全 文 ：·有效成分·
沙蚕纤溶酶的一种纯化方法
张伟云 ,陈 颢 ,汪水娟 ,夏仲豪 ,谭仁祥⒇
(南京大学生命科学学院 ,南京 210093)
摘 要: 目的 从双齿围沙蚕体内提取并纯化一种新的纤溶酶。 方法 应用硫酸铵沉淀、透析、凝胶柱层析
( Sephadex G-100)以及电泳等生化手段对沙蚕纤溶酶进行分离纯化。用平板法测定它降解纤维蛋白的活性。结果
得到纯的沙蚕纤溶酶 ,测出其等电点为 4. 5左右 ,由两条肽链组成 ,其相对分子量分别为 33 000 u和 14 400 u。结
论 该酶为首次从沙蚕中发现的一种新的纤溶酶。
关键词: 双齿围沙蚕 ;纤溶酶 ;分离纯化
中图分类号: R284. 1 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0673 02
Purification of fibrinolytic enzyme fromPerinereis aibuhitens is
ZHANG Wei-yun, C HEN Ying , WAN G Sh ui-juan, X IA Zhong-hao , TAN Ren-x iang
( Co lleg e o f Life Science, Nanjing Univ ersity , Nanjing Jiang su 210093, China)
Abstract: Object To ex t ract and puri fy a novel fibrino lytic enzyme from Perinereis aibuhitensis
Grube. Methods The enzyme w as precipi ta ted f rom the ex t ract by ammonium sulfate, dialy zed, chro-
ma tog raphed on Sephadex G-100 co lumn, and then purified by poly acry lamide gel elect rophoresis. It s fib-
rinoly tic activ ity was assessed w ith fibrin plate method. Results The puri fied enzyme showed an iso elec-
tric point ( PI) a round 4. 5 a s tested by gel isoelect ric focusing. It consisted of tw o polypeptide chains w ith
molecular weights around 33 000 u and 14 400 u, respectiv ely. Conclusion This w as a novel fibrinoly tic
enzyme discovered f rom P . aibuhitensis fo r the fi rst time.
Key words: Perinereis aibuhitensis Grube; fibrinoly tic enzyme; isola tion and puri fication
双齿围沙蚕 Perinereis aibuhitensis Grube是属
于多毛纲的环节动物 ,普遍分布于江苏省海岸潮间
带 ,主要栖息于泥砂滩的平均高潮线附近滩面。国内
外有关沙蚕的研究报道不多 ,目前国际上对沙蚕的
研究主要集中在日本。 日本学者从几种沙蚕中分离
出了多种具有生物活性的多肽 ,这些多肽的生物活
性主要表现在对环节动物的食管具有较强的收缩作
用 [1 ] ,有望开发为新型胃动力药。此外有少数文献报
道 ,从沙蚕体内纯化出一些蛋白质 [2, 3 ]。 本研究从双
齿围沙蚕体内提取一种能降解纤维蛋白的纤溶酶 ,
这在国内外尚未见报道。我们对沙蚕激酶进行了提
取 ,并对其粗提物的分离纯化作了初步探索 ,为沙蚕
的开发利用提供一定的实验基础。
1 仪器和试剂
RC-22E离心机 ( Hi tachi ) , Labconco 冷冻系
统 , U-3000型紫外可见分光光度计 ( Hi tachi) , PHS-
2C型精密酸度计 (上海雷磁仪器厂 ) , DYY-Ⅲ 5型
稳压稳流电泳仪 (北京六一仪器厂 )。
双齿围沙蚕 Perinereis aibuhitensis Grube产于
江苏如东 ,由本校孟文新副教授鉴定。牛纤维蛋白原
( Sigma) ,牛凝血酶 (中国药品生物制品检定所 ) ,
Sephadex G-100 ( Pharmacia ) ,十二烷基硫酸钠
( Serv a) ,标准分子量蛋白质 (上海丽珠东风生物技
术有限公司 ) ,载体两性电解质 (上海丽珠东风生物
技术有限公司 )。
2 实验方法
2. 1 平板法测纤维蛋白活性:在直径为 10. 5 cm平
皿里 ,加入 17 mL 0. 25% 纤维蛋白原溶液 ,再加入
0. 4 mL凝血酶溶液 ( 60 N IH /mL) ,快速摇匀 ,静置
30 min,凝结后平板基本透明无色。用微量进样器点
样 20μL,盖上玻盖 ,于 37℃保温 18 h后取出 ,用卡
尺测出溶圈垂直两直径 ,相乘得一积。
·673·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2000-10-26基金项目:国家海洋 863资助项目 ( 819-Q-16)作者简介: 张伟云 ( 1964-) ,女 ,江苏人 ,毕业于南京大学生命科学学院 ,获博士学位 ,现为南京大学医学院副教授 ,主要从事天然产物中生物大分子的研究。 Tel: 025-3593192
2. 2 提取:将活的双齿围沙蚕用清水泡洗数次 ,沥
干后称重 ,置 - 35℃备用 ,或直接用高速组织捣碎
机匀浆 ,加 2～ 5倍体积的预冷的 0. 02 mo l /L磷酸
