全 文 ：第 13卷第 2期
2 0 0 5年 4月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco-Agriculture
Vo1．13 No．2
Apri1， 2005
分子标记技术在杉木研究中的应用*
王晓丽 马祥庆
(西南林学院 昆明 650224) (福建农林大学林学 院 福州 350002)
摘 要 综述 了分子标记技术在 杉木种质资源鉴定、群体 遗传多样性研 究、遗传连 锁 图谱构建和 数量性状位 点
(QTL)定位及分子标记辅助选择育种等方面的应用进展 ，指 出目前该 方面研 究存在 的问题，并展望 了分子标记技
术在杉木研究中的应用前景。
关键词 分子标记 杉木 应用
Application of molecular genetic maker techniques in Chinese fir research．WANG Xiao-Li(Southwest Forestry Colege，
Kunming 650224，China)，MA Xiang—Qing(Colege of Forestry，Fujian Agricultural and Forestry University，Fuzhou
350002，China)，CJEA，2005，13(2)：39～42
Abstract The application of molecular marker techniques in Chinese fir is stated，i．e．the identification of genetic re—
source，genetic diversity research of populations，construction of genetic linkage maps，loci mapping of quantitative trait and
marker-assisted selection．The problems in current research are discussed and the application trends of molecular genetic
marker techniques in Chinese fir research are put forward．
Key words Molecular marker，Chinese fir，Application
(Received Nov．26，2003；revised Dec．31，2003)
分子标记是以 DNA多态性为基础的遗传标记 ，是 DNA水平上遗传变异 的直接反映。20世纪 70年代
Grodzicker等首创 DNA限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术 ，开创了
应用分子标记作为遗传标记的新阶段 ，并开始应用于植物遗传育种的研究。随着 PCR(Polymerase chain re—
action)技术的发展 ，又产生各种新型的分子标记。目前应用最普遍的 DNA分子标记技术 主要有 RFLP、
RAPD(Random amplified polymorphic DNA)和 AFLP(Amplified fragment length polymorphism)等，分子标
记技术的发展使林木分子遗传学的应用范围更广 ，并成功应用于林木遗传多样性检测 、基因定位 、品质鉴
定、遗传图谱构建和系统学研究等诸多领域。杉木是我国南方特有的重要用材树种 ，众多学者已对杉木遗
传改 良进行了系统研究_1 J，但从分子水平研究杉木目前 尚少见报道。本文综述 了近年来分子标记技术在杉
木研究中的应用进展及存在的问题 ，并展望了分子标记技术在杉木研究中的应用前景。
1 杉木种质资源鉴定及群体遗传多样性研究
林木个体基因型高度杂合，存在着大量的多态性 ，传统分类方法很难对其进行准确的分析和鉴定 ，从而
限制 了林木种质资源的获得 、保护和充分利用。随着分子标记技术 的发展 ，尤其是 RAPD分子标记技术的
产生和发展为林木品种(系)的鉴定提供 了简易、快速且有效的手段。杉木具有萌芽性强 、易于无性系繁殖
的特点，长期以来许多杉木栽培区用杉木无性系苗造林 ，而杉木无性 系苗造林配置中由于存在不 同无性系
