ 胁迫对双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ
表达的影响
环境胁迫可以诱导机体产生分子伴侣蛋白
ＨＳＰ７０，帮助细胞内多肽的正确折叠、装配和转运，
迅速修复或清除错误折叠、受损蛋白或变性蛋白，对
细胞起修复和保护作用，从而能有效提高机体的耐
受性和抗胁迫能力［３４］ ．重金属 Ｃｕ 既是一种生物体
必需微量元素，是细胞结构和酶化合物的重要组成
部分，也是我国近岸海域常见的主要重金属污染物．
极微量的 Ｃｕ 对水生生物常常是无害的，当其浓度
超过生物的生理承载力时，则对其生长发育和生理
代谢产生影响．Ｊｉｎｇ 等［３５］研究报道，重金属 Ｃｕ 胁迫
会导致金丝鱼（Ｔａｎｉｃｈｔｈｙｓ ａｌｂｏｎｕｂｅｓ）肝脏中 ＨＳＰ７０
ｍＲＮＡ表达量显著上升．Ｚｈａｎｇ 等［６］研究也发现，无
胁迫时，牡蛎组织中 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表达水平低下；
而 Ｃｕ２＋能诱导其显著表达，如当牡蛎暴露于 ５０
μｇ·Ｌ－１ Ｃｕ２＋胁迫条件下，其组织 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表
达量在 ４ ｄ时显著增加至峰值，随后开始下降至起
始水平．也有学者报道，萘等有机污染物胁迫能够诱
导海湾扇贝（Ａｒｇｏｐｅｃｔｅｎ ｉｒｒａｄｉａｎｓ）血细胞显著表达
ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ［１６］ ．Ｍａｒｔｉｎｉ等［３６］报道了不同浓度苯并
［ａ］芘与非洲爪蟾（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ） ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表
达量存在明显的剂量效应关系，ＨＳＰ７０ 能够被较高
浓度苯并［ａ］芘显著诱导，呈现随胁迫浓度升高基
因表达量逐渐升高的趋势．
不同浓度 Ｃｕ２＋胁迫过程中，双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０
ｍＲＮＡ表达量在一定范围内呈现随 Ｃｕ 浓度增加而
升高的变化趋势．较低浓度 Ｃｕ２＋ 胁迫时， ＨＳＰ７０
ｍＲＮＡ表达量相对较低，与无胁迫条件下差异不显
著；但当 Ｃｕ２＋浓度升高至一定浓度时，ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ
表达量显著增加，并可能接近峰值．其原因可能是由
于低浓度 Ｃｕ 胁迫并未损害沙蚕正常生理代谢过
程，热休克转录因子（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，
ＨＳＦ）无需激活，沙蚕体内所储备的维持正常生理功
能的 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 含量基本维持不变；当 Ｃｕ 胁迫
浓度接近或超过胁迫临界阈值时，ＨＳＦ 被激活形成
三聚体并转入细胞核内，与热休克元件（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ
ｅｌｅｍｅｎｔ， ＨＳＥ）结合，启动热休克基因的转录［３７］，
ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ转录水平随之出现明显增加．在应激
过程中，尽管诱导型 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ的合成会显著增
加，但其诱导水平随应激强度和持续时间长短而异，
且一般认为这种诱导表达是短期的［１１，３８］ ．本研究在
胁迫 １ ｄ时，ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ表达量急速上升至峰值，
之后表达量开始下降，３ ｄ 后表达量下降至胁迫前
水平．这种先升高后降低的变化趋势正是热休克蛋
白负反馈调控机制作用的结果，即胁迫前期大量表
达的 ＨＳＰ７０可增强细胞对损伤性刺激的耐受性，提
高细胞存活率，保护机体免受或少受损伤［３９］；胁迫
后期 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ表达量呈下降趋势，可能与获得
对胁迫的耐受力有关，此时胁迫已有所缓解，而且不
断增多的 ＨＳＰ 与 ＨＳＦ 结合并抑制 ＨＳＦ 的活性，从
而减少 ＨＳＦ与 ＨＳＥ的特异性结合，进而控制热休克
基因的转录［３７］，使 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表达量维持在一
定的水平．本研究虽然未对双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ 含量
进行检测，但 ＨＳＰ７０的合成主要在转录水平进行调
控［３８］，其含量变化是由 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 转录水平的
变化所决定，因此 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ相对表达量可以直
接且快速地反映 ＨＳＰ７０的合成及变化情况．
诱导型 ＨＳＰ７０基因没有内含子，可由未被隔断
的开放阅读框编码整个蛋白［３８］，而组成型 ＨＳＣ７０
基因的编码区一般含有几个内含子［５］ ．这种内含子
的缺失，使转录后的 ｍＲＮＡ 不需要经过剪切拼接等
加工过程，在应激状态下可优先转录和表达 ＨＳＰ７０，