盐缓冲液 ( PBS)进行提取 ,于 4℃静置 6 h以上。
8 000 r /min离心 15 min,收集上清液 ,再用提取液
洗一遍沉淀 ,离心 ,合并上清液。用硫酸铵分级沉淀 ,
取 20% ～ 70%饱和度的沉淀 ,以少量 0. 02 mol /L
PBS溶解 , 4℃透析脱盐。冷冻干燥 ,得粗酶品。
2. 3 柱层析:称取粗酶 50 mg ,溶解于 2 mL 0. 02
mol /L PBS中 ,加样于 Sephades G-100层析柱 ( 2. 6
cm× 100 cm ) ,以 0. 02 mo l /L PBS洗脱 ,流速约 16
m L /h。用部分收集器收集 ,每管约 4 mL, 280 nm紫
外检测 ,分别收集各个组分 ,透析 ,冻干 ,进行活性
测定。
2. 4 电泳制备: 以 10%聚丙烯酰胺凝胶制成垂直
平板 ,厚度为 3 mm,堆积胶浓度为 5% ,堆积胶浓度
为 5% 。称取由凝胶柱层析所得的活性成分 20 mg ,
溶解于 20%蔗糖溶液中 ,离心去沉淀 ,加样于制好
的平板上 ,加少许溴酚蓝于电极液中 ,以 150 V电压
进行电泳。当溴酚蓝接近底部时 ,停止电泳 ,取下胶 ,
从一侧切下一窄条 ,其余置 4℃冰箱保存。将切下的
部分于 1%考马斯亮蓝 R-250中染色 0. 5～ 1 h,快
速脱色。对照染色后显出的条带 ,在保留的胶上分别
切下对应位置的胶 ,置于试管中 ,捣碎。然后用 0. 01
mol /L NaCl浸泡抽提 , 4℃过夜。 离心 ,取上清液 ,
超滤脱盐。测各组分纤溶活性 ,将有活性的组分冷冻
干燥。
2. 5 等电聚焦:采用管式凝胶等电聚焦方法 [4 ]测定
样品的等电点。
2. 6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:用 12% SDS-聚丙
烯酰胺凝胶电泳测上述电泳制备的样品。 以低分子
量标准蛋白对照 ,其中含有兔磷酸化酶 B( 97 400)、
牛血清白蛋白 ( 66 200)、兔肌动蛋白 ( 43 000)、牛碳
酸酐酶 ( 31 000)、胰蛋白酶抑制剂 ( 20 100)、鸡蛋清
溶菌酶 ( 14 400)。标准品与样品同时电泳 ,以分子量
对数对迁移距离作标准曲线。
3 结果
3. 1 纯化: 粗酶品经过 Sephadex G-100柱层析分
离 ,在 280 nm处检测出有 4个吸收峰 ,如图 1所示。
由活性测定得知 ,第 2组分 ( G-Ⅱ )含活性成分 ,收
集此组分 ,透析 ,冷冻干燥。 凝胶柱层析得到的活性
组分 G-Ⅱ 经聚丙烯酰胺凝胶电泳制备 ,有 3条主
带 ,经抽提得到 3个组分 ,活性测定发现 ,第 2条带
的浸出液能溶解纤维蛋白。
图 1 Sephadex G-100分离纤溶酶粗品
的洗脱曲线
3. 2 等电点和相对分子量的测定:用管式凝胶等电
聚胶法对电泳制备的沙蚕激酶纯品进行等电聚胶 ,
结果显示 ,电泳制备的样品只有一条带 ,其等电点
PI约为 4. 5。用 SDS-聚丙烯酰凝胶电泳测定相对分
子量 ,以标准蛋白质的分子量对数对迁移距离作标
准曲线。 电泳制备样品经 SDS检测有两条带 ,对应
的相对分子量分别为 33 000 u和 14 400 u。
4 讨论
本文所报道的沙蚕纤溶酶是我们首次从我国丰
产的双齿围沙蚕体内发现的一种新的纤溶酶 ,对它
进行了分离纯化 ,初步发现它是一种酸性蛋白 ,并且
它是由两条肽链组成。由于它的结构和性质的复杂
性 ,有关沙蚕激酶的工作还有待于进行深入细致的
工作 ,进一步完善纯化工艺 ,提高产量 ,使之适应大
规模生产。双齿围沙蚕在我国资源十分丰富 ,但它们
的利用率很低 ,除了少数沙蚕出口日本用作钓饵外 ,
绝大多数未得到充分利用 ,处于自生自灭状态 ,造成
资源的严重浪费。进一步研究沙蚕纤溶酶并将其开
发为一种新的溶栓药物 ,将为我国的海洋资源的开
发及医药事业的发展作出一点贡献。
参考文献:
[ 1] Takah ashi T, Fu ru kaw a Y, M uneoka Y, et al . Isolation and
characteri zat ion of four nov er bioactive peptid es f rom a poly-
chaete an nelid , Perinereis vancau rica [ J ] . Comp Biochem
Ph ysiol Pharmacol Toxicol Endocrinol, 1995, 110 ( 3 ): 297-
304.
[ 2 ] Ebina S, Matsubara K, Nagayama K, et al . Carboh ydrate
gluing, an archi tectural mechanism in th e su pram olecular
s tructure of an annelid gian t h emog lobin [J ]. Proc Natl Acad
Sci , 1995, 92( 16): 7367-7371.
[ 3 ] Matsubara K, Yamaki M , Nagayama K, et al . Wh eat germ
agglutinin-reactiv e chains of giant hemoglobin f rom the poly-
chaete Perinereis aibuhitensi s [ J ] . Biochem Biophys Acta,
1996, 1290: 215-223.
[ 4 ] 张承圭 ,王传怀 ,袁玉荪 ,等 . 生物化学仪器分析及技术 [M ].
北京:高等教育出版社 , 1994.
·674· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2001年第 32卷第 8期