形态相似的特点，造成有时无法从形态上进行无性系个体识别；同时由于各杉木产区之间开展科研合作及
种子调拨，相互引入其他省的优良杉木并各 自命名，造成杉木优 良无性系来源不清且管理混乱 ，因此进行杉
木无性系鉴别更为迫切。黄发新_2 等用 RAPD分子标记技术进行杉木无性系识别研究表明，运用 8个引物
的17个分子标记可对40个杉木无性系中的 38个无性系进行识别，说明杉木遗传资源变异幅度较大，这为
今后进一步利用分子标记技术进行杉木无性系识别和品系管理奠定了基础 ，加快 了杉木遗传改 良的进程。
为探讨杂种起源，尤勇 利用 RAPD分子标记技术鉴定杉木与侧柏类杂交后代，认定父本侧柏的花粉并未
*国家 自然科学基金项 目(30000132)和福建省 自然科学基金项 目(B0110023)资助
**通讯作者
收稿日期 ：2003—1卜26 改回日期 ：2003—12—31
中 国 生 态 农 业 学 报 第 13卷
参与受精过程，其杂种形成是由于杉木花粉的污染所致。由于杉木杂合度高，杂种鉴定对杉木基因资源收
集 、保存尤为重要。尤勇[ 以杉木总 DNA为模板标记探针 ，首次构建了杉木基因组文库，且从基因组文库
中筛选的单拷贝探针 SP1和 SP2可准确区分杉木种源，为杉木种源的鉴定提供了准确的方法。
遗传多样性是表示群体内遗传结构的信息参数之一，为一定基因库内每个基因位上等位基因数目和频
率的函数[1 6l，在群体遗传学上又称为基因多样性。分子标记技术的发展 ，使准确评价林木群体遗传结构和
遗传变异成为可能。由于地理生殖隔离、长期 自然和人工选择的结果 ，使不 同种源杉木 的形态、生理和生态
学等特性不同，尤其在杉木生长量、光合特性与抗性方面表现出显著差异l-4 J。近年来有关学者开始用分
子标记技术研究杉木种源的遗传多样性。尤勇等[ ]利用 23个不同随机引物对杉木 7个种源的 DNA序列
多态性分析研究结果表明，杉木种源间遗传 多态性水平较高，在被检测的 114个 RAPD位点 中多态位点 占
79．8％，并根据种源间遗传相似度而构建的聚类 图得知 ，分布于南岭 山脉西部周 围的 4个种源相对聚在一
起。陈由强等[ ]从 80个随机引物中筛选出 20个引物对 12个有代表性的杉木地理种源遗传多样性进行分
析研究 ，共扩增 出 149个 DNA片段，其中具多态性的片段有 115个 ，占77．18％，表明杉木地理种源间具有
丰富的 DNA序列多态性，12个杉木地理种源间遗传距离变幅为 0．1932～0．4667。以 RAPD分子标记技术
研究分析杉木地理种源间的遗传多态性特征 ，进一步了解生物基因组水平变异特征与生态地理因素之间的
关系，可为林木保护和遗传育种提供重要信息。同时也应注意到运用 RAPD分子标记技术虽可揭示各杉木
地理种源间的遗传多样性，但对确定杉木起源中心的研究尚有局限性 ，无法确定杉木地理种源的真实来源。
故在今后的研究中尚待寻找和利用新出现的分子标记技术，并综合利用各种分子标记技术进一步提高标记
的多态性，以便更全面掌握杉木地理种源遗传变异规律及其 内在原因，为合理利用 、保护杉木基因资源及其
遗传改良提供科学依据，并在杉木 良种选育、适地适树和提高林分生产力等方面发挥其重要作用。鉴于分
子标记技术是解决杉木分类较模糊、有争议问题的有效方法，尤勇L1 o_利用 RAPD分子标记技术对林木有争
议的“种”——德昌杉木进行分类研究 ，选用 40个随机引物在杉木和德昌杉木中获得 182个位点 ，其 中多态
位点 98个，遗传相似系数为 0．644198，略低于杉木 7个地理种源之间的平均遗传相似系数(0．688)，据此认
为德昌杉木不能划分为 1个新种，只能视其为杉木特殊种源之一。这表明分子标记技术可为 DNA水平验
证、林木分类及类群的正确划分提供科学依据，并将对林木分类学的发展产生深远的影响。
2 杉木遗传图谱构建与数量性状位点定位研究
遗传图谱构建是当前生物学研究领域 的热点之一，遗传图谱是对基因组进行系统研究 的基础，可利用
它进行数量性状基因位点的研究、生物体主要性状的早期测定以及快速有效地定位和克隆 目的基因。遗传
连锁图谱是以遗传标记(已知性状的基因或特定 DNA序列)间重组频率为基础的 1条染色体或基因组内位
点的相对位置线性排列图。构建理想遗传图谱的关键之一是选择合适的遗传标记 ，在 DNA标记 出现以前