６３６１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２７卷
及时发挥对机体（细胞）的保护作用［７，３０］ ．推测这可
能是诱导型 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 在应激初期表达量下降
不明显［７］，有的甚至检测到升高［６，４０］的原因．本研究
克隆获得的基因具有诱导型 ＨＳＰ７０ 基因的特征及
表达情形，说明该 ＨＳＰ７０基因为诱导型．
本研究表明，从双齿围沙蚕组织中克隆获得一
种编码热休克蛋白 ７０的 ｃＤＮＡ全长序列，氨基酸序
列分析表明该基因在翻译区不包含内含子，具有
ＨＳＰ７０家族的 ３个签名序列，与已知物种的 ＨＳＰ７０
同源性较高，主要存在于细胞质中；基因表达分析表
明，在 Ｃｕ胁迫过程中，双齿围沙蚕 ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ被
显著诱导表达，呈剂量效应和时间效应关系．说明本
研究克隆获得的序列为诱导型 ＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ．
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［１７］　 Ｔｏｍａｎｅｋ Ｌ， Ｓａｎｆｏｒｄ Ｅ． Ｈｅａｔ⁃ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ７０ （ＨＳＰ７０）
ａｓ ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ： Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆｉｅｌｄ
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ｐｅｎｓｅｒ ｂａｅｒｉｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｌｉａｎ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （大连
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ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α ａｓ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃ
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ｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＨＳＰ７０ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｉｌａ⁃
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ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｏｒ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２７ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔｈｙｐｏｘｉｃ ｒｅｏｘｙｇｅ⁃
ｎａｔｉｏｎ ｃａｎ ｐｒｏｔｅｃｔ ｆｒｏｍ ｄｅｌａｙｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ
Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ， ２００３， ８： ３３５－３４７
［４０］　 Ｓｕｎ ＰＭ， Ｌｉｕ ＹＴ， Ｚｈａｏ ＹＧ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｈｅａｒｔ ｄａｍａｇｅｓ ａｎｄ ＨＳＰｓ ｍＲＮＡ ｉｎ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｅａｔ
ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｂｒｏｉｌｅｒｓ． Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ， ２００７，
６： ２２７－２３３
作者简介　 张倩茹，女，１９７７ 年生，博士，副研究员． 主要从
事污染生态学和生态毒理学研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｈａｎｇｑｉａｎｒｕ＠ ｉａｅ．
ａｃ．ｃｎ
责任编辑　 肖　 红
张倩茹， 姜丽思， 牟文燕， 等． 双齿围沙蚕诱导型热休克蛋白 ７０基因的克隆及 Ｃｕ胁迫下的表达分析． 应用生态学报， ２０１６，
２７（５）： １６２８－１６３８
Ｚｈａｎｇ Ｑ⁃Ｒ， Ｊｉａｎｇ Ｌ⁃Ｓ， Ｍｕ Ｗ⁃Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ ｕｎｄｅｒ Ｃｕ２＋ ｓｔｒｅｓｓ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， ２０１６， ２７（５）： １６２８－１６３８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
８３６１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２７卷