主要以同功酶和部分形态标记进行图谱构建。随着分子标记技术的发展 ，各种分子标记技术在遗传图谱构
建中被广泛应用。由于林木 自身生物学特性的限制(基因组较大 、世代周期长、杂合度高且缺少 2个世代以
上谱系清楚的材料等)，使得林木遗传图谱构建存在诸多限制因子，故林木遗传改良中利用分子标记技术构
建遗传图谱 比其在农作物的研究中应用晚十几年 ，林木遗传图谱构建的研究虽开展时间较短，但其研究进
展非常迅速 ，目前国内外 已构建图谱的树种有云杉 、湿地松 、火炬松、马尾松 、杉木、桉树 、杨树和银杏等几十
种 。何祯样等l_I1 j利用具有特殊类型的杉木无性系 J0和 F 作为亲本杂交形成的 F1群体 为作 图群体 ，以
杉木叶为提取基因组 DNA的材料，从 1040个随机引物中筛选出 78个引物，对 78个 F 群体及双亲样本进
行 DNA扩增 ，共获得 129个 RAPD标记 ，首次构建了杉木分子遗传连锁框架 图，其中 J 亲本包含 8个连锁
群，其标记覆盖的基因组总长度约为 595．2cm，F， 亲本包含 4个连锁群 ，其标记覆盖的基因组总长度约为
315．3cm，129个 RAPD标记中偏分离标记占 14．7％，但该研究中所获得的连锁标记较少，有 94个标记未被
连锁到任一连锁群上，故其仅构建了 1个遗传连锁框架 图，而并未与染色体相对应，离实用阶段尚有一定距
离。因此在今后的研究中应增加标记数 目，使连锁标记增多，使不连锁标记逐步定位到连锁群上；并需通过
AFLP、RFLP等其他标记技术继续补充标记，提高标记的多态性和稳定性及其作图效率。此外针叶树胚乳
是 1种天然的优 良作图材料 ，胚乳仅有 1个染色体组且来源于母体 ，不受外源花粉的干扰 ，任何单株树种子
胚乳均可用于作图研究，故针叶树研究中可利用单株树种子大配子体进行遗传作图。杉木作为 1种针叶树
种 ，今后也可尝试利用大配子体作图，以补充原有遗传连锁框架图。
第 2期 王晓丽等 ：分子标记技术在杉木研究 中的应用 4l
数量性状点定位(Quantitative trait loci，(aTL)即采用类似单基因定位方法将数量性状定位在遗传图谱
上 ，确定其数量性状与遗传标记间的距离(以重组率表示)¨ 。随着分子标记技术的发展 ，已有多种 DNA分
子标记应用于数量性状点定位，目前主要有 RFLP、AFLP、RAPD、Microsatelite、SSR (Simple sequence re—
peats)等分子标记技术。大多数林木的许多重要性状表现为连续变异的数量性状 ，由多基因控制且易受环
境影响。近年来在林木数量性状点定位的研究中，利用遗传图谱为工具和tt益完善的数量性状点定位分析
方法已取得较大进展 ，但在杉木的研究 中应用较晚且相对较少。何祯祥等 在构建杉木遗传连锁框架图基
础上运用 RAPD分子标记技术 ，采用 ANOVA方法对杉木树高、胸径和材积等生长性状相关联的分子标记
进行检测 ，单标记分析检测出与树高生长相关联的分子标记有 3个，与胸径相关联的有 5个 ，与材积相关联
的有 2个 ，其累积贡献率分别为 15．8％、24．36％和 10．63％；双标记分析共检测出 286对标记组合，其中与
杉木生长性状紧密关联的树高有 96对 ，胸径 94对 ，材积 96对，与杉木生长性状相关的标记互作效应十分显
著 ，研究表明杉木树高、胸径和材积等生长性状可能受多个基因控制，但未发现主效基因。对作物以及作为
林木模式树种杨树的数量性状点定位虽可把控制 1个复杂性状的多个数量性状点分解开来并确定每个数量
性状点的贡献大小以及多个数量性状点(QTLs)间的相互关系，但就杉木而言其数量性状点定位的研究则刚
刚起步 ，何祯祥等的研究是对与杉木生长性状相关联 的分子标记初步探索 ，进一步开展数量性状点精细定
位研究还有赖于高密度遗传连锁图谱的构建以及更有效的统计方法提出。同时有关杉木抗病虫、营养等其
他性状研究尚有待于深入到分子水平 ，利用数量性状点定位弄清控制数量性状的基因及其行为，并在一些
重要基因附近找到紧密连锁的标记，直接用分子标记辅助进行育种策略制定和 目标性状早期选择，对杉木
遗传改良具有重要意义。
3 杉木分子标记辅助选择育种
分子标记辅助选择(Marker—assisted selection)育种是利用与 目标性状紧密连锁的分子标记对 目标性状
进行跟踪选择的 1项育种技术，是基因组研究在常规育种和杂交育种 中的直接应用。分子标记辅助选择育
种使选择直接基于 DNA水平上，并提高其可靠性 ，克服了林木世代长的局限性 ，加速了林木育种进程。分
子标记辅助选择育种的应用使杉木遗传改 良的研究有望获得集多种优 良性状于一体 的优 良品系。李梅
等 l j利用 RAPD分子标记技术研究了杉木第 2代育种群体内 30个杂交亲本和第 3代育种群体内 182个个
体遗传变异，并结合第 2代育种群体内 30个杂交亲本部分双列杂交子代的生长表现，研究亲本 间遗传变异
与子代生长的相关关系结果表明 ，杉木第 2代育种群体内 30个杂交亲本间遗传变异较大 ，多态位点比例达
66．9％，在遗传距离 0．4800处可将 30个亲本分成 6组；杉木第 3代育种群体内 182个个体间多态位点比例
达 78．78％，在遗传距离为 0．5270处将 182个个体归为 5个亚群体，亲本间遗传距离与子代生长相关显著 ，
表明按遗传距离分组的组间亲本之间分子遗传变异对亲本选配有一定参考作用。这不仅阐明了利用分子
标记进行杉木杂交亲本选配的可行性 ，且对杉木育种群体经营和育种策略的制定有重要作用。随着更加有
效的分子标记技术产生、发展和完善，分子标记辅助选择育种的研究将逐步拓展，必将极大地提高杉木育种
目的性和精确性及其遗传改 良效率 ，分子标记辅助选择育种在杉木遗传改 良的研究中具有广阔应用前景。
4 存在的问题与前景展望
综上所述 ，分子标记技术在杉木种质资源鉴定、群体遗传多样性分析、遗传图谱构建 、数量性状位点定
位及分子标记辅助育种等研究 中已取得较大进展，但相对于分子标记技术在农作物中的研究而言，分子标
记技术在杉木研究中的应用尚为起步阶段。 目前该方面研究存在的主要问题一是该研究中尚需等待材料 ，
尤其是遗传图谱构建和重要数量性状定位研究所需材料缺乏 ，其原因一方面是长期 以来育种学家和林业工
作者在传统思维模式指导下产生的现有材料很多时候无法满足遗传图谱构建和 QTLs研究 的需要 ，另一方
面由于林木世代周期长 ，短期内无法获得如农作物的高世代群体，这在一定程度上 限制了其研究进程。为
此林业工作者应有意识地从长远角度考虑尽快培育一些可用于该方面研究的群体材料；同时有赖于新型分
子标记技术的产生和发展 ，使该方面研究尽 可能地利用现有材料。二是该研究 中所用分子标记技术较单
一
，多采用 RAPD分子标记技术，而 RAPD分子标记技术虽以其简易 、快速、经济且有效特点而获得广泛应
用，但其本身又有一定局限性 ，首先是重现性和稳定性较差 ，陈由强等 认为为获得稳定实验结果，该研究
要尽可能地保持条件恒定 ，使用相同的 PCR仪和引物等。但笔者认为这在实际操作中很难实现，若某种实
验方法不能在不同实验室进行广泛交流和重现，那么它则难以成为完全成熟的技术方法 ，故 RAPD分子标
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记技术的准确性和可靠性尚有待于进一步提高。其次 RAPD为显性标记，无法区分杂合型与纯合型 ，因此
单用 RAPD 1种方法进行标记研究 ，在很多遗传分析方面会受到限制 ，且所获得的遗传信息也不全面。因此
必须与其他分子标记技术相配合 ，综合利用各种分子标记技术乃是今后该研究的发展趋势。三是该研究 目
前尚处于理论阶段，离实用阶段仍有一定距离。由于缺乏对林木经典遗传学和细胞学等方面的研究 ，已构
建的杉木遗传连锁图谱并未与染色体相对应 ，因此离遗传连锁图谱应用尚有一定距离。故今后杉木研究 中
首先应加强遗传基础学科的研究 ，使杉木遗传图谱的研究尽快从理论阶段进入实用阶段 ，为后续的 目的基
因克隆、探针制备和转基因研究奠定基础。其次随着杉木研究的深入和分子标记技术的发展，今后应加强
综合利用各种分子标记技术继续补充遗传图谱，使之达到较高饱和度，同时应利用遗传 图谱上 的分子标记
进行数量性状基因定位，为进一步开展数量性状位点精细定位和数量性状位点克隆分离打下基础；再次应
开展杉木属类群系统进化方面的研究，分析类群间亲缘关系以指导育种 ，并对育种过程 中近交衰退进行有
效监测 ，积极开展分子标记辅助选择育种，使杉木遗传改 良研究产生新的飞跃。
参 考 文 献
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